鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒、制备方法及检测方法
【专利摘要】一种鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒，由预混液1和预混液2构成。该试剂盒鉴定鼠源性成分具有良好的特异性，灵敏度可达到1pg/反应，可成功地对肉类及其产品中的鼠源性成分进行鉴定，可用于食品安全检测部门对肉类及其制品掺假的监管与控制，具有显著的实用价值。
【专利说明】鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒、制备方法及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒、制备方法及检测方法，尤其是一种特异性好，灵敏度高的鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒、制备方法及检测方法。
【背景技术】
[0002]近年来，不法商贩利用廉价的肉类冒充高价牛、羊肉的肉类掺假事件频发。更为严重的是，近期市面上出现了用来源不明的鼠肉冒充羊肉的恶性案例，引起社会各界广泛关注。鼠肉掺假不仅影响了肉类产品市场的正常运行，更造成了严重食品安全隐患。老鼠多生活于潮湿脏乱的环境中，携带多种细菌病毒。死鼠肉极易腐烂而滋生细菌，一些死鼠体内还含有老鼠药等强力毒药成分。因此，一旦老鼠肉被混掺入食用肉类及肉制品，食用后会造成人体中毒，轻则恶心、呕吐，重则可能导致死亡。
[0003]以聚合酶链反应(PCR)为基础的检测技术已成为食品溯源，尤其是肉类种属鉴别的核心技术。该技术针对不同物种基因序列的差异，设计特异性的引物，利用PCR扩增反应实现食品中特征基因片段的指数级扩增，从而鉴别食品中的物种来源。实时荧光PCR的发展和应用提高了食品溯源方法的灵敏度，并为肉类及肉制品定量定性分析提供技术支持。目前，基于线粒体基因设计特异性的引物而建立PCR法和实时荧光PCR的方法已见大量报道，市面上已有许多利用此类方法检测肉及肉制品源性的试剂盒，在肉制品掺假控制与监管中发挥了重要作用。
[0004]然而，此类试剂盒多用于对肉制品中牛、羊、猪及禽类等源性的检测，而针对肉制品中鼠源性成分的检测的试剂盒还未有所见。在国外，已有运用普通PCR鉴别啮齿目物种源性的研究，但经过试验验证，该研究中针对啮齿目所设计的引物对猪、牛、羊等常见肉类均可以发生扩增反应，特异性差。在国内，目前市面上出现了针对海狸鼠源性成分的鉴定试剂盒。该试剂盒采用普通PCR方法，操作步骤繁琐，在灵敏度和特异性上都有一定的局限性。同时，在分类学上海狸鼠并不属于鼠科，而在国内某些地区，海狸鼠被视为可食用的肉类，因此使用海狸鼠掺假肉制品的危害性远小于本发明中调研选取的鼠科样本。
[0005]为了弥补鼠源性成分鉴定试剂盒的市场空缺，丰富肉制品掺假检测方法，我们开发了肉及肉制品中鼠源性成分检测的高灵敏度试剂盒。本发明针对生活中常见的可能掺假肉制品的鼠类，基于实时荧光定量PCR技术，设计鼠源性引物探针，具有良好的针对3种常见鼠肉的特异性，与其他肉类无交叉反应，灵敏度高达I皮克/反应，且总检测时间可控制在2小时以内，对肉制品掺假的监管和控制有着重要的意义。
【发明内容】
[0006]为了对肉制品掺假进行监管和控制，本发明提供了一种特异性好，灵敏度高的鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒、制备方法及检测方法。
[0007]为实现该目的，本发明提供了一种鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒，由以下试剂构成:预混液1，其包含Taqman荧光定量PCR反应Taq酶1.25U, dNTP各0.2 μ M，ΡΗ8.5的Tris-HCl 10 mM，KCl 50mM, MgCl2 1.5 mM ;储藏条件为 4 °C，保质期半年。
[0008]预混液2，其包含引物 A 2 μ M,序列为 5’ -CCGCCCAATCACCCAAA-3’，引物 B 2 μ Μ,序列为 5’ -GCCTCCGATTCATGTTAAGA-3’，序列荧光探针 C4 μ Μ,序列为 5’ -FAM-TACTGAATYCTAGTAGCCMC-TAMRA-3’，荧光探针 D 4 μ Μ，序列为 5’ -CY5-TGGTCTTCTTAGCGAGAGTG-TAMRA-3’，以及内参核酸0.0OSng/yL;储藏条件为-20 °C，避光，保质期半年。
[0009]本发明还提供了一种鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的制备方法，包括以下步骤:
521、提取常见鼠肉DNA并制作模板，进行扩增反应，对扩增产物进行测序；
522、鼠肉测序结果与其他肉类DNA的同源基因比对，筛选出鼠类特异序列，设计相应的引物和突光探针；
523、设计阳性内参，消除反应体系中假阴性；
524、验证方法的特异性，优化反应条件，制作试剂盒；
S25:使用梯度稀释的目标物种DNA，确定反应体系的检测灵敏度。
[0010]优选地，步骤S21具体包括:反应体系为25yL，其中包括12.5yL premix Taq(2X, Takara, version 2.0)，0.5 μ L 10 μ M Seq 正、反向引物，IOOng 模板 DNA 和ddH20 ;反应条件为 95°C预变性 3min ;30 个循环的 95°C 30s,50°C 30s,72°C Imin ;72°C延伸 7min。
[0011]优选地，步骤S22具体包括:探针的3’端用发光基团FAM标记，5’端用淬灭基团BHQ标记；在探针合成中等量分配两种碱基C/T。
[0012]优选地，步骤S23具体包括:阳性内参是由质粒PUC57插入一段重组基因构成；重组基因的序列为 5 ’ -CCGCCCAATCACCCAAATTGGTCTTCTTAGCGAGAGTGGCTGTCACGGGATTCGCTAAAATTCCCAGCGAAACCAGGCGGGAGTCTGGACACGTCGTTGGTACCATGATGAAGTGGCTGACATGATCACCGCGATGCGCCCAGGACATAATCTTAACATGAATCGGAGGC-3，。
[0013]优选地，步骤S24具体包括:反应体系为20 μ L，其中包括Taq酶1.25U，dNTP各0.2 μ M，PH8.5 的 Tris-HCl 10 mM, KCl 50mM, MgCl2 1.5 mM, 10 μ M 引物 A、B 各 0.4 μ L,0.8μ L 10 μ M 探针 C，0.8μ L 10 μ M 内参探针 D, 0.2 μ L ROX dye II (Takara,version 2.0), IOOng模板DNA和ddH20 ;反应条件为95°C预变性IOmin ;30个循环的95°C5s,55°C 30s,60°C 20s。
[0014]本发明亦提供了一种鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的检测方法，包括以下步骤:
531:取肉或肉产品中提取的DNA IyL与17 μ L预混液1，2 μ L预混液2在冰上混合均匀；
532:将混合好的试剂至于荧光定量PCR仪进行反应；
533:当内参CY5荧光信号在Ct值35左右发生扩增，说明PCR体系反应良好。
`[0015]优选地，步骤S32具体包括:反应条件设为:95° C预变性10 min，40个循环的95° C 5s,55° C 30s，最后保存于 4° C。
[0016]本发明基于实时荧光定量PCR技术，设计了食品中鼠源性成分鉴定的试剂盒。提取食品中的总DNA后，应用试剂盒预混液中所包含的鼠源性成分特异引物及探针，进行PCR扩增反应，从而获得对鼠源性成分定性及定量的检测结果。经验证，该试剂盒具有良好的针对3种常见鼠肉的特异性，与其他常见肉类之间无交叉反应，检测方法的灵敏度达到I皮克/反应，且总检测时间可控制在2小时以内。本试剂盒是根据肉类掺假在我国新出现的实际情况，针对可能用于牛羊肉掺假的3种鼠科动物设计荧光定量PCR方法，同时具备对3种目标鼠肉的特异性，能够成功鉴别检测食品中鼠源性成分，是目前灵敏度最高、最快速的鼠源性成分鉴定方法，可用于食品中鼠源性成分掺假的检测和监管。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]通过下面结合附图对本发明的一个优选实施例进行的描述，本发明的技术方案及其技术效果将变得更加清楚，且更加易于理解。其中:
图1示出了本发明的第二实施例的鼠源性特异引物探针设计图。碱基序列取自于线粒体细胞色素b基因。灰色部分依次分别代表鼠源性特异正向引物、荧光探针、反向引物结合序列的位置。图中黑点表示相同的碱基，黑色方框表示不同的碱基。
[0018]图2示出了本发明的第二实施例的阳性内参结构图。阳性内参由质粒pUC57插入一段重组基因构成。重组基因两端是鼠源性正向、反向引物的结合序列，两者之间是一段133bp的随机序列。RS:随机序列。
[0019]图3示出了本发明的第二实施例的实时荧光PCR扩增曲线。以猪、牛、羊肩、鸭、实验大鼠(实验用ICR大白鼠)、实验小鼠(实验用昆明种小鼠)、野生小鼠(中国家鼠)的DNA做模板进行PCR反应。反应体系中包含阳性内参，内参的CY5荧光信号在Ct值35-40之间发生扩增。实验大鼠、实验小鼠、野生小鼠在35个反应循环内均产生了显著的扩增曲线，而其他肉类DNA则没有出现特异性扩增。
【具体实施方式】
[0020]以下将结合所附的附图对本发明的优选实施例进行描述。
[0021]第一实施例
一种鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒，该基于荧光定量PCR技术鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒，由以下试剂构成:
预混液1，其包含Taqman荧光定量PCR反应Taq酶1.25U, dNTP各0.2 ii M，PH8.5的Tris-HCl 10 mM, KCl 50mM, MgCl2 1.5 mM。储藏条件为 4 °C，保质期半年。
[0022]预混液2，其包含引物 A 2 ii M,序列为 5’ -CCGCCCAATCACCCAAA-3’，引物 B 2 u M,序列为 5’ -GCCTCCGAITCATGTTAAGA-3’，序列荧光探针 C4 u M,序列为 5’ -FAM-TACTGAATYCTAGTAGCCMC-TAMRA-3’，荧光探针 D 4 y M，序列为 5’ -CY5-TGGTCTTCTTAGCGAGAGTG-TAMRA-3’，以及内参核酸0.005ng/iiL。储藏条件为-20 °C，避光，保质期半年。
[0023]第二实施例
一种鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的制备方法，包括以下步骤:
S21、提取常见鼠肉DNA并制作模板，进行扩增反应，对扩增产物进行测序。
[0024]步骤S21具体包括:从NCBI数据库中下载大鼠、小鼠的线粒体细胞色素B基因(CYTB)，使用 DNAMAN (LynnonBiosoft, version 8.0)比对，从而设计鼠类 CYTB 通用引物Seq0收集日常生活中常见的鼠肉，提取其DNA。采用CYTB通用引物Seq对所提取的鼠肉DNA进行普通PCR扩增，反应体系为25μ L，其中包括12.5μ L premix Taq (2X, Takara,version 2.0)，0.5 μ L 10 μ M Seq 正、反向引物，IOOng 模板 DNA 和 ddH20。反应条件为95°C预变性 3min ;30 个循环的 95°C 30s,50°C 30s,72°C Imin ；72°C 延伸 7min。将扩增得到的产物用切胶回收试剂盒提取并纯化，对扩增产物进行测序，从而获得常见鼠类的线粒体CYTB基因的准确序列。
[0025]S22、鼠肉测序结果与其他肉类DNA的同源基因比对，筛选出鼠类特异序列，设计相应的引物和荧光探针。
[0026]步骤S22具体包括:下载其他肉类(猪、牛、羊、鸡、鸭等)CYTB基因，应用DNAMAN序列比对软件，和测序得到的常见鼠CYTB基因进行比对，选取出鼠类特有序列，依据此设计鼠类特异的引物和荧光探针。设计时，引物的近3’端碱基和探针5’端至中间碱基是影响特异性的关键碱基，应保证关键碱基的在不同物种间的差异性。探针的3’端用发光基团FAM标记，5’端用淬灭基团BHQ标记。在搜集到的几种常见鼠类中，一种野生小鼠的探针结合区域包含一个不同于其他鼠类的碱基，因此在探针合成中等量分配这两种碱基C/T (Y表示此简并碱基)，使得探针能够适用于三种老鼠。引物探针设计图参见图1，序列如下:
表1鼠源性成分鉴定试剂盒所用引物、探针序列
【权利要求】
1.一种鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒，其特征在于，由以下试剂构成: 预混液I，其包含Taqman荧光定量PCR反应Taq酶1.25U, dNTP各0.2 ii M，PH8.5的Tris-HCl 10 mM, KCl 50mM, MgCl2 1.5 mM ;储藏条件为 4 °C，保质期半年； 预混液2，其包含引物A 2 PM,序列为5’ -CCGCCCAATCACCCAAA-3’，引物B 2 u M,序列为 5’ -GCCTCCGAITCATGTTAAGA-3’，序列荧光探针 C4 u M,序列为 5’ -FAM-TACTGAATYCTAGTAGCCAAC-TAMRA-3’，荧光探针 D 4 y M，序列为 5’ -CY5-TGGTCTTCTTAGCGAGAGTG-TAMRA-3’，以及内参核酸0.005ng/iiL;储藏条件为-20 °C，避光，保质期半年。
2.一种鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 521、提取常见鼠肉DNA并制作模板，进行扩增反应，对扩增产物进行测序； 522、鼠肉测序结果与其他肉类DNA的同源基因比对，筛选出鼠类特异序列，设计相应的引物和突光探针； 523、设计阳性内参，消除反应体系中假阴性； 524、验证方法的特异性，优化反应条件，制作试剂盒； S25:使用梯度稀释的目标物种DNA，确定反应体系的检测灵敏度。
3.如权利要求2所述的鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的制备方法，其特征在于， 步骤S21具体包括:反应体系为25 u L，其中包括12.5u L premix Taq (2X, Takara,version 2.0)，0.5 u L IOuM Seq 正、反向引物，IOOng 模板 DNA 和 ddH20 ;反应条件为95°C预变性 3min ;30 个循环的 95°C 30s,50°C 30s,72°C Imin ；72°C 延伸 7min。
4.如权利要求2所述的鉴定食`品中鼠源性成分的试剂盒的制备方法，其特征在于， 步骤S22具体包括:探针的3’端用发光基团FAM标记，5’端用淬灭基团BHQ标记；在探针合成中等量分配两种碱基C/T。
5.如权利要求2所述的鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的制备方法，其特征在于， 步骤S23具体包括:阳性内参是由质粒PUC57插入一段重组基因构成；重组基因的序列为 5 ’ -CCGCCCAATCACCCAAATTGGTCTTCTTAGCGAGAGTGGCTGTCACGGGATTCGCTAAAATTCCCAGCGAAACCAGGCGGGAGTCTGGACACGTCGTTGGTACCATGATGAAGTGGCTGACATGATCACCGCGATGCGCCCAGGACATAATCTTAACATGAATCGGAGGC-3，。
6.如权利要求2所述的鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的制备方法，其特征在于， 步骤S24具体包括:反应体系为20ii L，其中包括Taq酶1.25U，dNTP各0.2yM，PH8.5的 Tris-HCl 10 mM，KCl 50mM，MgCl2 1.5 mM, 10 y M 引物 A、B 各 0.4 y L, 0.8 u L IOuM探针 C，0.8u L IOuM 内参探针 D, 0.2u L ROX dye II (Takara, version 2.0), IOOng模板DNA和ddH20 ;反应条件为95°C预变性IOmin ；30个循环的95°C 5s,55°C 30s,60°C20so
7.一种鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤: 531:取肉或肉产品中提取的DNA IuL与17 ii L预混液1，2 y L预混液2在冰上混合均匀； 532:将混合好的试剂至于荧光定量PCR仪进行反应； 533:当内参CY5荧光信号在Ct值35左右发生扩增，说明PCR体系反应良好。
8.如权利要求7所述的鉴定食品中鼠源性成分的试剂盒的的检测方法，其特征在于， 步骤S32具体包括:反应条件设为:95° C预变性10 min, 40个循环的95° C 5s、55° C 30s，最后保存于4° C。
【文档编号】C12Q1/68GK103642917SQ201310647179
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月6日 优先权日:2013年12月6日
【发明者】方昕, 张驰, 许磊, 高翔, 李晓丽, 李宁, 方翔, 崔永刚 申请人:南京市产品质量监督检验院