一株华癸中间根瘤菌及其用途
【专利摘要】本发明公开了一株华癸中间根瘤菌及其用途。本发明的华癸中间根瘤菌是华癸中间根瘤菌（Mesorhizobium?huakuii）Z-14，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC?No.7973。试验证明华癸中间根瘤菌（Mesorhizobium?huakuii）Z-14CGMCC?No.7973可促进宁波大桥种、奉化种、闵紫6号或余江大叶这四种紫云英的生长，对紫云英具有显著的增产效果，具有较高的实用性和可推广性，有望发展成为华癸中间根瘤菌应用领域中一项新的优良组合技术。本发明在紫云英种植业中具有广阔的应用前景。
【专利说明】一株华癸中间根瘤菌及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株华癸中间根瘤菌及其用途。
【背景技术】 [0002]紫云英(又名红花草)是一种优质的绿肥作物，我国最重要的绿肥作物，是世界上紫云英的起源地。我国紫云英的主要栽培区域为长江中下游及南方各省区，在苏北、豫中及陕南也有种植。近年来随着全国“沃土计划”的开展，紫云英绿肥的种植面积不断回升。作为绿肥作物的紫云英同时也是豆科作物，豆科根瘤菌的研究和应用已有一百多年历史，几乎在全世界范围内都提倡对豆科作物进行根瘤菌接种。紫云英与华癸中间根瘤菌形成共生固氮体系，可提高紫云英的成苗率、幼苗结瘤率，增强共生固氮作用，从而提高紫云英的产草量，增加生物有机肥源，改良、培肥土壤，净化环境，保持生态平衡有着重要的作用。目前，接种华癸中间根瘤菌仍是提高鲜草产量的重要技术措施。如能够得到高效增加紫云英产量的菌株将有效提高紫云英产量。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一株可显著增加紫云英植株重量和植株高度的华癸中间根瘤菌。
[0004]本发明所提供的华癸中间根瘤菌是华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)Z-14，该菌株已于2013年07月31日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.7973。
[0005]华癸中间根瘤菌(Mesorhizobiumhuakuii) Z-14CGMCC N0.7973 属革兰氏染色阴性，杆菌，无芽孢，具端生鞭毛或周生鞭毛，能运动。菌体大小为(0.5-0.9) X (1.0-3.0)微米，在不同环境中生长的菌体形态各异。在培养条件下，该菌呈小的短杆状，菌体染色不均匀，形成着色与不着色部分的环状体，不着色的部分脂类含量较高。在酵母汁甘露醇琼脂培养基平面上生长，菌落呈圆形，边缘整齐，稍突起，无色半透明或浅乳白色，菌苔较浓。石蕊牛奶不产酸；可以利用D-阿拉伯糖、乳糖、纤维二塘、D-半乳糖、果糖、D-甘露糖、D-核糖；氯化铵和硝酸盐可作为氮源；利用蛋白胨能力差；不水解酪素。
[0006]以华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)Z_14为活性成分的促进紫云英生长的菌剂也属于本发明的保护范围。
[0007]所述促进紫云英生长的菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿物材料、生物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为草炭、粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述生物材料为各类作物的秸杆、松壳、稻草、花生壳、玉米粉、豆粉、淀粉、草炭和动物的粪便中的至少一种；所述高分子化合物为聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂为癸烷和/或十二烷。所述菌剂中，所述活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
[0008]所述促进紫云英生长的菌剂具体可为提高紫云英单株重量和/或提高紫云英株高。所述紫云英单株重量是指紫云英单株的地上部分重量。
[0009]本发明还提供了利用华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)Z_14栽培紫云英的方法。
[0010]本发明所提供的栽培紫云英的方法，包括将紫云英种子用所述促进紫云英生长的菌剂进行拌种后进行种植的步骤。
[0011]上述栽培紫云英的方法中，所述菌剂的用量以华癸中间根瘤菌(Mesorhizobiumhuakuii) Z-14计为每克所述紫云英种子108cfu_109cfu (如IO8Cfu)华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii) Z-14
[0012]上文中,所述紫云英可为宁波大桥种、奉化种、闵紫6号或余江大叶。
[0013]培养所述华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)Z_14的方法和制备所述促进紫云英生长的菌剂也属于本发明的保护范围。
[0014]本发明所提供的培养所述华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii) Z_14的方法，包括将所述华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii) Z-14在用于培养根瘤菌的培养基中培养的步骤。
[0015]本发明所提供的制备所述促进紫云英生长的菌剂的方法，包括将所述华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii) Z-14作为所述菌剂的活性成分的步骤。
[0016]试验证明华癸中间根瘤菌(Mesorhizobiumhuakuii) Z-14CGMCC N0.7973 可促进宁波大桥种、奉化种、闵紫6号或余江大叶这四种紫云英的生长，对紫云英具有显著的增产效果，具有较高的实用性和可推广性，有望发展成为华癸中间根瘤菌应用领域中一项新的优良组合技术。本发明在紫云英种植业中具有广阔的应用前景。
[0017]保藏说明
[0018]菌种名称:华癸中间根瘤菌
[0019]拉丁名:Mesorhizobiumhuakuii
[0020]菌株编号:Z-14
[0021]保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0022]保藏机构简称:CGMCC
[0023]地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号
[0024]保藏日期:2013年07月31日
[0025]保藏中心登记入册编号:CGMCC N0.7973
【具体实施方式】
[0026]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0027]下述实施例中的紫云英宁波大桥种、奉化种、闵紫6号、余江大叶(紫云英品种比较试验初报.浙江农业科学.2012年第2期160页)公众可从中国农业科学院农业资源与农业区划研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0028]下述实施例中所用的中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCC13004于本申请的申请日前收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心(简称ACCC，地址:北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)，其收藏日为1990年3月10日，自收藏之日起，公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。
[0029]下述实施例中所用的中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCC13025于本申请的申请日前收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心(简称ACCC，地址:北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)，其收藏日为2000年7月8日，自收藏之日起，公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。
[0030]下述实施例中所用的中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCCl3048于本申请的申请日前收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心(简称ACCC，地址:北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)，其收藏日为1994年10月20日，自收藏之日起，公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。
[0031]实施例1、华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)Z_14CGMCC N0.7973 的分离
及鉴定
[0032]1、菌株的分离
[0033]从广西玉林石南镇采集野生紫云英根瘤，用平板(取蔗糖10g，酵母粉2g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸钙0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，质量含量为I %的钥酸铵水溶液ImL和质量含量为I %的硼酸水溶液lmL，20g琼脂，用水定容至lL，pH值为6.8-7.0)划线分离纯化得到菌株Z-14。
[0034]2、菌株的鉴定
[0035]2.1、形态学鉴定
[0036]将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤I分离并纯化得到的菌株Z-14进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态(是否平坦、突起、褶皱、凹陷等)、菌落边缘状态(是否整齐、不规则、放射状等)。另一方面，对处于对数生长期的菌株Z-14，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。
[0037]结果表明菌株Z-14属革兰氏染色阴性，杆菌，无芽孢，具端生鞭毛或周生鞭毛，能运动。菌体大小为(0.5-0.9) X (1.0-3.0)微米，在不同环境中生长的菌体形态各异。在培养条件下，该菌呈小的短杆状，菌体染色不均匀，形成着色与不着色部分的环状体，不着色的部分脂类含量较高。在培养基(取蔗糖10g，酵母粉2g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸钙0.2g，硫酸镁0.2g,氯化钠0.2g,质量含量为I %的钥酸铵水溶液ImL和质量含量为I %的硼酸水溶液lmL，20g琼脂，用水定容至1L，pH值为6.8-7.0)平面上生长，菌落呈圆形，边缘整齐，稍突起，无色半透明或浅乳白色，菌苔较浓。
[0038]2.2、16S rDNA序列同源性分析
[0039]采用菌落PCR方法扩增步骤I所得的菌株Z-14的16S rDNA片段，相关试剂由全式金公司提供。具体操作步骤如下:先在1.5mL离心管中加入50 μ L无菌水，用灭菌牙签挑取少量菌体于水中制成菌悬液，开水煮沸IOmin,迅速放入冰中5min,4°C 12000r/min离心5min,上清液作为 PCR模板。用细菌 16S rDNA通用引物 27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG_3’ )和 1492R (5’-661"^0:11^1"^064(:1'1'-3’)对菌株2-14的 16S rDNA 部分片段进行扩增。反应体系(50 μ L): 10Xbuffer (5μ L)、dNTP (2.5m mol/L)4y L、引物 27F (10m mol/L)2y L、引物 1492R (10m mol/L) 2 μ L、Taq 酶(5U/L) 0.25 μ L、5 μ L 上清液作为模板、ddH20 补足至50 μ L0 PCR 反应程序-MV 5min ；94°C lmin，52°C lmin，72°C lmin，30 个循环；72°C IOmin0
[0040]对16S rRNA基因片段进行扩增并克隆测序的结果表明，获得长度为693bp片段，其序列详见序列表中序列I。菌株Z-14的16S rDNA与IAM14158⑴的相似性最高为99.829%。
[0041]2.3、生理生化特征鉴定
[0042]参考《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京:科学出版社，2011.)和《微生物学实验》(沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验(第三版).北京:高等教育出版社，1999.)测定菌株Z-14的生理生化特征。
[0043]结果表明菌株Z-14石蕊牛奶不产酸；可以利用D-阿拉伯糖、乳糖、纤维二塘、D-半乳糖、果糖、D-甘露糖、D-核糖；氯化铵和硝酸盐可作为氮源；利用蛋白胨能力差；不水解酪素。
[0044]鉴于上述形态、生理生化特征分析和16s rDNA序列同源性分析结果，将步骤I分离纯化得到的菌株Z-14鉴定为华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)。该华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii) Z-14已于2013年07月31日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.7973。
[0045]实施例2、华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)Z_14CGMCC N0.7973 的培养
`[0046]1、华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii) Z-14CGMCC N0.7973 的斜面培养
[0047]将华癸中间根瘤菌(Mesorhizobiumhuakuii) Z-14CGMCC N0.7973 接入斜面(取蔗糖10g，酵母粉2g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸钙0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，质量含量为I %的钥酸铵水溶液ImL和质量含量为I %的硼酸水溶液lmL，20g琼脂，用水定容至1L，pH值为6.8-7.0)，在28°C下培养56小时。
[0048]2、菌种的活化
[0049]挑取步骤I斜面培养的华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)Z-14CGMCCN0.7973，将其接种于500mL液体培养基(取蔗糖10g，酵母粉2g，磷酸氢二钾
0.5g，硫酸钙0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，质量含量为I %的钥酸铵水溶液ImL和质量含量为I %的硼酸水溶液lmL，用水定容至lL，pH值为6.8-7.0)中，在28°C下培养48小时，得到华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii) Z-14CGMCC N0.7973 菌液。
[0050]3、种子罐培养
[0051]取3L 步骤 2 的华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)Z_14CGMCC N0.7973 菌液，将其接入装有60L液体培养基(取蔗糖10g，酵母粉2g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸钙0.2g，硫酸镁0.2g,氯化钠0.2g,质量含量为I %的钥酸铵水溶液ImL和质量含量为I %的硼酸水溶液lmL，用水定容至lL，pH值为6.8-7.0)的100L种子罐中进行种子培养，在30°C、120rpm下振荡培养56小时，得到种子液。
[0052]4、发酵罐培养[0053]按10%比例将步骤3的种子液接入装有600L液体培养基(取蔗糖10g，酵母粉2g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸钙0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，质量含量为I %的钼酸铵水溶液ImL和质量含量为I %的硼酸水溶液lmL，用水定容至1L，pH值为6.8-7.0)的1000L发酵罐中进行发酵培养，在28°C、150rpm下振荡培养56小时，得到华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii) Z-14CGMCC N0.7973 的发酵液。
[0054]实施例3、含草炭灰的华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)Z-14CGMCCN0.7973 菌剂的制备
[0055]1、草炭的处理
[0056]将草炭自然干燥后进行粉碎，过100目筛，然后用石灰水调pH值为6.8，在121°C灭菌I小时。
[0057]2、含草炭的华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii) Z-14CGMCC N0.7973 菌剂的获得
[0058]将按照实施例2的方法制备的华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)Z-14CGMCC N0.7973 的发酵液(华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)Z-14CGMCCN0.7973的含量为50亿cfu/mL)与步骤I获得的干燥、无菌、pH值为6.8的草炭按3:1的体积比混匀，再在28°C条件下增殖培养48小时，收集所有的培养物，得到华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii) Z_14菌剂，分装入库。经检测成品合格，该华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii) Z-14 菌剂的华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)Z-14含量为2.0XlO8Cfu/克。可用于华癸中间根瘤菌接种。[0059]实施例4、用华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)Z_14CGMCC N0.7973 菌剂
栽培紫云英，提高紫云英单株重量和紫云英株高
[0060]本实施例将生产上常用的中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii)ACCC13004、ACCC13025、ACCC13048作为对照，与本申请的华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)Z-14CGMCC N0.7973同时进行紫云英栽培实验。
[0061]4.1 供试菌剂:华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii) Z-14CGMCC N0.7973菌剂、中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCC13004菌剂、中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCC13025 菌剂、中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii)ACCC13048 菌剂。
[0062]4.1.1 华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii) Z-14CGMCC N0.7973 菌剂。
[0063]按照实施例3的方法制备华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)Z_14CGMCCN0.7973 菌剂，华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii) Z-14 含量为2.0X IO8Cfu/克。
[0064]4.1.2 中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCC13004 菌剂。
[0065]4.1.2.1 中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCC13004 发酵液的制备。
[0066]除将实施例2 中的华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)Z_14CGMCCN0.7973替换为中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii)ACCC13004外，其余方法与实施例2完全相同。中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCC13004发酵液中的中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCC13004 的含量为 50 亿 cfu/mL。
[0067]4.1.2.2 中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCC13004 菌剂的制备。[0068]中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii)ACCC13004菌剂的制备中，除将实施例3 的华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii )Z_14CGMCC N0.7973 发酵液替换为 4.1.2.1中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii ) ACCC13004发酵液外，其余方法与实施例3完全相同。中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCC13004菌剂中，中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCC13004 的含量为 2.0XlO8Cfu/ 克。
[0069]4.1.3 中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCC13025 菌剂。
[0070]4.1.3.1 中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCC13025 发酵液的制备。
[0071]除将实施例2 中的华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii )Z_14CGMCC N0.7973替换为中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii)ACCC13025外，其余方法与实施例2完全相同。中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCC13025发酵液中的中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCC13025 的含量为 50 亿 cfu/mL。
[0072]4.1.3.2 中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCC13025 菌剂的制备。
[0073]中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii)ACCC13025菌剂的制备中，除将实施例3 的华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii )Z_14CGMCC N0.7973 发酵液替换为 4.1.3.1中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii ) ACCC13025发酵液外，其余方法与实施例3完全相同。中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCC13025菌剂中，中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCC13025 的含量为 2.0XlO8Cfu/ 克。
[0074]4.1.4 中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCC13048 菌剂。
[0075]4.1.4.1 中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCC13048 发酵液的制备。
[0076]除将实施例2 中的华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii )Z_14CGMCC N0.7973替换为中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii)ACCC13048外，其余方法与实施例2完全相同。中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCC13048发酵液中的中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCC13048 的含量为 50 亿 cfu/mL。
[0077]4.1.4.2 中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCC13048 菌剂的制备。
[0078]中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii)ACCC13048菌剂的制备中，除将实施例3 的华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii )Z_14CGMCC N0.7973 发酵液替换为 4.1.4.1中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii ) ACCC13048发酵液外，其余方法与实施例3完全相同。中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCC13048菌剂中，中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCC13048 的含量为 2.0XlO8Cfu/ 克。
[0079]4.2、供试紫云英
[0080]宁波大桥种、奉化种、闵紫6号和余江大叶。
[0081]4.3实验方法
[0082]宁波大桥种、奉化种、闵紫6号和余江大叶这四个紫云英品种，每一个品种选择大小均一的紫云英种子，分别用上述华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii) Z-14CGMCCN0.7973菌剂、中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCC13004菌剂、中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCC13025 菌剂和中慢生华癸根瘤(Mesorhizobiumhuakuii) ACCC13048菌剂中的一种菌剂拌种，上述四种菌剂对每一种紫云英的用量均为每克紫云英种子108cfu。将经过华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii) Z-14CGMCCN0.7973菌剂拌种的宁波大桥种的种子称为CGMCC N0.7973-宁波大桥，将经过华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii) Z-14CGMCC N0.7973菌剂拌种的奉化种的种子称为CGMCC N0.7973-奉化种，将经过华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii) Z-14CGMCCN0.7973菌剂拌种的闵紫6号的种子称为CGMCC N0.7973-闵紫6号，将经过华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii) Z-14CGMCC N0.7973菌剂拌种的余江大叶的种子称为CGMCC N0.7973-余江大叶，将经过中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii)ACCC13004菌剂拌种的宁波大桥种的种子称为ACCC13004-宁波大桥，将经过中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCC13004菌剂祥种的奉化种的种子称为ACCC13004-奉化种，将经过中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCC13004菌剂拌种的岗紫6号的种子称为ACCC13004-岗紫6号，将经过中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii)ACCC13004菌剂拌种的余江大叶的种子称为ACCC13004-余江大叶，将经过中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCC13025菌剂拌种的宁波大桥种的种子称为ACCC13025-宁波大桥，将经过中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCC13025菌剂拌种的奉化种的种子称为ACCC13025-奉化种，将经过中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii)ACCC13025菌剂拌种的闵紫6号的种子称为ACCC13025-闵紫6号，将经过中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCC13025菌剂拌种的余江大叶的种子称为ACCC13025-余江大叶，将经过中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCC13048菌剂拌种的宁波大桥种的种子称为ACCC13048-宁波大桥,将经过中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii)ACCC13048菌剂拌种的奉化种的种子称为ACCC13048-奉化种，将经过中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii) ACCCl3048菌剂拌种的闵紫6号的种子称为ACCC13048-闵紫6号，将经过中慢生华癸根瘤(Mesorhizobium huakuii)ACCC13048菌剂拌种的余江大叶的种子称为ACCC13048-余江大叶。将没经过拌种处理的宁波大桥种、奉化种、闵紫6号、余江大叶的种子分别称为宁波大桥-不接菌(对照)、奉化种-不接菌(对照)、闵紫6号-不接菌(对照)、余江大叶-不接菌(对照)。
[0083]上述四个紫云英品种，每一个品种均同时进行如下处理:实验重复三次，每次重复的实验方法如下:采集土样，风干，装入15cmX 18cm盆中，每盆2.5kg,加水使土壤湿润至可播种。将80盆随机均分为20组，每组4盆，这20组的每盆中分别同时播种，每盆播种20粒种子。其中，CGMCC N0.7973-宁波大桥组播种CGMCC N0.7973-宁波大桥，CGMCC N0.7973-奉化种组播种CGMCC N0.7973-奉化种，CGMCC N0.7973-闵紫6号组播种CGMCC N0.7973-闵紫6号，CGMCC N0.7973-余江大叶组`播种CGMCC N0.7973-余江大叶，ACCC13004-宁波大桥组播种ACCC13004-宁波大桥，ACCC13004-奉化种组播种ACCC13004-奉化种，ACCC13004-闵紫6号组播种ACCC13004-闵紫6号，ACCC13004-余江大叶组播种ACCC13004-余江大叶，ACCC13025-宁波大桥组播种ACCC13025-宁波大桥，ACCC13025-奉化种组播种ACCC13025-奉化种，ACCC13025-闵紫 6 号组播种 ACCC13025-闵紫 6 号，ACCC13025-余江大叶组播种ACCC13025-余江大叶，ACCC13048-宁波大桥组播种ACCC13048-宁波大桥，ACCC13048-奉化种组播种ACCC13048-奉化种，ACCC13048-闵紫6号组播种ACCC13048-闵紫6号，ACCC13048-余江大叶组播种ACCC13048-余江大叶，宁波大桥-不接菌(对照)组播种宁波大桥-不接菌(对照)，奉化种-不接菌(对照)组播种奉化种-不接菌(对照)，闵紫6号-不接菌(对照)组播种闵紫6号-不接菌(对照)，余江大叶-不接菌(对照)组播种余江大叶-不接菌(对照)。[0084]播种后放温室在相同条件下培养60天至开花期，记录各个植株的高度和地上部分鲜重，并计算出各组的平均值，结果如表1所示。对于宁波大桥种，与宁波大桥-不接菌(对照)组相比，各个菌剂均能显著增加植株高度和植株重量，其中，宁波大桥-CGMCCN0.7973组的植株平均高度比对照增加的百分率和植株平均鲜重比对照增加的百分率最高，宁波大桥-CGMCC N0.7973组的植株平均高度比对照增加的百分率是宁波大桥-ACCC13004组的2.46倍，是宁波大桥-ACCC13025组的1.10倍，是宁波大桥-ACCC13048组的1.21倍；宁波大桥-CGMCC N0.7973组的植株平均鲜重比对照增加的百分率是宁波大桥-ACCC13004组的1.33倍，是宁波大桥-ACCC13025组的1.19倍，是宁波大桥-ACCC13048组的1.33倍。
[0085]对于余江大叶，与余江大叶-不接菌(对照)组相比，余江大叶-ACCC13004组的植株高度和植株重量显著低于余江大叶-不接菌(对照)组，其它三个菌剂组高于余江大叶-不接菌(对照)组，其中，余江大叶-CGMCC N0.7973组的植株平均高度比对照增加的百分率和植株平均鲜重比对照增加的百分率最高，余江大叶-CGMCC N0.7973组的植株平均高度比对照增加的百分率是余江大叶-ACCC13025组的2.36倍，是余江大叶-ACCC13048组的5.73倍；余江大叶-CGMCC N0.7973组的植株平均鲜重比对照增加的百分率是余江大叶-ACCC13025组的3.00倍，是余江大叶-ACCC13048组的2.00倍。
[0086]对于奉化种，与奉化种-不接菌(对照)组相比，奉化种-ACCC13025组的植株高度显著低于奉化种-不接菌(对照)组，其它三个菌剂组的植株高度均高于奉化种-不接菌(对照)组，四个菌剂组的植株重量均高于奉化种-不接菌(对照)组，其中奉化种-CGMCCN0.7973组的植株平均高度比对照增加的百分率和植株平均鲜重比对照增加的百分率最高，奉化种-CGMCC N0.7973组的植株平均高度比对照增加的百分率是奉化种-ACCC13004组的5.97倍，是奉化种-ACCC13048组的2.86倍；奉化种-CGMCC N0.7973组的植株平均鲜重比对照增加的百分率是奉化种-ACCC13004组的4.18倍，是奉化种-ACCC13025组的8.87倍，是奉化种-ACCC13048组的3.74倍。
[0087]对于闽紫6号，与闽紫6号-不接菌(对照)组相比，闽紫6号-ACCC13004组和闽紫6号-ACCC13025组的植株 高度低于闽紫6号-不接菌(对照)组，只有闽紫6号-CGMCCN0.7973组和闽紫6号-ACCC13048组的植株高度高于闽紫6号-不接菌(对照)组，其中，闽紫6号-CGMCC N0.7973组植株平均高度比对照增加的百分率是闽紫6号-ACCC13048组的
2.54倍；各菌剂组的植株重量均高于闽紫6号-不接菌(对照)组，其中，闽紫6号-CGMCCN0.7973组的植株重量最高，闽紫6号-CGMCC N0.7973组的植株平均鲜重比对照增加的百分率是闽紫6号-ACCC13004组的12.2倍，是闽紫6号-ACCC13025组的2.10倍，是闽紫6号-ACCC13048 组的 2.44 倍。
[0088]结果表明将华癸中间根瘤菌(Mesorhizobiumhuakuii) Z-14CGMCC N0.7973 接种紫云英种子后，紫云英植株高度和植株鲜重比接种普通华癸中间根瘤菌ACCC13004、ACCC13025、ACCC13048的植株相比显著增长，表明本发明的华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii) Z-14CGMCC N0.7973对紫云英具有显著的增产效果。
[0089]表1、各组的植株平均高度和植株平均鲜重
[0090]
【权利要求】
1.华癸中间根瘤菌(Mesorhizobiumhuakuii ) Z-14,它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC N0.7973。
2.促进紫云英生长的菌剂，所述菌剂的活性成分为权利要求1所述的华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii) Z-14。
3.权利要求1所述的华癸中间根瘤菌(Mesorhizobiumhuakuii) Z-14在制备促进紫云英生长的菌剂中的应用。
4.根据权利要求2所述的菌剂或权利要求3所述的应用，其特征在于:所述促进紫云英生长的菌剂为提闻紫z?英单株重量和/或提闻紫z?英株闻。
5.栽培紫云英的方法，包括将紫云英种子用权利要求2或4所述的菌剂进行拌种后进行种植的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述菌剂的用量以华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii) Z-14计为每克所述紫云英种子108cfu_109cfu华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii) Z-14。
7.根据权利要求2或4所述的菌剂、权利要求3或4所述的应用、权利要求5或6所述的方法，其特征在于:所述紫云英为宁波大桥种、奉化种、闵紫6号或余江大叶。
8.培养权利要求1所述华癸中间根瘤菌(Mesorhizobiumhuakuii)Z_14的方法,包括将所述华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)Z_14在用于培养根瘤菌的培养基中培养的步骤。
9.制备权利要求2所述菌剂的方法，包括将权利要求1所述华癸中间根瘤菌(Mesorhizobium huakuii) Z-14作为所述菌剂的活性成分的步骤。
【文档编号】C12N1/20GK103695335SQ201310646319
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月4日 优先权日:2013年12月4日
【发明者】马晓彤, 张晓霞, 曹卫东, 顾金刚, 徐昌旭, 白金顺 申请人:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所