一种诱变处理生物材料的方法及装置制造方法
【专利摘要】本发明“一种诱变处理生物材料的方法”，属于生物【技术领域】。其特征在于：采用以下步骤：（1）在固体培养基上涂布待处理的细胞，（2）对涂布的细胞进行诱变处理，所述细胞指微生物细胞、动植物悬浮状细胞。本发明的方法一方面能显著提到诱变效率，提高筛选效率。另一方面，有利于采用结合自动化高通量实验设备进行诱变育种。
【专利说明】一种诱变处理生物材料的方法及装置
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物试验方法，特别是一种高通量处理生物材料的方法及装置。
【背景技术】
[0002]目前绝大多数实验室对生物材料特别是微生物进行诱变处理的方法，其处理过程大多如下:(I)诱变处理:通过物理诱变或化学诱变等方法，对盛装在容器中的微生物样品进行诱变处理；(2)涂布平板:诱变处理结束后，将菌液涂布在固体培养基上培养长出单菌落；(3)分析单菌落筛选突变株。
[0003]上述现有方法的缺点在于，盛装在容器中的液体状态下的微生物，在接受诱变处理时，尤其是接受物理方法处理时，由于菌体之间相互遮挡，或液体对于处理剂量削弱作用，会降低处理效果，导致诱变效率低。
[0004]上述处理方法也不利于高通量及自动化操作。高效率的微生物诱变、选育方法和技术是目前生物【技术领域】的研究热点，并有很大的市场需求；配合高通量筛选技术开发高效的突变方法很有必要。
【发明内容】
[0005]本发明根据上述领域存在的需求，提供一种诱变处理生物材料的方法及相应的装置。技术方案如下:
[0006]一种诱变处理生物材料的方法，其特征在于采用以下步骤:
[0007](I)在固体培养基上均匀涂布待处理的细胞，
[0008](2)对涂布的细胞进行诱变处理，
[0009]所述细胞指微生物细胞。
[0010]所述诱变处理指采用物理方法，如紫外线、Y射线、等离子体、电磁辐射等，辐照涂布于固体培养基上的细胞。
[0011]所述诱变处理指涂布待处理的细胞之后再涂布化学诱变剂，然后进行培养。
[0012]诱变处理结束之后还包括培养，所述生物材料细胞指微生物，所述培养包括培养长成菌落。
[0013]所述培养还包括将长成的菌落扩繁成菌液。
[0014]所述培养基中添加有化学诱变剂。
[0015]一种诱变处理生物材料的方法，其特征在于:
[0016](I)在添加有化学诱变剂的固体培养基上涂布待处理的细胞，
[0017](2)培养涂布在固体培养基的细胞。
[0018]涂布待处理的细胞之后，对涂布的待处理细胞进行物理辐照处理，所述物理辐照处理是指采用紫外线、Y射线、等离子体、电磁辐射等，辐照涂布于固体培养基上的细胞。 [0019]所述涂布待处理的细胞，涂布浓度为:使经过诱变处理之后在固体培养基表面长出的细胞的密度为每平方厘米少于等于50个。[0020]本发明提供了一种诱变处理微生物的方法，与现有技术不同之处在于:将带诱变处理的细胞先均匀涂布于营养平板上，再进行诱变处理。诱变处理之后再进行培养，在培养出的单菌落中选育突变株。本发明的方法的突出优点体现在两方面:一方面能够显著提高诱变效率。均匀涂布在平板上的细胞都能够接受到同等强度的诱变处理剂量，处理结束后经培养长出的菌落中发生突变菌落比例大幅度提高，有效地提高了诱变和筛选效率；另一方面，本发明的方法更易于于采用自动化的高通量处理设备来实现诱变处理及筛选工作。
[0021]本发明的方法中，诱变处理可以指物理诱变，包括紫外、Y射线、等离子体处理等；也可以是化学诱变处理，包括在平板培养基中添加化学诱变试剂和/或在平板培养基表面涂布化学诱变剂。化学诱变剂可以是本领域现有技术中报道的任何诱变试剂。
[0022]本发明的一个优选实施方式中，既采用了化学诱变也采用了物理诱变，即在培养基中添加化学诱变剂，涂布待处理菌液之后接受等离子体处理。
[0023]本发明的方法中，对于在平板培养基上涂布细胞，涂布密度应保证每平方厘米不超过100个；或者取决于诱变处理后细胞的死亡率，涂布的浓度的标准是:在诱变处理之后长出的菌落的密度为每平方厘米上长出的菌落数不多于5个。诱变处理后细胞的死亡率取决于处理方式(物理或化学，物理处理中的剂量、处理时间，化学处理中的剂量、处理剂种类等都会影响待处理细胞的死亡率)。为了获得每种诱变处理方式下的细胞死亡率的准确数字，在每批诱变处理实验之前，可以做一个获得死亡率数据的预实验。在本发明的两个具体实施例中，涂布生物材料为微生物(乳酸菌和酵母菌)，涂布适宜浓度为IO2~IO3个/ml，每个标准平板涂布100 μ I。
[0024]本发明实施例1和2的实验数据证明，本发明的微生物诱变处理方法有效
[0025]的规避了菌株因风干、渗透压改变，处理过程中载片滑落、菌液飞溅等客观因素的影响，有效提高了诱变效率。
[0026]术语界定:
[0027]本发明所用的术语“涂布”，是一个动作，从本发明的上下文可以看出，其目的在于使待处理的生物细胞在平板上分散的到一定程度，例如本发明限定的诱变处理后长出的细胞数不超过50个/每平方厘米的密度。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1采用本发明的方法诱变处理乳酸菌对比试验，
[0029]图2采用本发明的方法诱变处理酵母菌对比试验，
[0030]其中横坐标为处理时间，纵坐标为致死率。
【具体实施方式】
[0031] 实施例1采用本发明的方法诱变处理乳酸菌
[0032]设备:ARTP (常压室温等离子体)诱变育种系统
[0033]试剂:0.9%生理盐水，MRS固体培养基配方:蛋白胨10g/L、牛肉粉5g/L、酵母粉4g/L、葡萄糖20g/L、醋酸钠5g/L、柠檬酸二铵2g/L、吐温801mL、磷酸氢二钾(7H20)2g/L、乙酸钠(3H20)5g/L、柠檬酸三铵 2g/L、硫酸镁(7H20)0.2g/L、硫酸锰(4H20)0.05g/L、琼脂 15g/L0[0034]待处理菌液:嗜酸乳酸菌(Lactobacillus acidophilus)ACCC10637,来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心
[0035]固体培养基:MRS固体培养基
[0036]对照试验步骤:
[0037](1)制备菌悬液:将乳酸菌原始菌株用MRS固体培养基活化培养，培养温度35°C，培养时间24h，刮取菌体于生理盐水中，得到生长旺盛、菌体粗壮的菌液；
[0038](2)制备样品载片:取新鲜制备的菌液稀释至细胞浓度0D_=0.5~1，滴加10~20uL至灭菌冷却后的载片上；
[0039](3)诱变处理:以10SLM为气体流量，以O~90s为处理时间对样品载片进行等离子体诱变；
[0040](4)诱变后，将载片上的菌膜洗脱，相应稀释后，涂布MRS固体培养基培养24h、35 °C，计算致死率。
[0041](5)实验结果如附图1对照组所示，其中，横坐标为处理时间，纵坐标为致死率。
[0042]本发明的方法的步骤:
[0043](I)制备菌悬液:将乳酸菌原始菌株用MRS固体培养基活化培养，培养温度35°C，培养时间24h，刮取菌体于生理盐水中，得到生长旺盛、菌体粗壮的菌液；
[0044](2)涂布平板:取新鲜制备的菌液稀释至细胞浓度约为IO2~IO3个/mL，取IOOuL涂布平板；
[0045] (3)诱变处理:以10SLM为气体流量，以O~90s为处理时间对平板进行等离子体诱变；
[0046](4)诱变后，将载片上的菌膜洗脱，相应稀释后，涂布MRS固体培养基培养24h、35 °C，计算致死率。
[0047](5)实验结果如附图1平板组所示，其中，横坐标为处理时间，纵坐标为致死率。
[0048]由图1可知，与对照组相比，利用平板处理得到的致死率虽然比对照组低，但致死率曲线平滑稳定，波动幅度较小，有效的排除了菌株因风干、渗透压改变，处理过程中载片滑落、菌液飞溅等客观因素的影响，有效提高了诱变效率。
[0049]实施例2采用本发明的方法诱变处理酵母菌
[0050]设备:ARTP (常压室温等离子体)诱变育种系统
[0051]试剂:0.9%生理盐水，PDA固体培养基配方:马铃薯浸粉5g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L、氯霉素 0.lg/L。
[0052]待处理菌液:毕赤酵母(Pichia pastoris)21003,购自来源于中国农业微生物菌
种保藏管理中心
[0053]固体培养基:PDA固体培养基
[0054]对照试验步骤:
[0055](I)制备菌悬液:将酵母菌原始菌株用PDA固体培养基活化培养，培养温度28°C，培养时间48h，刮取菌体于生理盐水中，得到生长旺盛、菌体粗壮的菌液；
[0056](2)制备样品载片:取新鲜制备的菌液稀释至细胞浓度0D_=0.5~1，滴加10~20uL至灭菌冷却后的载片上；
[0057](3)诱变处理:以10SLM为气体流量，以O~120s为处理时间对样品载片进行等离子体诱变；
[0058](4)诱变后，将载片上的菌膜洗脱，相应稀释后，涂布PDA固体培养基培养48h、28°C，计算致死率。实验结果如附图2对照组所示，其中，横坐标为处理时间，纵坐标为致死率。
[0059]本发明的方法的步骤及条件:
[0060](I)制备菌悬液:将乳酸菌原始菌株用PDA固体培养基活化培养，培养温度28°C，培养时间48h，刮取菌体于生理盐水中，得到生长旺盛、菌体粗壮的菌液；
[0061](2)涂布平板:取新鲜制备的菌液稀释至细胞浓度约为IO2~IO3个/mL，取IOOuL涂布平板；
[0062](3)诱变处理:以10SLM为气体流量，以O~120s为处理时间对平板进行等离子体诱变；
[0063](4)诱变后，将载片上的菌膜洗脱，相应稀释后，涂布PDA固体培养基培养48h、28°C，计算致死率。实验结果如附图2平板组所示，其中，横坐标为处理时间，纵坐标为致死率。
[0064]由图2可知，与对照组相比，利用平板处理得到的致死率虽然比对照组低，但致死率曲线平滑稳定，波动幅度较小，有效的排除了菌株因风干、渗透压改变，处理过程中载片滑落、菌液飞溅等客观因素的影响，有效提高了诱变效率。
【权利要求】
1.一种诱变处理生物材料的方法，其特征在于:采用以下步骤: (1)在固体培养基上涂布待处理的细胞， (2)对涂布的细胞进行诱变处理， 所述细胞指微生物细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，所述诱变处理指采用紫外、钴60或常压室温等离子体辐照涂布在固体培养基上的细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，所述诱变处理指涂布待处理的细胞之后再涂布化学诱变剂，然后进行培养。
4.根据权利要求1所述的方法，诱变处理结束之后还包括培养，所述生物材料细胞指微生物，所述培养包括培养长成菌落。
5.根据权利要求5所述的方法，所述培养还包括将长成的菌落扩繁成菌液。
6.根据权利要求1~5任一所述的方法,所述培养基中添加有化学诱变剂。
7.一种诱变处理生物材料的方法，其特征在于: (1)在添加有化学诱变剂的固体培养基上涂布待处理的细胞， (2)培养涂布在固体培养基的细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于涂布待处理的细胞之后，对涂布的待处理细胞进行物理辐照处理，所述物理辐照处理采用紫外、钴60或常压室温等离子体。
9.根据权利要求1~8任一所述的方法，所述涂布待处理的细胞，涂布浓度为:使经过诱变处理之后在固体培养基表面长出的细胞的密度为每平方厘米少于等于50个。
【文档编号】C12N15/01GK103911363SQ201310749658
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2012年12月31日
【发明者】毕鲜荣, 王立言 申请人:无锡思清源生物科技有限公司