作为亲和配体的掺入有免疫球蛋白片段的蜘蛛丝融合蛋白结构的制作方法
【专利摘要】一种包括部分B和CT，及任选地REP的重组融合蛋白，其中B包括至少一个免疫球蛋白片段，其提供与有机靶选择性相互作用的能力；CT是从70至120个氨基酸残基的部分，并衍生自蜘蛛丝蛋白的C端片段；及REP是从70至300个氨基酸残基的部分，并衍生自蜘蛛丝蛋白的重复片段。
【专利说明】作为亲和配体的掺入有免疫球蛋白片段的蜘蛛丝融合蛋白 结构
[0001] 发曰月的抟术领域
[0002] 本发明涉及重组融合蛋白的领域，且更具体地涉及包括衍生自蜘蛛丝蛋白（拖丝 蛋白）的部分的新颖融合蛋白。本发明提供了用于提供为包括重组融合蛋白的聚合物的蛋 白结构的方法，所述重组融合蛋白包括衍生自拖丝蛋白的部分。还提供了用于结合有机靶 的新颖蛋白结构。
[0003] 发明背景
[0004] 在应用蛋白化学中，一个常见的问题是如何向相关的活性位点配制或呈现生物活 性肽或蛋白，所述活性位点通常是有机革巴，诸如核酸、蛋白、蛋白复合体、蛋白和/或脂质和 /或碳水化合物和/或核酸的复合体。最简单的解决方案是仅仅提供生物活性肽或蛋白的 水溶液。然而，许多应用的确要求一些进一步的手段来实现期望的目标。例如，可将肽/蛋 白缔合于脂质混合物或化学地固定于支持结构。
[0005] 用于固定于支持结构的肽/蛋白的应用包括制备和分析性分离程序诸如生物工 艺、层析法、细胞捕获和培养、主动过滤器（activefilters)和诊断学。基于胞外基质蛋白 例如胶原的结构公开在EP704532和EP985732中。
[0006] 还已经建议在支持结构中使用蜘蛛丝蛋白。蜘蛛丝是天然的高性能聚合物，由于 强度和弹性的组合而获得了非同寻常的韧性和延伸性。蜘蛛具有多达七个不同的腺，这些 腺产生具有不同机械性质和功能的多种丝类型。由大壶状腺产生的拖丝（draglinesilk) 是最坚韧的纤维。它由两种主要的多肽组成，大多被称为大壶状腺拖丝蛋白（spidroin) (MaSp)l和2,但在例如，在十字园蛛（Araneusdiadematus)中被称为ADF-3和ADF-4。这 些蛋白质具有200-720kDa范围内的分子量。蜘蛛拖丝蛋白质或MaSp具有分成三部分的组 成：无重复的N-端结构域、由许多重复的聚Ala/Gly区段构成的中心重复区域和无重复的 C-端结构域。通常认为重复区域在丝纤维中形成分子间接触，但不太清楚末端结构域的准 确功能。还认为与纤维形成相联系地，重复区域经历从无规卷曲和a-螺旋构象到折 叠结构的结构转化。拖丝蛋白的C端区域在蜘蛛种类和丝类型之间通常是保守的。
[0007] W0 07/078239 和Stark,M.等人，Biomacromolecules8:1695-1701，（2007)公开 了由具有高的Ala和Gly含量的重复片段和蛋白质的C端片段组成的微型蜘蛛丝蛋白，以 及包含蜘蛛丝蛋白的可溶性融合蛋白。在蜘蛛丝蛋白从其融合配体释放后，自然地获得蜘 蛛丝蛋白的纤维。
[0008] Rising，A.等人，CMLS68(2) :169-184(2010)综述了在产生蜘蛛丝蛋白方面的进 展。
[0009] US2009/0263430公开了酶0-半乳糖苷酶与微型蜘蛛丝蛋白的膜的化学偶 联。然而，化学偶联可能要求对蛋白稳定性和/或功能不利的条件。包含衍生自蜘蛛丝 蛋白的重复区的区段的多个重复的蛋白已经被设计以包括RGD细胞结合区段（Bini，E等 人，Biomacromolecules7:3139-3145(2006))和/或R5肽（WongPoFoo，C等人，ProcNatl AcadSci103(25) :9428-9433(2006))或参与矿化作用（mineralization)的其它蛋白区 段（Huang,J等人，Biomaterials28:2358-2367(2007) ;W0 2006/076711)。在这些现有技 术文献中，通过在变性的有机溶剂六氟异丙醇（HFIP)中增溶融合蛋白和干燥来形成膜。
[0010] US2005/261479A1公开了用于纯化由重复片段和亲和性标签组成的重组丝蛋白 的方法，包括从复杂混合物中磁亲和性分离单独的丝蛋白，而不形成丝蛋白纤维或其它聚 合物结构。
[0011] 已知的支持结构和相关的技术在以下方面具有某些缺陷，例如经济性、效率、稳定 性、再生能力、生物活性和生物相容性。 发明概要
[0012] 本发明的一个目的是提供能够与有机靶选择性相互作用的新颖的重组融合蛋白。
[0013] 本发明的一个目的是提供能够与有机靶选择性相互作用的新颖蛋白结构。
[0014] 本发明的另一个目的是提供能够与有机靶选择性相互作用的蛋白结构，其中所述 结构的形成不使用可能对蛋白的二级结构或活性具有不可预测的作用和/或保持在蛋白 结构中的强溶剂。
[0015] 本发明的一个目的是提供能够与有机靶选择性相互作用的稳定蛋白结构，该蛋白 结构在使用后可容易地再生，例如通过化学处理再生。
[0016] 本发明的另一个目的是提供生物相容的并适于细胞培养和作为植入物的稳定蛋 白结构。
[0017] 本发明的又另一个目的是提供具有高密度的能够与有机靶选择性相互作用的均 匀间隔的官能团的蛋白结构。
[0018] 本发明的另一个目的是提供在+4°C或在室温储存数月后保持其选择性结合能力 的蛋白结构。
[0019] 本发明的又一个目的是提供可高压灭菌，即，在灭菌热处理后保持其选择性结合 能力的蛋白结构。
[0020] 本发明的另一个目的是提供在蛋白微阵列诊断中有用的蛋白结构。
[0021] 为了这些和其它目的，将从以下公开内容明显的是，根据第一方面，本发明提供融 合蛋白和由包含该融合蛋白作为重复结构单元的聚合物组成的蛋白结构，如权利要求书中 所列出的。
[0022] 根据一个相关的方面，本发明提供编码融合蛋白的分离的核酸和产生融合蛋白的 方法，如权利要求书中所列出的。
[0023] 根据另一个方面，本发明提供用于提供蛋白结构的方法，如权利要求书中所列出 的。
[0024] 根据另一个方面，本发明提供亲和性介质，如权利要求书中所列出的。
[0025] 根据一个方面，本发明提供细胞支架材料，如权利要求书中所列出的。根据一个相 关的方面，本发明还提供根据权利要求书的细胞和细胞支架材料的组合。
[0026] 根据一个方面，本发明提供蛋白结构和融合蛋白的新颖用途，如权利要求书中所 列出的。
[0027] 根据另一个方面，本发明提供用于从样品分离有机靶的方法，如权利要求书中所 列出的。
[0028] 根据另一个方面，本发明提供用于固定和任选地培养细胞的方法，如权利要求书 中所列出的。
[0029] 附图简沐
[0030] 图1显示拖丝蛋白C端结构域的序列比对。
[0031] 图2显示拖丝蛋白N端结构域的序列比对。
[0032] 图3显示Alexa647标记的抗原结合根据本发明的融合蛋白。
[0033] 图4显示生物素化的抗原结合根据本发明的融合蛋白，以Alexa647标记的链霉亲 和素检测。
[0034] 图5显示在泡沫格式中丝融合的抗体片段的显微照片。
[0035] 图6显示纯的和丝融合的抗体片段的抗原结合分析。
[0036] 所附序列的列表
[0037] SEQIDNO
[0038] 1 4Rep
[0039] 2 4RepCT
[0040] 3 NT4Rep
[0041] 4 NT4Rep
[0042] 5 NT4R印CTHis
[0043] 6 NT
[0044] 7 CT
[0045] 8共有NT序列
[0046] 9共有CT序列
[0047] 10 来自EuprosthenopsaustralisMaSpl的重复序列
[0048] 11共有G区段序列1
[0049] 12共有G区段序列2
[0050] 13共有G区段序列3
[0051] 14CTEuprosthenopsspMaSpl
[0052] 15CTEuprosthenopsaustralisMaSpl
[0053] 16CT三带金蛛（Argiopetrifasciata)MaSpl
[0054] 17CT泉字云斑蛛（Cyrtophoramoluccensis)Spl
[0055] 18CT几何寇蛛（Latrodectusgeometricus)MaSpl
[0056] 19CT黑寡妇蜘蛛（Latrodectushesperus)MaSpl
[0057] 20CT赫氏粒突蛛（Macrotheleholsti)Spl
[0058] 21CT络新妇蛛（Nephilaclavipes)MaSpl
[0059] 22CT斑络新妇（Nephilapilipes)MaSpl
[0060] 23CT马达加斯加金色球蜘蛛（Nephilamadagascanensis)MaSpl
[0061] 24CT带状裡金色圆网蜘蛛（Nephilasenegalensis)MaSpl
[0062] 25CT变异祸蛛（Octonobavarians)Spl
[0063] 26CT中华缕网蛛（Psechrussinensis)Spl
[0064] 27CT长爪绿色焚光蜘蛛（Tetragnathakauaiensis)MaSpl
[0065] 28CT多色肖銷（Tetragnathaversicolor)MaSpl
[0066] 29CT巨头地衣圆蛛（Araneusbicentenarius)Sp2
[0067] 30CT悦目金蛛（Argiopeamoena)MaSp2
[0068] 31CT阿吉普奥兰提亚金蛛（Argiopeaurantia)MaSp2
[0069] 32CT三带金蛛MaSp2
[0070] 33CT多型棘腹蛛（Gasteracanthamammosa)MaSp2
[0071] 34 CT几何寇蛛MaSp2
[0072] 35 CT黑寡妇蜘蛛MaSp2
[0073] 36 CT络新妇蛛MaSp2
[0074] 37 CT马达加斯加金色球蜘蛛MaSp2
[0075] 38 CT带状褪金色圆网蜘蛛MaSp2
[0076] 39CT褐灰色捕鱼蜘蛛（Dolomedestenebrosus)Fbl
[0077] 40CT褐灰色捕鱼蜘蛛Fb2
[0078] 41 CT十字园蛛ADF-1
[0079] 42 CT十字园蛛ADF-2
[0080] 43 CT十字园蛛ADF-3
[0081] 44 CT十字园蛛ADF-4
[0082] 45NTEuprosthenopsaustralisMaSpl
[0083] 46 NT几何寇蛛MaSpl
[0084] 47 NT黑寡妇蜘蛛MaSpl
[0085] 48 NT络新妇蛛MaSpl
[0086] 49 NT三带金蛛MaSp2
[0087] 50 NT几何寇蛛MaSp2
[0088] 51 NT黑寡妇蜘蛛MaSp2
[0089] 52 NTNephilainauratamadagascanensisMaSp2
[0090] 53 NT络新妇蛛MaSp2
[0091] 54NT横纹金蛛（Argiopebruennichi)圆柱状拖丝蛋白1
[0092] 55NTNephilaclavata圆柱状拖丝蛋白 1
[0093] 56 NT黑寡妇蜘蛛管状拖丝蛋白
[0094] 57 NT络新妇蛛鞭毛状丝蛋白
[0095] 58 NTNephilainauratamadagascanensis鞭毛状丝蛋白
[0096] 59 His6ScFvRep4CT(DNA)
[0097] 60 His6Rep4CTScFv(DNA)
[0098] 61 His6ScFvRep4CT
[0099] 62 His6Rep4CTScFv
[0100] 63 His6ScFvCT
[0101] 64 His6CTScFv
[0102] 65 His6ScFvNT-CT
[0103] 66 His6NT-CTScFv
[0104] 67 His6ScFvNTRep4CT
[0105] 68 His6NTRep4CTScFv
[0106] 69 His6ScFvNTNT-CT
[0107] 70 His6NTNT-CTScFv
[0108] 71 His6-scFvl-NTCT(DNA)
[0109] 72 His6-scFvl-NTCT
[0110] 73 His6-scFvl-CT(DNA)
[0111] 74 His6-scFvl-CT
[0112] 发明详沐
[0113] 本发明总体是基于如下洞见：能够与有机靶选择性相互作用的固体蛋白结构可制 备为以重组融合蛋白作为重复结构单元的聚合物形式。融合蛋白包括能与有机靶（抗原 /表位）选择性相互作用的至少一种免疫球蛋白（Ig)片段，和对应于蜘蛛丝蛋白的至少C 端片段的部分。意外地，衍生自蜘蛛丝蛋白的部分可被诱导以在结构上重排并因而形成聚 合、固体结构，而包括免疫球蛋白片段的部分，包括例如互补位，不在结构上重排，但保持其 期望的结构和功能，即，与该有机靶选择性相互作用的能力。可获得蛋白结构而无化学偶联 步骤或变性方法步骤，这使得程序容易并改进获得具有保持其部分的功能性的融合蛋白的 机会，尤其是当功能依赖于部分的二级结构时。这些融合蛋白聚合物的形成可被紧密地控 制，且这一洞见已被开发为进一步的新颖蛋白结构、产生该蛋白结构的方法、和该蛋白结构 在多种应用和方法中的用途。
[0114] 因此，根据本发明的融合蛋白具备期望的选择性相互作用活性和蛋白结构中在生 理条件下采用的内部的固体支持活性二者。当拖丝蛋白部分在结构上重排以形成聚合、固 体结构时，融合蛋白的结合活性被保持，而包括免疫球蛋白片段的部分与拖丝蛋白部分共 价连接，一定是被认为令人惊讶的。事实上，提供选择性相互作用活性的部分当被整合在根 据本发明的融合蛋白结构中时，可增加其热和/或化学稳定性和/或结合活性。该蛋白结 构还提供对有机靶的选择性相互作用活性的高和可预测的密度。具有选择性相互作用活性 的有价值的蛋白部分的丢失被减到最小，因为所有表达的蛋白部分与固体支持物缔合。
[0115] 从根据本发明的融合蛋白形成的聚合物是固体结构，由于其物理特征而是有用 的，尤其是高强度、弹性和轻的重量的有用的组合。特别有用的特征是，融合蛋白的拖丝蛋 白衍生部分是生化牢固的，适于用例如酸、碱或离液剂再生，并适于加热灭菌，例如在120°C 高压灭菌20min。该聚合物还因为其支持细胞粘附和生长的能力而是有用的。衍生自拖丝 的性质在开发为了医学或技术目的的新材料方面是有吸引力的。尤其是，根据本发明的蛋 白结构可用在制备和分析性分离程序中，诸如层析法、细胞捕获、筛选和培养、主动过滤器 (activefilters)和诊断学。
[0116] 通过一个优选的实施例，根据本发明的蛋白结构还可用于在蛋白微阵列诊断中固 定抗体片段。从本公开内容了解的许多优点中，可以预见的是，根据本发明的蛋白结构提供 了增强的灵敏度。现今许多疾病很难诊断并选择正确的治疗。在多路分子诊断领域，人们可 以证明随着时间从DNA到mRNA和现在到蛋白的趋势。由于蛋白的信息量比核酸丰富得多， 基于蛋白模式更精确的诊断的可能是解决更困难的诊断疾病状态，以及个体化药物需要的 关键。此外，这些诊断应该更能反映通过原始DNA提供的静态视图难以做到的，患者状况的 疾病和健康的时空变化。
[0117] 通过对患者样品（如血清）的蛋白含量变化进行彻底的调查，在分子水平上与疾 病相关的变化的理解将有助于阐明疾病生物学的潜在机理。疾病相关的分子特征的调查可 以作为改进诊断、预后和患者分类的基础。它还可能是选择适合特定的治疗的患者，及监测 治疗干预的作用的有用的工具。特定的蛋白结构域，诸如工程化抗体片段，如单链可变片段 (ScFv)，是用于分析样品中特定蛋白含量的无价的工具。最具挑战性的任务之一是以其三 维结构、功能性和结合位点被保持且可接触这样的方式将抗体片段固定在表面上。许多重 要的疾病标志物是蛋白，其在容易获得的样品如血清中丰度低。为了实现高度精确的分子 特征描绘，因此人们需增强当前的常规技术的灵敏度。我们在此描述了将抗体片段固定在 由重组蜘蛛丝制备的蛋白为基础的环境上的新策略。这种温和的固定化技术有助于保持抗 体片段稳定及阻碍变性，且从而增强对患者样品中特定蛋白的灵敏度。
[0118] 蜘蛛丝具有非常引人注目的物理和生理特征。重组微型蜘蛛丝蛋白Itep4CT可以在 大肠杆菌（Escherichiacoli)中制备并在非变性条件下纯化。纯的Rep4CT可进一步加工 成各种固体结构，或格式，诸如纤维、透明膜和三维多孔泡沫。其它蛋白结构域可以与CT或 Rep4CT融合而产生，且然后加工成以特定的蛋白功能功能化的固体格式。以这种方式，抗体 片段可以共价连接至CT或Itep4CT，且然后加工成为以抗原结合的功能功能化的小、但强的 斑点。这些丝固定的抗体片段也可以布点在微阵列芯片表面上，并用于在身体样品如血清 中检测疾病分子。
[0119] 使用这种策略，抗体片段被包含在以蛋白为基础的环境中，且抗体片段的主要部 分将在其活性形式中。新的策略可以与传统的在表面上直接干燥抗体片段相比，其中片段 的更大的比例将随机地定向和变性，且因此，不能结合抗原。此外，当与蜘蛛丝连接时，抗体 片段将与抗原结合位点被定向朝着溶液中的分子。由于灵敏度与活性抗体片段的数目关 联，可用的和活性抗体片段的比例越高，灵敏度越高。
[0120] 根据本发明的蛋白结构还可用在医疗装置中，诸如植入物和医学产品，诸如伤口 闭合系统、创可贴、缝线、伤口敷料、和用于细胞固定、细胞培养、组织工程和引导细胞再生 的支架。
[0121] 本发明提供能够与有机靶选择性相互作用的重组融合蛋白，该融合蛋白包括部分B和CT、和任选的REP和/或NT。本发明还提供能够与有机靶选择性相互作用的蛋白结构， 其中所述蛋白结构是包括根据本发明的重组融合蛋白、和任选地由根据本发明的重组融合 蛋白组成的聚合物，即，包括部分B和CT、和任选的NT，和任选地由部分B和CT、和任选的 REP和/或NT组成。
[0122] 尽管在实施例中融合蛋白的CT、REP和NT部分不得已地涉及具体蛋白，例如衍生 自来自Euprosthenopsaustralis的大拖丝蛋白l(MaSpl)的蛋白，为了产生根据本发明的 融合蛋白结构的目的，考虑本公开内容可适用于任何结构上相似的部分。而且，尽管在实施 例中提供融合蛋白的选择性相互作用活性的B部分不得已地涉及具体蛋白部分，例如衍生 自免疫球蛋白的部分，为了产生根据本发明的融合蛋白结构的目的，考虑本公开内容可适 用于能够与有机靶选择性相互作用的任何结构上和/或功能上相似的B部分。
[0123] 根据本发明的具体融合蛋白以式Bx-CT-Bz、Bx-REP-By-CT-BjPBx-CT-By-REP-BzS 义，其中x、y和z是从0至5的整数；且x+y+z多1，任选地在融合蛋白的任一端或融合蛋 白中任何两个蛋白部分之间还包含一个NT部分。如果x+y+z>l，即，如果存在两个或更多 个B部分，它们可以是相同或不同的。两个或更多个B部分可具有与相同有机祀或与不同 有机靶选择性相互作用的能力。优选地，两个或更多个B部分是大致上相同的，各具有与相 同有机靶选择性相互作用的能力。可替代地，优选两个或更多个B部分是不相同的，且它们 一起提供与有机靶选择性相互作用的能力。
[0124] 在根据本发明的优选融合蛋白中，x、y和z是0至2、优选地0至1的整数。在根 据本发明的某些优选融合蛋白中，y= 0。在根据本发明的更优选的具体融合蛋白中，y= 〇 且X或Z是 0,即，融合蛋白以式Bx-CT、CT-Bz、Bx-REP-CT、Bx-CT-REP、REP-CT-BjPCT-REP-Bz 定义，其中x和z是从1至5的整数。在根据本发明的优选融合蛋白中，y= 0，x和z是从0 至1的整数；且x+z= 1。如此，根据本发明的某些优选融合蛋白以式B-CT、CT-B、B-REP-CT、 B-CT-REP、REP-CT-B和CT-REP-B定义。在根据本发明的优选融合蛋白中，任选的REP部分 不存在。在缺乏REP部分的融合蛋白中，B部分对其它分子相比对其抗原靶的非特异性结 合的降低已有利地观察到。从缺乏REP部分的融合蛋白自发形成固体结构特别令人惊讶。 在另一个根据本发明的优选融合蛋白中，任选的NT部分不存在。
[0125] 术语"融合蛋白"此处指通过由重组核酸，即通过组合正常情况下不会一起出现的 两个或更多个核酸序列而人工创造的DNA或RNA表达而制备的蛋白质（遗传工程）。根据 本发明的融合蛋白是重组蛋白，且因此其不同于天然存在的蛋白质。特别地，因为野生型拖 丝蛋白不是由以上列出的重组核酸表达的，所以其不是根据本发明的融合蛋白。组合的核 酸序列编码具有特定功能特性的不同蛋白质、部分蛋白质或多肽。所得的融合蛋白或重组 融合蛋白是具有衍生自原始蛋白质、部分蛋白质或多肽中的每一种的功能特性的单一蛋白 质。而且，根据本发明的融合蛋白和相应的基因是嵌合的，即，该蛋白/基因部分衍生自至 少两种不同的物种。CT部分，以及任选的REP和NT部分均衍生自蜘蛛丝蛋白。为了避免疑 问，根据本发明的B部分是非拖丝蛋白的蛋白或多肽，S卩，其不是衍生自蜘蛛丝蛋白。具体 地，根据本发明的B部分不是衍生自蜘蛛丝蛋白的C端、重复或N端片段。
[0126] 融合蛋白通常由从170至2000个氨基酸残基、诸如从170至1000个氨基酸残基、 诸如从170至600个氨基酸残基、优选地从170至500个氨基酸残基、诸如从170至400个 氨基酸残基组成。小的尺寸是有利的，因为包含蜘蛛丝蛋白片段的较长蛋白可能形成无定 形的聚集物，这需要使用强力的溶剂来增溶和聚合。重组融合蛋白可包含多于2000个残 基，尤其是在蜘蛛丝蛋白包含多于一个B部分和/或当其包含NT部分，例如1-2个NT部分 的情形时。
[0127] 术语〃拖丝蛋白（spidroin) 〃和〃蜘蛛丝蛋白（spidersilkprotein) 〃遍及本 说明书可互换地使用，并涵盖所有已知的蜘蛛丝蛋白，包括大壶状腺蜘蛛丝蛋白，其通常缩 写为〃MaSp〃，或在十字园蛛的情形缩写为〃ADF"。这些大壶状腺蜘蛛丝蛋白一般为两种类 型，1和2。这些术语还包括与已知蜘蛛丝蛋白具有高程度的同一性和/或相似性的非天然 蛋白。
[0128] 所以，术语〃非拖丝蛋白〃意指不是衍生自蜘蛛丝蛋白的蛋白，S卩，与蜘蛛丝蛋白 具有低（或无）程度的同一性和/或相似性。
[0129] 根据本发明的蛋白结构能够与有机靶选择性相互作用。这一能力存在于根据本发 明的融合蛋白中，更具体地存在于融合蛋白的B部分中。CT部分、以及任选的REP和NT部 分，与有机分子的任何相互作用不被术语"能够与有机靶选择性相互作用"涵盖。为了避 免疑问，术语"能够与有机靶选择性相互作用"不涵盖根据本发明的融合蛋白的依赖于包 括CT部分、以及任选的REP和NT部分的相互作用的二聚、寡聚或聚合。
[0130] 术语〃有机靶〃涵盖含碳原子的所有化学分子，例外是通常本领域技术人员认为 是无机分子的那些，例如碳酸盐、碳的简单氧化物、氰化物、金刚石和石墨。为了避免疑问， 无机分子、盐和离子，诸如硅石和氯化钙，不是有机的。有机靶可以是包含有机分子或由有 机分子组成的复合体，例如，细胞表面上的受体复合体。有机靶可以是一种或更多种有机分 子类型的单体、二聚体、寡聚体或聚合物，可以由共价键或其它类型的缔合保持在一起。当 然，它还可以简单地是单个有机分子。根据本发明的优选的有机靶包括但不限于，核酸、蛋 白和多肽、脂质和碳水化合物、以及其组合。根据本发明的另外的优选的有机靶包括但不限 于，免疫球蛋白、包括免疫球蛋白或其衍生物的分子、白蛋白、包括白蛋白或其衍生物的分 子、生物素、包括生物素或其衍生物或类似物的分子、及生物疾病标志物，例如来自血液、血 清、尿、唾液或来自身体组织的其它样品。
[0131] 在本发明的上下文中，配体例如根据本发明的融合蛋白的B部分与其靶的"特异 "或"选择性"相互作用是指，该相互作用使得特异性与非特异性、或选择性或非选择性的 相互作用之间的差别变得有意义。两种蛋白之间的相互作用有时以解离常数测量。解离常 数描述两种分子之间的结合强度（或亲和性）。通常抗体与其抗原（表位）之间的解离常 数是从1(T7至l(TnM。然而，高特异性不必要求高亲和性。对其对应物具有低亲和性（在 摩尔范围中）的分子已经显示为与具有高的多的亲和性的分子同样特异性。在本发明的情 形中，特异或选择性相互作用是指在指定条件下，在天然存在的或经加工的生物或生化流 体的样品中其它蛋白的存在下，特定方法可用于确定特定蛋白、靶蛋白或其片段的存在和/ 或量的程度。换言之，特异性或选择性是区分相关蛋白的能力。特异和选择性在本说明书 中有时可互换地使用。
[0132] 根据本发明的融合蛋白还可包含一个或更多个接头肽。接头肽可布置在融合蛋白 的任何部分之间，例如，两个B部分之间、B和CT部分之间、CT和REP部分之间、和B和REP 部分之间，或可布置在融合蛋白的任一末端。如果B部分包含两个或更多个Ig片段，接头肽 还可布置在两个Ig片段之间。如果融合蛋白包含两个或更多个B部分，接头肽还可布置在 两个B部分之间。接头可在融合蛋白的功能单元之间提供间隔区，而且还可构成用于鉴定 和纯化该融合蛋白的工具，例如，His和/或Trx标签。如果融合蛋白包含用于鉴定和纯化 融合蛋白的两个或更多个接头肽，优选它们被间隔序列隔开，例如His6-间隔区-His6-。接 头还可构成将融合蛋白导向膜和/或致使融合蛋白从宿主细胞分泌到周围介质中的信号 肽，例如信号识别颗粒。融合蛋白还可在其氨基酸序列中包括允许裂解并去除接头和/或 其它相关部分，通常是一个或更多个B部分的裂解位点。多种裂解位点是本领域技术人员 已知的，例如，针对化学剂的裂解位点，例如Met残基之后的CNBr裂解位点和Asn-Gly残基 之间的羟胺裂解位点，针对蛋白酶例如凝血酶或蛋白酶3C的裂解位点，和自我剪接序列， 例如内蛋白（intein)自我剪接序列。
[0133] CT和B彼此直接或间接连接。直接连接指部分之间的直接共价结合而无间插序列 例如接头。间接连接也是指部分通过共价键连接，但是存在间插序列，例如接头和/或一个 或更多个另外的部分，例如REP和/或NT部分。
[0134] 一个或更多个B部分可布置在融合蛋白的内部或任何一端，S卩，布置在C端或布置 在N端。优选一个或更多个B部分布置在融合蛋白的N末端。如果融合蛋白包含用于鉴定 和纯化融合蛋白的一个或更多个接头肽，例如，His或Trx标签，优选地其被布置在融合蛋 白的N末端。
[0135] 优选的融合蛋白具有布置在N端的B部分通过1-30个氨基酸残基，经由例如1-10 个氨基酸残基的接头肽偶联到布置在C端的REP和CT部分的形式。接头肽可包含裂解位 点。任选地，融合蛋白具有可包含纯化标签例如His标签和裂解位点的N端或C端接头肽。
[0136] 另一种优选的融合蛋白具有布置在N端的B部分直接偶联到布置在C端的REP和CT部分的形式。任选地，融合蛋白具有可包含纯化标签例如His标签和裂解位点的N端或 C端接头妝。
[0137] 根据本发明的蛋白结构是包含根据本发明的重组融合蛋白作为重复结构单元的 聚合物，这是意指，其包含有序的多个根据本发明的融合蛋白，通常远多于100个融合蛋白 单元、例如，1000个融合蛋白单元或更多。任选地，聚合物可包含无B部分的互补蛋白、优选 地衍生自蜘蛛丝的蛋白作为另外的重复结构单元。如果融合蛋白的B部分是大和/或庞大 的，这可以是有益的。这些互补蛋白通常包括，REP部分和CT部分，及任选地NT部分，例如 1-2个NT部分。根据本发明的优选的互补蛋白可具有本文列出的结构的任一种，并缺失B 部分。优选地，互补融合蛋白与缺失B部分的融合蛋白基本上相同。然而优选地，根据本发 明的蛋白结构是由根据本发明的重组融合蛋白作为重复结构单元组成的聚合物，即，根据 本发明的蛋白结构是根据本发明的重组融合蛋白的聚合物。
[0138] 聚合物中融合单元的量值意指该蛋白结构获得显著的尺寸。在优选的实施方案 中，蛋白结构在至少两个维度上具有至少〇. 1ym的尺寸。因此，本文使用的术语〃蛋白结 构"涉及具有至少〇. 1um的厚度的融合蛋白聚合物，优选地人眼可见的宏观聚合物，S卩，具 有至少lym的厚度。术语〃蛋白结构〃不涵盖无结构的聚集物或沉淀物。尽管融合蛋白 的单体是水溶性的，应理解的是，根据本发明的蛋白结构是固体结构，即，不溶于水。该蛋白 结构是包含根据本发明的重组融合蛋白作为重复结构单元单体的聚合物。
[0139] 优选地，根据本发明的蛋白结构是以选自由纤维（fiber)、膜（film)、泡沫 (foam)、网状物（net)、网（mesh)、球（sphere)和胶囊（capsule)组成的组的物理形态。
[0140] 优选地，根据本发明的蛋白结构是厚度为至少lnm例如至少0. 1ym、优选地至 少1ym的纤维或膜。优选地，纤维或膜具有范围在lnm-400ym，例如1-400ym、且优选地 60-120ym中的厚度。优选地，纤维具有范围在0. 5-300cm、优选地l-100cm中的长度。其 它优选的范围是0.5-30cm和l-20cm。纤维具有在物理操作期间保持完整的能力，S卩，可用 于旋转、编织、扭转、钩编和类似程序。膜是有利的，因为其是一致的并粘附于固体结构，例 如，微量滴定板中的塑料制品。膜的这一特征有助于洗涤和再生程序，对于分离目的是非常 有用的。
[0141] 还优选地，根据本发明的蛋白结构具有高于IMPa、优选地高于2MPa、更优选地 lOMPa或更高的抗张强度。优选地根据本发明的蛋白结构具有高于lOOMPa、更优选地 200MPa或更高的抗张强度。
[0142] CT部分是包含70至120个氨基酸残基的蛋白片段，并衍生自蜘蛛丝蛋白的C端 片段。表述〃衍生自〃意指在根据本发明的CT部分的上下文中，它与蜘蛛丝蛋白的C端氨 基酸序列具有高度的相似性。如图1中所示，该氨基酸序列在各个物种和蜘蛛丝蛋白，包括MaSpl和MaSp2之间相当保守。以SEQIDN0:9提供了MaSpl和MaSp2的C端区域的共有 序列。在图1中，比对了以GenBank登记条目（如果可用）表示的下列MaSp蛋白质（SEQ IDNO:14-44)：
[0143]表1 -拖丝蛋白CT部分
【权利要求】
1. 一种重组融合蛋白，所述重组融合蛋白包括部分B和CT，及任选地REP,其中： B包括至少一个免疫球蛋白片段，其提供与有机祀选择性相互作用的能力； CT是从70至120个氨基酸残基的部分，并衍生自蜘蛛丝蛋白的C端片段；及 REP是从70至300个氨基酸残基的部分，并衍生自蜘蛛丝蛋白的重复片段。
2. 根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其中所述B部分的每个免疫球蛋白片段选自 免疫球蛋白可变区。
3. 根据前述任一项权利要求所述的重组融合蛋白，其中所述B部分包括至少一个重链 可变区（Vh)和至少一个轻链可变区（VJ。
4. 根据前述任一项权利要求所述的重组融合蛋白，其中所述B部分选自由单链可变片 段（scFv片段）、抗原结合片段（F油片段）、F(ab'）2片段、结构域抗体（dAb)和单结构域抗 体（sdAB)所组成的组。
5. 根据权利要求4所述的重组融合蛋白，其中所述B部分是单链可变片段（scFv)。
6. 根据前述任一项权利要求所述的重组融合蛋白，其中所述B部分包含30-1000个氨 基酸残基，诸如150-400个氨基酸残基。
7. 根据前述任一项权利要求所述的重组融合蛋白，其中所述CT部分与SEQ ID NO:9具 有至少50%的同一性，或与SEQ ID NO:7具有至少80%的同一性。
8. 根据前述任一项权利要求所述的重组融合蛋白，所述重组融合蛋白选自由式 Bx-CT-Bz、Bx-REP-By-CT-Bz和 B x-CT-By-REP-Bz所定义的蛋白的组， 其中x、y和Z是从0到5的整数； 且 x+y+z > 1。
9. 根据权利要求8所述的重组融合蛋白，所述重组融合蛋白选自由式B X-CT、CT-Bz、 Bx-REP-CT、Bx-CT-REP、REP-CT-Bz和 CT-REP-B Z所定义的蛋白的组； 其中X和Z是从1到5的整数。
10. 根据权利要求9所述的重组融合蛋白，所述重组融合蛋白选自由式B-CT、CT-B、 B-REP-CT、B-CT-REP、REP-CT-B 和 CT-REP-B 所定义的蛋白的组。
11. 根据前述任一项权利要求所述的重组融合蛋白，其中所述REP部分选自L(AG)山、 L (AG) nAL、L KA)山、L (GA) nGL 的组，其中 n是从2至10的整数； 每个单独的A区段是从8至18个氨基酸残基的氨基酸序列，其中所述氨酸残基的0至 3个不是Ala,且其余氨基酸残基是Ala ; 每个单独的G区段是从12至30个氨基酸残基的氨基酸序列，其中所述氨基酸残基的 至少40%是Gly ;及 每个单独的L区段是从0至20个氨基酸残基的接头氨基酸序列。
12. 根据前述任一项权利要求所述的重组融合蛋白，所述重组融合蛋白选自由SEQ ID N0:61-70 ;和与该些序列的任一种具有至少80%同一性的蛋白组成的组。
13. -种分离的核酸，所述分离的核酸编码根据权利要求1-12中任一项所述的融合蛋 白。
14. 根据权利要求13所述的分离的核酸，所述分离的核酸选自由编码根据权利要求12 所述的融合蛋白的核酸组成的组及由沈Q ID N0:59-60所组成的组。
15. -种能够与有机祀选择性相互作用的蛋白结构，其中所述蛋白结构是包含根据权 利要求1-12中任一项所述的重组融合蛋白作为重复结构单元的聚合物，其中所述B部分提 供与所述有机祀选择性相互作用的能力。
16. 根据权利要求15所述的蛋白结构，其中所述蛋白结构在至少两个维度上具有至少 0. 1 ym的尺寸。
17. 根据权利要求15-16中任一项所述的蛋白结构，其中所述蛋白结构是W选自由纤 维、膜、泡沫、网状物、网、球和胶囊组成的组的物理形态。
18. 根据权利要求1-12中任一项所述的重组融合蛋白用于产生能够与有机祀选择性 相互作用的蛋白结构的用途，其中所述蛋白结构是包含所述重组融合蛋白作为重复结构单 元的聚合物，且其中所述B部分提供与所述有机祀选择性相互作用的能力。
19. 根据权利要求15-17中任一项所述的蛋白结构在从样品分离有机祀中的用途。
20. 根据权利要求15-17中任一项所述的蛋白结构在细胞培养中的用途。
21. -种产生融合蛋白的方法，所述方法包括W下步骤： a) 在适当的宿主中表达根据权利要求1-12中任一项所述的融合蛋白；及 b) 获得包含所述融合蛋白的混合物，和任选地分离所述融合蛋白。
22. -种提供根据权利要求15-17中任一项所述的蛋白结构的方法，所述蛋白结构展 示对有机祀的结合活性，所述方法包括W下步骤： (a)提供根据权利要求1-12中任一项所述的重组融合蛋白； 化）将所述融合蛋白经受实现包含所述重组融合蛋白的聚合物的形成的条件。
23. -种用于固定有机祀的亲和性介质，所述亲和性介质包含根据权利要求1-12中任 一项所述的融合蛋白，其中所述B部分能够与所述有机祀选择性相互作用。
24. 根据权利要求23所述的亲和性介质，所述亲和性介质包含根据权利要求15-17中 任一项所述的蛋白结构，所述蛋白结构是包含所述重组融合蛋白的聚合物。
25. 根据权利要求23-24中任一项所述的亲和性介质，所述亲和性介质还包含所述有 机祀，其中所述B部分能够与所述有机祀选择性相互作用并结合。
26. 根据权利要求25所述的亲和性介质，其中所述有机祀能够与第二有机祀选择性相 互作用。
27. -种用于培养细胞的细胞支架材料，所述细胞具有存在于所述细胞表面上的有机 祀，所述细胞支架材料包含根据权利要求15-17中任一项所述的蛋白结构。
28. 根据权利要求27所述的细胞支架材料，其中所述B部分能够与存在于所述细胞表 面上的所述有机祀选择性相互作用。
29. 根据权利要求27所述的细胞支架材料，其中所述细胞支架材料还包含中间有机 祀，其中所述B部分能够与所述中间有机祀选择性相互作用并结合，且其中所述中间有机 祀能够与存在于所述细胞表面上的所述有机祀选择性相互作用。
30. 细胞与根据权利要求27-29中任一项所述的细胞支架材料的组合。
31. -种从样品分离有机祀的方法，所述方法包括W下步骤： 提供包含所述有机祀的样品； 提供根据权利要求23-26中任一项所述的亲和性介质，其中所述亲和性介质能够与所 述有机祀选择性相互作用； 在实现所述亲和性介质与所述有机祀之间的结合的适当条件下将所述亲和性介质与 所述样品接触；和 除去未结合的样品。
32. 根据权利要求31所述的方法，所述方法还包括在实现第一有机祀与第二有机祀之 间的结合的适当条件下将所述亲和性介质和固定的有机祀与所述第二有机祀接触的步骤， 所述第二有机祀能够与所述第一有机祀选择性相互作用。
33. 根据权利要求31-32中任一项所述的方法，其中当将所述亲和性介质与所述样品 接触W实现所述亲和性介质与所述有机祀之间的结合时，所述亲和性介质中的所述融合蛋 白W如根据权利要求15-17中任一项所述的蛋白结构存在。
34. 根据权利要求31-32中任一项所述的方法，其中当将所述亲和性介质与所述样品 接触W实现所述亲和性介质与所述有机祀之间的结合时，所述亲和性介质中的所述融合 蛋白在溶液中存在，且其中允许融合蛋白与所述有机祀结合的复合体形成根据权利要求 15-17中任一项所述的融合蛋白结构。
35. 根据权利要求31-34中任一项所述的方法，所述方法还包括检测、和任选地定量所 述亲和性介质上的固定的祀的存在的步骤。
36. 根据权利要求31-35中任一项所述的方法，所述方法还包括从所述亲和性介质释 放和收集所述有机祀的步骤。
37. 根据权利要求31-36中任一项所述的方法，所述方法还包括通过化学处理和/或灭 菌热处理再生所述亲和性介质的最后步骤。
38. 根据权利要求37所述的方法，其中所述化学处理包括用化0H和/或脈处理。
39. -种固定细胞的方法，所述方法包括 提供包含目标细胞的样品； 将所述样品应用到根据权利要求27-29中任一项所述的细胞支架材料，其中所述细胞 支架材料能够与存在于所述细胞表面上的有机祀选择性相互作用；和 通过所述细胞表面上的所述有机祀与所述细胞支架材料之间的结合，允许所述细胞固 定于所述细胞支架材料。
40. -种用于培养细胞的方法，所述方法包括 根据权利要求39所述的方法固定目标细胞到细胞支架材料；和 在适合细胞培养的条件下维持具有对其应用的细胞的所述细胞支架材料。
【文档编号】C12N15/62GK104470607SQ201380035379
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年5月2日 优先权日:2012年5月2日
【发明者】麦·赫德哈马尔, 扬·约翰松, 安娜·里辛, P-A·尼格伦 申请人:思百博技术股份公司, 伊缪诺维亚公司