基于荧光定量的牦牛应激型hspa2基因表达谱建立的制作方法
【专利摘要】基于荧光定量的牦牛应激型HSPA2基因表达谱建立本发明公开了一种牦牛应激型HSPA2基因组织表达分布的SYBRGreenI荧光定量PCR检测方法。该方法包括如下步骤：（1）牦牛各组织RNA的提取及cDNA合成；（2）引物设计；（3）标准曲线的建立；（4）荧光定量PCR方法的优化和建立；（5）采用建立好的方法检测牦牛应激型HSPA2基因在各组织的表达分布；（6）采用相对定量的2–△△CT法进行数据分析，计算出HSPA2基因各组织的相对表达量,构建组织表达谱。本发明采用的SYBRGreenI荧光定量方法避免了设计、标记荧光探针和价格昂贵等问题，并且该方法检测灵敏度高，特异性强，重复性好，PCR反应结束后，可立即观察结果，不需要电泳、染色等操作，因此比采用其它方法来建立组织表达谱适用性更强。
【专利说明】基于荧光定量的牦牛应激型HSPA2基因表达谱建立
【技术领域】
[0001]本发明属于一种生物【技术领域】，具体涉及一种检测牦牛应激型HSPA2基因组织表达分布的SYBR Green I荧光定量PCR方法及对应的组织表达谱的建立。该方法避免了设计、标记荧光探针和价格昂贵等问题，并且该方法检测灵敏度高，特异性强，重复性好，因此比采用其它方法来建立组织表达谱适用性更强。
【背景技术】
[0002]热休克蛋白(Heat Shock Protiens, HSPs),也叫热激蛋白，广泛分布于真核生物和原核生物中，外界各种各样的应激源(比如高温、低温、缺氧、重金属等)能够诱导热休克蛋白的产生，从而使生物体免受应激因素的损害。HSP70家族是热休克蛋白家族中最重要的一员，同时也是生物体内高度保守的蛋白质家族之一。该家族成员众多，其中最常见的可以分为两类，一类是应激型的HSP70 ;另一类是结构型的HSC70(Heat Shock Cognate，热应激同源蛋白70)，前者在正常细胞内表达量较低或者不表达，但是在热应激或者其他应激源的作用下，表达量迅速增加；后者在正常细胞内均有不同程度的表达，受到外界环境应激因素的影响表达量有不同程度的上升，应激型HSP70已成为现阶段研究的热点之一。HSP70对维持细胞内稳态，改善细胞的生存能力和减轻有害应激损伤有非常重要作用。
[0003]HSP70在应激状态下帮助需要的蛋白质正确折叠，加快正常蛋白质合成的恢复；在细胞保护方面，HSP70表达的增加可以缓解细胞所受伤害，增强机体对应激的抵抗力；同时，HSP70在抗细胞凋亡、抗氧化和免疫反应中也起着重要作用。HSPA2是HSP70应激型中的一主要类型，对其的研究能够更好地理解HSP70应激型在环境适应中的功能性。牦牛是生活在高原环境下的特有物种，与高原人民的生活息息相关。为了加强牦牛资源的保护和开发利用，以牦牛作为高原模式动物，应激型HSPA2基因在牦牛各组织的表达谱的建立有助于更好地了解应激型HSPA2基因在各组织的作用机理，有助于保护牦牛免受高原恶劣环境应激因素的影响，使其能够更加顺利地生产与繁殖。
[0004]目前关于牦牛应激型HSPA2基因组织表达谱建立还尚未见报告，本发明旨在建立一种基于SYBR Green I荧光定量方法的牦牛应激型HSPA2基因组织表达谱，该表达谱的建立为进一步研究HSPA2基因在牦牛的环境的适应性上提供基础。
【发明内容】
[0005]本发明旨在建立一种基于SYBR Green I荧光定量方法的牦牛应激型HSPA2基因组织表达谱的建立。该定量方法具有操作简便，检测灵敏度高，重复性好，污染少，PCR反应结束后，可立即观察结果，不需要电泳、染色等操作等优点，因此比采用其它方法来建立组织表达谱适用性更强。
[0006]本发明的技术方案是通过如下步骤来实现的:
1、牦牛各组织RNA的提取
分别提取3头公牦牛11种组织(心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、肌肉、胃、睾丸、脑)，3头母牦牛12种组织(心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、肌肉、胃、卵巢、乳腺、脑)样品，称量约Ig后迅速转移至液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，期间不断加入液氮，直至研磨成粉末状。加入I mL的Trizol，室温静置直至样品完全融化，吸取I mL至无RNA酶的离心管中，加入200 μ L的氯仿，剧烈振荡，室温静置5 min0 4 °C >12000 r/min离心15 min，小心吸取500μ L上清液,加入等体积的异丙醇,颠倒混匀，室温静置10 min。4 °C >12000 r/min离心10min,弃上清,沉淀加入I mL 75 %的乙醇洗漆,4 °C >12000 r/min离心5 min,弃上清,室温干燥沉淀，以30 μ L DEPC水溶解RNA。
[0007]2、cDNA的反转录合成
按照 Fermentas 公司的 RevertAid? First Strand cDNA Synthesis Kit 反转录酶说明书，米用 20 “1^体系:01丨80 dT18、l μ L, 5XReaction B μ ffer>4 μ L, Ribolock?Rnase Inhibitor (20 μ/μ1)、1 μ L, 10 mM dNTP Mix、2 μ L, RevertAid?M~M μ LV ReverseTranscriptase (200 μ/μ I)、I μ?,模板 I μ L,最后用 RNase Free dH20 补足 20 yL,按以下程序进行反转录反应:42 °C>60 min ；70 °C、5 min。
[0008]3、引物设计
根据GenBank中登陆的牛HSPA2 (登录号为NM_174344)、内参β-actin (登录号为NM_173979)基因序列各设计一对特异性引物。引物序列如下:
HSPA2:上游引物 5’ - GATTTCTACACTTCCATCACCC -3’ ;
HSPA2:下游引物 5’ - CTGACTTGTCCCCAATGAGA -3’ ;
β -actin:上游引物 5’ -ACATCCGCAAGGACCTCTAC-3;
β -actin:下游引物 5’ -GCCAATCTCATCTCGTTTTC-3’。
[0009]预计扩增长度分别为155bp、170bp。
[0010]4、标准曲线的建立。
[0011](I)以25 μ L的PCR反应体系:PCR Mix 12.5 yL，上、下游引物各I yL，模板Iμ L, dH20 9.5 μ L ;扩增程序为:94 °C预变性 5 min, 94 °C变性 30 s，60 °C退火 30 s，72°C延伸25 s，36个循环，最后72 °C延伸10 min ;分别将HSPA2和β-actin进行PCR扩增，反应结束后，取PCR产物进行体积分数10g/L的琼脂糖凝胶电泳，观察结果并回收、纯化产物。
[0012](2)将回收、纯化的产物与克隆载体pMD19-T进行连接，转化DH5a感受态细胞并在Amp+琼脂平板上涂菌，挑取单个菌落接种于含Amp+的LB液体培养基中。经PCR鉴定后，将阳性重组质粒送往Invitrogen (英潍捷基上海)公司进行测序。
[0013](3)提取经过测序鉴定正确的重组质粒，应用紫外分光光度计测定重组质粒浓度，计算出基因拷贝数，将重组质粒进行10倍梯度稀释，将其作为标准质粒模板。
[0014](4)取标准质粒模板，构建反应体系，进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增，获得扩增标准曲线。
[0015]5、荧光定量PCR检测方法的优化和建立
(I)引物特异性实验:选用一头公牦牛的脑组织cDNA为模板进行荧光定量PCR，进行3次重复，并设置以dH20为模板的阴性对照，检验设计引物的特异性。
[0016](2)荧光定量PCR反应条件的优化:对荧光定量PCR的循环条件进行了两步法和三步法的摸索，并将退火温度从56 °C依次递增至60 °C，每次递增I °C，对退火温度进行优化。
[0017]6、采用建立好的方法检测牦牛应激型HSPA2基因在各组织的表达分布
(I)反应体系为 20 μ L:SYBR Premix Ex Taq?II 10 μ L，上、下游引物各 0.8 μ L,|l板 2 μ L, dH20 6.4 μ L。
[0018](2)扩增程序为:95 °C预变性30 s，95 °C变性5 s，60 °C退火30 s，72 °C延伸20s，39个循环，添加一个溶解曲线，设置以dH20为模板的阴性对照，每个组织进行3次重复。[0019]7、采用相对定量的2 _ 法进行数据分析，计算出HSPA2基因各组织的相对表达量，基于表达量构建HSPA2基因组织表达谱。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为HSPA2荧光定量PCR标准曲线。
[0021]图2为β-actin荧光定量PCR标准曲线。
[0022]图3为引物特异性实验溶解曲线，β -actin融解温度为Tm=82.5 V ±0.5 °C，HSPA2 融解温度为 Tm=89.5 °C ±0.5 °C。
[0023]图4为HSPA2的扩增曲线。
[0024]图5为β -actin的扩增曲线。
[0025]图6为公、母牦牛HSPA2基因各组织的表达谱。
【具体实施方式】
[0026]为了使本发明的技术方案更加清楚明白，下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0027]实施例:
(I)牦牛各组织RNA的提取
分别提取3头公牦牛11种组织(心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、肌肉、胃、睾丸、脑)，3头母牦牛12种组织(心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、肌肉、胃、卵巢、乳腺、脑)样品，称量约Ig后迅速转移至液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，期间不断加入液氮，直至研磨成粉末状。加入I mL的Trizol，室温静置直至样品完全融化，吸取I mL至无RNA酶的离心管中，加入200 μ L的氯仿,剧烈振荡,室温静置5 min。4 °C >12000 r/min离心15 min,小心吸取500 μ L上清液，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10 min。4 °C>12000 r/min离心10 min,弃上清,沉淀加入I mL 75 %的乙醇洗漆,4 °C > 12000 r/min离心5 min,弃上清，室温干燥沉淀，以30 μ L DEPC水溶解RNA。
[0028](2) cDNA的反转录合成
按照 Fermentas 公司的 RevertAid? First Strand cDNA Synthesis Kit 反转录酶说明书，按以下程序进行反转录反应:42 °C>60 min ；70 °C、5 min.,反应体系为:oligo dT18I μ L ；
5 X Reaction B μ ffer4 μ L ；
Ribolock? Rnase Inhibitor(20 μ / μ I)I μ L ；
10mM dNTP Mix2 μ L ；
RevertAid?M~Mμ LV Reverse Transcriptase (200 μ / μ I)I μ L ；模板I μ L ;
RNase Free dH2010 μ L。
[0029](3)引物设计
根据GenBank中登陆的牛HSPA2 (登录号为NM_174344)、内参β -actin (登录号为NM_173979)基因序列各设计一对特异性引物，引物由上海Invitrogen (英潍捷基)公司合成。引物序列如下:
HSPA2:上游引物 5’ - GATTTCTACACTTCCATCACCC -3’ ；
HSPA2:下游引物 5’ - CTGACTTGTCCCCAATGAGA -3’ ；
β -actin:上游引物 5’ -ACATCCGCAAGGACCTCTAC-3 ；
β -actin:下游引物 5’ -GCCAATCTCATCTCGTTTTC-3’ ；
预计扩增长度分别为155bp、170bp。
[0030]( 4 )标准曲线的建立
①以25 μ L的PCR反应体系，扩增程序为:94 °C预变性5 min, 94 °C变性30 S，60°C退火30 s，72 °C延伸25 s，36个循环，最后72 °C延伸10 min ;分别将HSPA2和β-actin进行PCR扩增，反应结束后，取PCR产物进行体积分数10g/L的琼脂糖凝胶电泳，观察结果并回收、纯化产物，反应体系为:
PCR Mix12.5 μ L ；
上、下游引物(各)I yL;
模板I μ L ;
dH209.5 μ L。
[0031]②将回收、纯化的产物与克隆载体pMD19_T进行连接过夜，连接后的产物直接用于转化。
[0032]③冰上溶解50 μ L DH5 α感受态细胞，加入10 μ L连接产物，冰浴30 min,然后42.5°C水浴锅热激90s，再冰浴15 min,加入940 μ L不含抗生素的LB液体培养基，37°C、200rpm振荡培养lh。将摇好的菌4000rpm离心2 min,弃600 μ L上清液,重悬沉淀,在Amp+琼脂平板上涂菌，37°C培养14-16h。
[0033]④挑取单个菌落接种于含Amp+的LB液体培养基中。经PCR鉴定后，将阳性重组质粒送往Invitrogen (英潍捷基上海)公司进行测序。
[0034]⑤提取经过测序鉴定正确的重组质粒，应用紫外分光光度计测定重组质粒浓度，计算出基因拷贝数，将重组质粒进行10倍梯度稀释，将其作为标准质粒模板。
[0035]⑥取标准质粒模板，构建反应体系，进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增，获得扩增标准曲线。
[0036](5)荧光定量PCR检测方法的 优化和建立
①引物特异性实验:选用一头公牦牛的脑组织cDNA为模板进行荧光定量PCR，进行3次重复，并设置以dH20为模板的阴性对照，检验设计引物的特异性。由图2分析可知:β -actin在溶解温度为Tm=82 V ±0.5 °C、HSPA2在溶解温度为Tm=89.5 V ±0.5 °C时出现单一的特异性峰，表明该引物、该反应特异性良好。
[0037]②荧光定量PCR反应条件的优化:对荧光定量PCR的循环条件进行了两步法和三步法的摸索，并将退火温度从56 °C依次递增至60 °C，每次递增I °C，对退火温度进行优化。
[0038](6)采用建立好的方法检测牦牛应激型HSPA2基因在各组织的表达分布。
[0039]扩增程序为:95 °C预变性30 s，95 °C变性5 s，60 °C退火30 s，72 °C延伸20 s，39个循环，添加一个溶解曲线，设置以dH20为模板的阴性对照，每个组织进行3次重复。反应体系为:
SYBR Premix Ex Taq?II10 μ L ；
上、下游引物(各)0.8 UL；
模板2 μ L ;
dH206.4 μ L0
[0040](7)采用相对定量的2_ 法进行数据分析，计算出HSPAlA基因各组织的相对表达量，构建组织表达谱。
【权利要求】
1.一种检测牦牛应激型HSPA2基因组织表达分布的SYBR Green I荧光定量PCR方法及基因组织表达谱的建立，其特征在于根据牛HSPA2、β -actin基因序列设计特异性检测引物，利用Real-time技术对HSPlA基因在不同组织中的表达量进行定量分析。
2.如权利I所述根据牛HSPA2、β-actin基因序列设计特异性检测引物，所设计引物如下:
HSPA2S: 5’ - GATTTCTACACTTCCATCACCC-3’ ;
HSPA2A: 5’ - CTGACTTGTCCCCAATGAGA-3’ ;
β -actin-S: 5’ -ACATCCGCAAGGACCTCTAC-3’ ;
β -actin-A 5’ -GCCAATCTCATCTCGTTTTC-3’。
3.如权利I所述HSPA2基因组织表达谱的建立，其特征在于对公牦牛11种组织样品(心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、肌肉、胃、睾丸、脑)，母牦牛12种组织样品(心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、肌肉、胃 、卵巢、乳腺、脑)进行基因相对定量分析，构建组织表达谱。
【文档编号】C12Q1/68GK103667472SQ201310646305
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月6日 优先权日:2013年12月6日
【发明者】兰道亮, 李键, 王树茂, 陈亚冰 申请人:西南民族大学