一种微生物发酵生产精氨酸工艺的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种微生物发酵生产精氨酸工艺，采用黄色短杆菌MQA121，该方法包括下述的步骤：发酵液的制备：斜面培养、摇瓶菌种、一级种子培养、二级种子培养、继续发酵；发酵产品提取精制：发酵液预处理、二次结晶、脱色除杂处理、膜浓缩分离、干燥，包装得成品。能显著降低精氨酸后续提取精制液中菌体、有机物和无机物杂质含量，提高精氨酸的得率；提高了产品质量，降低了生产成本。
【专利说明】一种微生物发酵生产精氨酸工艺
【技术领域】
[0001]本发明涉及氨基酸发酵液高效提取精制【技术领域】，特别是涉及一种微生物发酵生产精氨酸工艺。
【背景技术】
[0002]精氨酸在医药、营养保健、食品等领域应用广泛，需求量大，被称之为氨基酸中最重要的品种之一。L-精氨酸是生物体尿素循环的重要中间代谢产物，所有的机体组织都利用L-精氨酸合成细胞浆蛋白和核蛋白。在生理活性方面，除了与生长激素、胰岛素、胰高血糖素等激素诱导有关外，近年来，又作为血管舒张因子而引起关注，有望成为营养疗法的新材料。由于L-精氨酸不仅拥有重要的科学研究、实际生产及应用价值，同时L-精氨酸在生理功能重要性的作用，而且现在国内传统生产方法依旧污染严重、产能产值较低，因此，经国务院和全国人大代表批准，发酵法生产精氨酸列入国家“十一五”重点攻关科技项目。
[0003]目前国内主要依靠蛋白质水解法来生产精氨酸，该法操作费时、收率低，工艺稳定性不好且环境污染严重，不适于大规模生产。国外特别是欧盟国家十分强调非动物来源性(non-animal)，使得毛发水解精氨酸产品受到很大发展限制。因此，建立我国发酵法生产精氨酸工业十分紧迫，也有良好发展前景。
[0004]精氨酸提取主要有两种生产工艺:即蛋白质水解提取工艺；生物发酵工艺。生物发酵工艺中发酵液中含有大量的有机和无机杂质，传统的后提取处理工艺对产品质量没有保障，而且费工费时。现有 技术提取时采用了板框过滤，时间长，收率低，损失大。
【发明内容】
[0005]本发明的目的就是针对上述存在的缺陷而提供一种微生物发酵生产精氨酸工艺。通过本发明制备方法，成品对于发酵液来说总收率能达到86.3%以上(相对于除去菌体的净精氨酸含量计算)，成品一次合格率达到99.9%。
[0006]本发明的一种微生物发酵生产精氨酸工艺技术方案为，包括发酵液的制备和提取精制步骤，其中发酵液的制备采用黄色短杆菌MQA121。
[0007]MQA121菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，邮编:100101，其保藏编号是=CGMCC N0.8392，菌种的拉丁丈右称Brevibacterium fLavum,参据的微生物(株):黄色短杆菌，保藏日期是2013年10月25日。
[0008]本发明所述的MQA121菌株特征为:产酸能力强、糖酸转化率高、性能稳定。
[0009]发酵液的制备包括下述的步骤:
(1)斜面培养:将MQA121菌种接入灭菌的斜面培养基，在28°C培养，28小时得到斜面菌种；
(2)摇瓶菌种:将培养好的斜面菌种接入摇瓶灭菌种子培养基28°C培养22小时得到摇瓶种子液；(3)一级种子培养:将培养好的摇瓶种子液接入灭菌的一级种子培养基，28°C培养18小时得一级种液；
(4)二级种子培养:将培养好的一级种子液接入灭菌过的二级种子培养基28°C培养4小时得二级种子液；
(5)将培养好的二级种子液接种到灭菌的发酵培养基中，发酵过程补加按重量百分比的葡萄糖 1% 和玉米浆 3.0-4.0%、(NH4)2SO40.5-1.0%、KH2PO40.1-0.3%、K2HPO4.3H200.3-0.5%，通入无菌风，采用氨水控制pH值7.2，在28°C条件下，经过66-72小时培养得到含精氨酸产品的发酵液。
[0010]步骤(1)中斜面培养基按重量百分比含有:葡萄糖2.0-2.5%、(NH4)2SO40.5-0.8%、KH2PO40.1-0.3%, K2HPO4.3H200.3-0.6%, MgSO4.7Η200.05-0.1%, FeSO4.7Η20 0.002-0.01%、MnSO4.H2O0.002-0.008%,琼脂粉 2.0%, ρΗ7.0~7.4。
[0011]摇瓶种子培养基、一级种子培养基、二级种子培养基以及发酵培养基按重量百分比包括:初糖浓度13%，尿素0.5%，玉米浆CSL3.0%, (NH4) S045.5%。
[0012]步骤(5)中氨水的体积浓度为1:1。
[0013]发酵产品提取精制包括以下步骤:
(1)发酵液预处理利用陶瓷膜设备除去发酵液中的生产菌和大分子蛋白；` (2)絮凝、脱色，预浓缩将步骤(1)中得到的滤清液依次经过弱酸性阳离子树脂、纳滤膜设备、活性炭脱色、反渗透循环、弱碱性阴离子树脂处理；
(3)浓缩、结晶将阴离子交换液吸入浓缩结晶罐浓缩结晶；
(4)成品离心分离干燥后得成品。
[0014]本发明的优点在于，本提取工艺采用陶瓷膜代替传统的板框过滤，提高了滤液质量，减少了占地面积，提高了产品收率，降低了劳动强度。
[0015]采用膜分离技术代替传统的离子交换分离技术，降低了树脂用量，提高了料液质量和透过，减少了活性炭用量，提高了产品质量。
[0016]采用膜浓缩技术代替传统的减压浓缩技术，减少了对产品的破坏，降低了能耗，提
高了产品质量。
[0017]最后，通过本发明制备方法，成品对于发酵液来说总收率能达到86.3%以上(相对于除去菌体的净精氨酸含量计算)，成品一次合格率达到99.9%，而传统工艺只能达到50%的总收率，一次合格率只有97%。
[0018]【具体实施方式】:
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
[0019]实施例1
发酵液的制备包括下述的步骤:
Cl)斜面培养:将MQA121菌种接入灭菌的斜面培养基(配方葡萄糖2.0-2.5%、(NH4)2SO40.5-0.8%、KH2PO40.1-0.3%、K2HPO4.3H200.3-0.6%、MgSO4.7H200.05-0.1%、FeSO4.7Η20 0.002-0.01%、MnSO4.H2O0.002-0.008%，琼脂粉 2.0%，ρΗ7.0~7.4，在 28°C培养，28小时得到斜面菌种；
(2)摇瓶菌种:将培养好的斜面菌种接入摇瓶灭菌种子培养基28°C培养22小时得到摇瓶种子液；
(3)一级种子培养:将培养好的摇瓶种子液接入灭菌的一级种子培养基，28°C培养14小时得一级种液；
(4)二级种子培养:将培养好的一级种子液接入灭菌过的二级种子培养基28°C培养4小时得二级种子液；
(5)将培养好的二级种子液接种到灭菌的发酵培养基中，发酵过程补加含量为 1% 葡萄糖和营养物质(玉米浆 3.0-4.0%、(NH4)2SO40.5-1.0%、KH2PO40.1-0.3%、K2HPO4.3Η200.3-0.5%，通入无菌风，采用氨水(1:1体积浓度)控制pH值7.2，在28°C条件下，经过66-72小时培养得到含精氨酸产品的发酵液。[0020]摇瓶种子培养基、一级种子培养基、二级种子培养基以及发酵培养基配方为:初糖浓度 13%，尿素 0.5%,玉米浆 CSL3.0%, (NH4) S045.5%。
[0021]发酵产品提取精制包括以下步骤:
(I)发酵液预处理利用陶瓷膜设备除去发酵液中的生产菌和大分子蛋白。陶瓷膜孔径80-500nm，操作压差0.05-0.20MPa，膜面流速3m/s，拟稳定通量60_85L/m2.h。
[0022]发酵液直接经过陶瓷膜循环过滤，过程采用循环水为循环料液降温，循环料液温度控制在60°C以下，浓缩液加入反渗透水清洗出残留的产品。过滤时间为20小时，滤清液含量为60g/L，滤液澄清、透明，预处理收率为85%。经过陶瓷膜后，清液含菌量< 0.2%。
[0023](2)絮凝、脱色，预浓缩将步骤(1)中得到的滤清液以树脂0.5倍体积/小时的流速流过弱酸性阳离子树脂D117(上海劲凯树脂有限公司)吸附产品，用2倍树脂体积的2.0N氨水，以I倍树脂体积的流速洗脱得到洗脱液；洗脱液通过通径为2000分子量的纳滤膜设备循环脱色，过程使用循环水降温控制循环料液温度低于50°C，用反渗透水清洗浓缩液至产品含量低于0.2%，得到透光为90%以上，含量为6%的纳滤浓缩液；纳滤清液升温至70°C，SOrpm搅拌状态下加入1%活性炭脱色，保温45分钟，当清液透光率达到92%以上后经脱碳机除去活性炭得到脱色清液，脱色清液经过反渗透循环，用循环水降温控制循环料液温度低于50°C，浓缩液含量达到15%后得到反渗透浓缩液；反渗透浓缩液以I倍树脂体积/小时的流速流经经过弱碱性阴离子树脂D470 (上海华震科技有限公司)得到含量为13%透光率99%的阴离子树脂交换液。
[0024](3)浓缩、结晶将阴离子交换液吸入浓缩结晶罐，在-0.07Mpa、料液温度控制在50°C、搅拌转速为SOrpm的条件下将阴离子交换液浓缩至料液含量达到80%，降低转速至60rpm，用_5°C冰水将料液降温至5°C养晶10小时。
[0025](4)成品将养好晶的结晶液以2500rpm转速的全自动出料离心机将结晶和母液分离，用75%的酒精清洗结晶得到湿品，湿品经双锥干燥在真空度-0.07Mpa，温度80°C条件下烘干8小时得到含水量0.5%以下的干品，干品在环境为温度20°C—25°C，湿度≤50%，无菌条件下包装得成品。
[0026]本提取工艺采用陶瓷膜代替传统的板框过滤，提高了滤液质量，减少了占地面积，提高了产品收率，降低了劳动强度。
[0027]采用膜分离技术代替传统的离子交换分离技术，降低了树脂用量，提高了料液质量和透过，减少了活性炭用量，提高了产品质量。
[0028]采用膜浓缩技术代替传统的减压浓缩技术，减少了对产品的破坏，降低了能耗，提高了产品质量。
[0029]最后，通过本发明制备方法，成品对于发酵液来说总收率能达到86.3%以上(相对于除去菌体的净精氨酸含量计算)，成品一次合格率达到99.9%，而传统工艺只能达到50%的总收率，一次合格率只有97%。
[0030]陶瓷膜对精氨酸发酵液具有良好地除菌效果，除菌效果如表1所示:
表1
【权利要求】
1.一种微生物发酵生产精氨酸工艺，其特征在于，包括发酵液的制备和提取精制步骤，其中发酵液的制备采用黄色短杆菌MQA121 ；MQA121菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是=CGMCC N0.8392。
2.根据权利要求1所述的一种微生物发酵生产精氨酸工艺，其特征在于，发酵液的制备包括下述的步骤: (1)斜面培养:将MQA121菌种接入灭菌的斜面培养基，在28°C培养，28小时得到斜面菌种； (2)摇瓶菌种:将培养好的斜面菌种接入摇瓶灭菌种子培养基28°C培养22小时得到摇瓶种子液； (3)一级种子培养:将培养好的摇瓶种子液接入灭菌的一级种子培养基，28°C培养18小时得一级种液； (4)二级种子培养:将培养好的一级种子液接入灭菌过的二级种子培养基28°C培养4小时得二级种子液； (5)将培养好的二级种子液接种到灭菌的发酵培养基中，发酵过程补加按重量百分比的葡萄糖 1% 和玉米浆 3.0-4.0%、(NH4)2SO40.5-1.0%、KH2PO40.1-0.3%、K2HPO4.3H200.3-0.5%，通入无菌风，采用氨水控制pH值7.2，在28°C条件下，经过66-72小时培养得到含精氨酸产品的发酵液。
3.根据权利要求1所述的一种微生物发酵生产精氨酸工艺，其特征在于，步骤(I)中斜面培养基按重量百分比含有:葡萄糖2.0-2.5%、(NH4) 2S040.5-0.8%、KH2PO40.1-0.3%, K2HPO4.3H200.3-0.6%, MgSO4.7Η200.05-0.1%, FeSO4.7Η20 0.002-0.01%、MnSO4.H2O0.002-0.008%,琼脂粉 2.0%, ρΗ7.0~7.4。
4.根据权利要求1所述的一种微生物发酵生产精氨酸工艺，其特征在于，摇瓶种子培养基、一级种子培养基、二级种子培养基以及发酵培养基按重量百分比包括:初糖浓度13%,尿素 0.5%,玉米浆 CSL3.0%, (NH4) S045.5%。
5.根据权利要求1所述的一种微生物发酵生产精氨酸工艺，其特征在于，步骤(5)中氨水的体积浓度为1:1。
6.根据权利要求1所述的一种微生物发酵生产精氨酸工艺，其特征在于，发酵产品提取精制包括以下步骤: (1)发酵液预处理利用陶瓷膜设备除去发酵液中的生产菌和大分子蛋白； (2)絮凝、脱色，预浓缩将步骤(1)中得到的滤清液依次经过弱酸性阳离子树脂、纳滤膜设备、活性炭脱色、反渗透循环、弱碱性阴离子树脂处理； (3)浓缩、结晶将阴离子交换液吸入浓缩结晶罐浓缩结晶； (4)成品离心分离干燥后得成品。
【文档编号】C12P13/10GK103695487SQ201310721124
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月24日 优先权日:2013年12月24日
【发明者】李令娣, 张祥飞 申请人:山东民强生物科技股份有限公司