生物合成途径、重组细胞和方法
【专利摘要】本公开通常描述了经修饰以展示增加的戊酸的生物合成的重组细胞，制成此类重组细胞的方法，和诱导细胞产生戊酸的方法。本公开还通常描述了经修饰以展示增加的2-甲基丁酸的生物合成的重组细胞，制成此类重组细胞的方法，和诱导细胞产生2-甲基丁酸的方法。
【专利说明】生物合成途径、重组细胞和方法
[0001] 相关申请的交叉引用 本申请要求享有于2012年5月11日提交的美国临时专利申请系列号61/645, 900的 优先权，其通过引用并入文本。
[0002] 概述 在一个方面中，本公开描述重组细胞，其经修饰以展示相比于野生型对照增加的戊酸 的生物合成。在另一个方面中，本公开描述重组细胞，其经修饰以展示相比于野生型对照增 加的2-甲基丁酸的生物合成。
[0003] 在各方面中，重组细胞可以是真菌细胞或细菌细胞。在各方面中，重组细胞可以是 光合的。在各方面中，重组细胞可以是分解纤维素的。
[0004] 在其中重组细胞展示增加的戊酸的生物合成的方面中，增加的戊酸的生物合成可 以包括相比于野生型对照L-天冬氨酸转化为L-苏氨酸中的增加，相比于野生型对照L-苏 氨酸转化为2-酮丁酸中的增加，相比于野生型对照2-酮丁酸延长活性中的增加，相比于野 生型对照2-酮戊酸延长活性中的增加，相比于野生型对照酮酸脱羧酶活性中的增加，相比 于野生型对照对预定底物的酮酸脱羧酶选择性中的增加，或相比于野生型对照醛脱氢酶活 性中的增加。
[0005] 在其中重组细胞展示增加的2-甲基丁酸的生物合成的方面中，增加的2-甲基丁 酸的生物合成可以包括相比于野生型对照L-天冬氨酸转化为L-苏氨酸中的增加，相比于 野生型对照L-苏氨酸转化为2-酮丁酸中的增加，2-酮丁酸转化为2-酮-3-甲基戊酸中的 增加，相比于野生型对照酮酸脱羧酶活性中的增加，相比于野生型对照对预定底物的酮酸 脱羧酶选择性中的增加，或相比于野生型对照醛脱氢酶活性中的增加。
[0006] 在另一个方面中，本公开描述方法，其通常包括在包含碳源的培养基中在对于重 组细胞产生戊酸有效的条件下孵育展示增加的戊酸的生物合成的重组细胞。在一些实施方 案中，碳源可以包含以下的一种或多种：葡萄糖、丙酮酸、L-天冬氨酸、L-苏氨酸、2-酮丁 酸、2-酮戊酸、2-酮己酸、戊醛、C02、纤维素、木糖、蔗糖、阿拉伯糖或甘油。
[0007] 在另一个方面中，本公开描述方法，其通常包括在包含碳源的培养基中在对于重 组细胞产生2-甲基丁酸有效的条件下孵育展示增加的2-甲基丁酸的生物合成的重组细 胞。在一些实施方案中，碳源可以包含以下的一种或多种：葡萄糖、丙酮酸、L-天冬氨酸、 L-苏氨酸、2-酮丁酸、2-酮-3-甲基戊酸、2-甲基丁醛、C02、纤维素、木糖、蔗糖、阿拉伯糖 或甘油。
[0008] 在另一个方面中，本公开描述方法，其通常包括将编码至少一种催化碳源转化为 戊酸的多肽的异源多核苷酸引入宿主细胞，其中至少一种多核苷酸可操作地连接于启动 子，从而使得经修饰的宿主细胞催化碳源转化为戊酸。
[0009] 在另一个方面中，本公开描述方法，其通常包括将编码至少一种催化碳源转化为 2-甲基丁酸的多肽的异源多核苷酸引入宿主细胞，其中至少一种多核苷酸可操作地连接于 启动子，从而使得经修饰的宿主细胞催化碳源转化为2-甲基丁酸。
[0010] 本发明的上述概述不旨在描述本发明的各公开的实施方案或每种实施。随后更具 体的描述示例说明性实施方案。在贯穿本申请的几处，通过实施例的列表提供教导，所述实 施例可以以多种组合使用。在每种情况下，描述的列表只能作为代表性的组，并且不应当解 释为排他性的列表。
[0011] 附图简述 图1.生产2-甲基丁酸（2MB)和戊酸（PA)的途径。（A)从1-丁烯和2-丁烯至2-甲 基丁酸和戊酸的化学方法。（B)从葡萄糖合成2-甲基丁酸的代谢途径。（C)从葡萄糖合成 戊酸的代谢途径。
[0012] 图2?用于（A)2-甲基丁酸（2MB)生产、（B)戊酸（PA)生产的合成操纵子。DC， 2_酮酸脱羧酶；DH，醛脱氢酶。
[0013] 图3.使用不同醛脱氢酶的发酵实验的结果。（A)用于2-甲基丁酸生产的醛脱氢 酶的比较。（B)用于戊酸生产的醛脱氢酶的比较。
[0014] 图4.使用不同酮酸脱羧酶的发酵实验的结果。（A)用于2-甲基丁酸生产的酮酸 脱羧酶的比较。（B)用于戊酸生产的酮酸脱羧酶的比较。
[0015] 图5.酮酸脱羧酶和醛脱氢酶的组合的发酵实验的结果。（A)用于2-甲基丁酸生 产的各种组合的比较。（B)用于戊酸生产的各种组合的比较。
[0016] 说明性实施方案的详述 在以下的示例性实施方案的描述中，指定了某些代谢酶和那些酶的天然来源。这些仅 仅是合适的酶和指定酶的合适来源的实例。具有相似催化活性的可选的酶是可以的，如可 从不同的微生物物种或菌株中获得的同源物。因此，本文描述的示例性实施方案不应当解 释为限制权利要求中反映的微生物或方法的范围。
[0017] 戊酸和2-甲基丁酸用作多种应用例如增塑剂、润滑剂和药物的化学中间体。本 公开描述了在大肠杆菌co7i)中生物合成这两种酸的合成代谢途径的构建： 修饰天然的亮氨酸生物合成途径以生产戊酸；修饰天然的异亮氨酸生物合成途径以生产 2_甲基丁酸。研究多种醛脱氢酶和2-酮酸脱羧酶在构建的途径中的活性。通过在摇瓶发 酵中酶的优化组合，实现对2-甲基丁酸2. 59g/L和对戊酸2. 58g/L的最高滴度（titer)。 该工作证明了高体积脂肪酸可再生生产的可行性。
[0018] 原油是能源和工业有机化学品的主要来源。然而，原油储备正在快速衰竭，使得燃 料和化学品的可持续途径的开发更具吸引力。为应对这一挑战，可以使用生物合成的方法， 其涉及将微生物工程化以生产非天然的化学中间体。非天然代谢物的生产可以涉及合成代 谢途径的工程化和开发。在该工作中，开发了从葡萄糖或其它合适的碳源可再生生产戊酸 (PA)和2-甲基丁酸（2MB)的生物合成策略。
[0019] 2005年美国总消耗的戊酸和2-甲基丁酸约为14, 000公吨（Dow. Product Safety Assessment: Isopentanoic Acid. The Dow chemical company 2008)。这些化学品可 以作为中间体用于多种应用，例如增塑剂、润滑剂和药物。它们同样用于从烃类提取硫 醇。戊酸的酯类作为戊酸类生物燃料（pentanoic biofuels)正在获得增加的关注，因为 它们可以以非常高的掺合比在汽油和柴油（diesel)中使用（Lange等，Angew Chem Int Edit 2010;49:4479-4483)。商业上，这些化学品通常通过氧化戊醛和/或2-甲基丁醛生 产，其每一种可以通过基于石油的化合物与合成气反应的方法制成（Dow. Product Safety Assessment: Isopentanoic Acid. The Dow chemical company 2008)。因为该方法使用 有毒性的中间体如合成气和不可再生的基于石油的原料，因此需要这些化学品的可持续途 径。本文展示生物合成作为这些化学品的潜在可替代途径。
[0020] 工程化的生物合成途径的一个优点是在微生物间天然生物合成途径的保守。因 此，一旦新的工程化的生物合成途径在一种微生物中建立，其通常可以在其它微生物中应 用。在该工作中，大肠杆菌中的天然的亮氨酸和异亮氨酸生物合成途径，通过引入大肠杆菌 宿主细胞异源(非天然)酶醛脱氢酶和/或2-酮酸脱羧酶来进行修饰。2-甲基丁酸和戊酸 的示例性合成代谢途径分别在图1B和图1C中显示。两种途径的共同中间体是2-酮丁酸 (2KB)，其通过生物合成的脱氨酶IIvA从苏氨酸衍生。从rA dr讲P dr谦]过表达可以驱动 碳流朝向苏氨酸生物合成（Zhang 等，Proc Natl Acad Sci USA 2010;107:6234-6239)， 并且因此，进入合成代谢途径以生产戊酸和/或2-甲基丁酸。
[0021] 对2-甲基丁酸的合成，在图1B中显示，2-酮丁酸被驱动进入2-酮-3-甲基戊酸 (KMV)的合成，其是2-甲基丁酸的倒数第二个前体。通过IlvG和IlvM催化2-酮丁酸和丙 酮酸缩合成2-乙酰-2-羟基丁酸（AHB)。另两种酶IlvC和IlvD可以催化AHB转化为KMV。 KMV随后通过酮酸脱羧酶（DC)脱羧成2-甲基丁醛，其可以通过醛脱氢酶（DH)氧化为2-甲 基丁酸。
[0022] 对于戊酸的合成，2-酮丁酸可以经历2个循环的"+1"碳链延长以产生2-酮己酸 (2KC)。在天然的亮氨酸生物合成途径中，2-酮异戊酸通过由2-异丙基苹果酸合酶（LeuA)、 异丙基苹果酸异构酶复合体（LeuC、LeuD)和3-异丙基苹果酸脱氢酶（LeuB)催化的3步链 延长循环转化为2-酮异己酸。然而，在我们的合成途径中，LeuA、LeuB、LeuC、和LeuD足够 灵活以类似地延长2-酮丁酸至2-酮戊酸，并且随后延长2-酮戊酸至2-酮己酸（4)。2-酮 己酸可以随后通过2-酮酸脱羧酶（DC)脱羧至戊醛，其可以通过脱氢酶（DH)氧化至戊酸。
[0023] 生物合成2-甲基丁酸和戊酸的代谢途径的构建 生产2-甲基丁酸（2MB)和戊酸（PA)的生物合成方案分别在图1B和图1C中显示。天 冬氨酸生物合成下游的所有酶从3个合成操纵子过表达。一个操纵子包括ThrA、ThrB和 ThrC的编码区，其每一个均涉及苏氨酸合成，在携带壮观霉素抗性标记物的低拷贝质粒 pIPAl上I\lac01启动子的控制下。对于2-甲基丁酸的合成（图1B)，以、 和被克隆至具有卡那霉素抗性标记物的低拷贝质粒上以获得PIPA2。相似地，对于戊 酸的合成，沒P 啵克隆至携带卡那霉素抗性标记物的低拷贝质 粒PIPA3上。多种醛脱氢酶和酮酸脱羧酶存在于携带氨苄青霉素抗性标记物的高拷贝质粒(PIPA4至pIPA15,表2)上以转录顺序DC-DH(2-酮酸脱羧酶-脱氢酶）在I\laC〇l启动子 之下。
[0024] 由于苏氨酸是两个途径的共同中间体，因此在本研究中使用了苏氨酸过生产菌株 大肠杆菌菌株ATCC98082。该菌株移除了苏氨酸输出基因rAM以确保苏氨酸的细胞内高水 平（Zhang 等，Proc Natl Acad Sci USA 2010; 107:6234-6239)，还删除醇脱氢酶基 因以消除导向相应醇的副反应。产生的菌株此后被称为PA1菌株。
[0025] 在图1B和图1C显示的合成途径被设计为包括将酮酸2-酮-3-甲基戊酸（图 1B)和2-酮己酸（2KC，图1C)脱羧为它们相应的醛，随后氧化醛至羧酸。基于我们先 前对于生产异丁酸的工作（Zhang等，ChemSusChem 2011;4:1068-1070)，我们从乳 酸乳球菌/acKs)克隆野生型2_酮异戊酸脱羧酶KIVD (de la Plaza 等，FEMS Microbiol Lett 2004;238:367-374)，从大肠杆菌克隆苯乙醛脱氢酶PadA (Rodriguez-Zavala 等，Protein Sci 2006;15:1387-1396)以检查我们的目标化学品的 生产。PA1菌株用质粒pIPAl、pIPA2和pIPA4转化以生产2-甲基丁酸。PA1菌株用质粒 pIPAl、pIPA3和pIPA4转化以生产戊酸。使用各重组菌株实施摇瓶发酵。使用这种方法， 我们生产出2. 26g/L的2-甲基丁酸和2. 12g/L的戊酸，证明了我们的生物合成方法的可行 性。
[0026] 醛脱氢酶的筛选 为改进生产滴度，检测选择不同醛脱氢酶的效果（图3A和图3B)。选择6种 醒脱氢酶作为该研究的候选酶：来自大肠杆菌的乙醒脱氢酶AldB(Ho和Weiner, JBacteriol2005;187:1067-1073)、3-羟基丙醛脱氢酶AldH(Jo等，Appl MicrobiolBiotechnol2008;81:51-60)、苯乙醒脱氧酶PadA(Rodriguez-Zavala 等，ProteinSci2006; 15:1387-1396)、玻拍酸半醒脱氢酶GabD(Bartsch等，J Bacteriol1990;172:7035-7042)、y-氨基丁醛脱氢酶YdcW(Gruez等，JMolBiol 2004; 343:29-41)和来自iferAAo/oferia的a-丽戊二酸半醒脱氧酶KDHba(Jo 等，ApplMicrobiolBiotechnol2008;81:51-60)。细菌菌株使用如图2中显不的3种 合成操纵子构建。引入菌株的全部异源酶在菌株间是相同的，除了醛脱氢酶。选择野生型 KIVD作为2-酮酸脱羧酶用于各菌株。在30°C实施摇瓶发酵并且样品通过HPLC分析。分 析发酵物以鉴定生产最高量的期望产物的菌株--并因而鉴定醛脱氢酶。
[0027] 为比较用于生产2-甲基丁酸的各种醛脱氢酶的活性，PA1菌株用质粒pIPAl、 PIPA2,以及pIPA4至pIPA9中任一个转化。在发酵后，用AldH达到2. 51g/L的最高滴度，而 AldB、PadA、KDHba、GabD 和 YdcW 分别产生 2. 31 g/L、2. 26 g/L、0. 67 g/L、0. 14 g/L 和 0? 23 g/L (图 3A)。
[0028] 对于戊酸的生产，PA1菌株使用质粒pIPAl、pIPA2,以及pIPA4至pIPA9中任一个 转化。发现KDH ba为生产戊酸的最有活性的醛脱氢酶（2. 25g/L)，而AldH、AldB、PadA、GabD 和 YdcW 分别生产 1. 76 g/L、0. 42 g/L、2. 12 g/L、0. 54 g/L 和 0? 22 g/L (图 3B)。
[0029] 2-酮酸脱羧酶的筛选 在发酵过程中观察到几种代谢副产物例如乙酸、丙酸、丁酸和3-甲基丁酸。来 自乳酸乳球菌的野生型酮酸脱羧酶KIVD (de la Plaza等，FEMS Microbiol Lett 2004;238:367-374)和它的突变体的几种被研究用于增加目标C5酸的产量并且降低副产 物形成。单一氨基酸取代突变沒份J被报道对于更大的底物增加了 KIVD的特异性。其它三 个突变和/^的效果，各自与K你突变组合，进行了研究。这些突变通过 较小的疏水残基替换了关键位置的庞大残基。还研究了来自鼠伤寒沙门氏菌（ 加Ai皿ri，）的n引哚丙酮酸脱羧酶（iroc)的效果。用不同的2-酮酸脱羧酶构建质粒，但 是均具有相同的醛脱氢酶（PadA)和其它酶。
[0030] 为比较用于2-甲基丁酸合成的选择的2-酮酸脱羧酶的活性，使用用于2-甲基丁 酸的pIPAl、pIPA2,以及质粒pIPAlO至pIPA13中任一个转化PA1菌株。为比较用于戊酸 合成的选择的2-酮酸脱羧酶的活性，使用用于戊酸合成的pIPAl、pIPA3,以及质粒pIPAlO 至PIPA13中任一个转化PA1菌株。摇瓶发酵显示IPDC比KIVD或任何其突变体更好地工 作以生产2-甲基丁酸（2. 5g/L)或戊酸（2. 14g/L)(图4A和图4B)。
[0031] 已确定在用于生产2-甲基丁酸的全部候选的醛脱氢酶和2-酮酸脱羧酶中AldH 和IPDC具有最高活性后，将它们组合在一起（pIPA14)以研究效果是否是累加的。在组合 中，2-甲基丁酸滴度达到2. 59 g/L，只少量地高于AldH与WT KIVD的2. 51 g/L或PadA与 IPDC的2. 5 g/L (图5A)。类似地，将-同克隆（pIPA15)用于戊酸的生产。 这增加戊酸滴度至2. 58 g/L。与之相比，仰1^与WT KIVD的生产滴度为2. 25 g/L或PadA 与IPDC的生产滴度为2. 14 g/L (图5B)。
[0032] 酶的纯化和表征 对最具活性的酮酸脱羧酶IPDC，和最具活性的醛脱氢酶AldH和KDHba，表征它们对在构 建的途径中涉及的底物的活性。AldH从His-标签质粒表达并纯化。IPDC和KDHba可从 先前的研究获得。动力学参数通过监测在340nm的NADH吸光度测量。K M的值在表 1中给出。
[0033] 表1酶的动力学参数
【权利要求】
1. 重组细胞，其经修饰以展示相比于野生型对照增加的戊酸的生物合成。
2. 重组微生物细胞，其经修饰以展示相比于野生型对照增加的2-甲基丁酸的生物合 成。
3. 任何前述权利要求的重组微生物细胞，其中所述微生物细胞是真菌细胞。
4. 权利要求3的重组细胞，其中所述真菌细胞是酵母科（Saccharomycetaceae family)的成员。
5. 权利要求3的重组细胞，其中所述真菌细胞是酿酒酵母（ cereFisiae)、皱落假丝酵母rwgiosa)或白色念珠菌
6. 权利要求1或权利要求2的重组细胞，其中所述微生物细胞是细菌细胞。
7. 权利要求6的重组细胞，其中所述细菌细胞是变形菌门（phylum Protobacteria)的 成员。
8. 权利要求7的重组细胞，其中所述细菌细胞是肠杆菌科（Enterobacteriaceae family)的成员。
9. 权利要求8的重组细胞，其中所述细菌细胞是大肠杆菌（co/i)。
10. 权利要求7的重组细胞，其中所述细菌细胞是假单胞菌科（Pseudomonaceae family)的成员。
11. 权利要求10的重组细胞，其中所述细菌细胞是恶臭假单胞菌（ putida)。
12. 权利要求6的重组细胞，其中所述细菌细胞是厚壁菌门（phylum Firmicutes)的成 员。
13. 权利要求12的重组细胞，其中所述细菌细胞是芽孢杆菌科(Bacillaceae family) 的成员。
14. 权利要求13的重组细胞，其中所述细菌细胞是枯草芽孢杆菌（ subtilis、。
15. 权利要求12的重组细胞，其中所述细菌细胞是链球菌科（Streptococcaceae family)的成员。
16. 权利要求15的重组细胞，其中所述细菌细胞是乳酸乳球菌（ZaciococcM lactis、。
17. 权利要求12的重组细胞，其中所述细菌细胞是梭菌科（Clostridiaceae family) 的成员。
18. 权利要求17的重组细胞，其中所述细菌细胞是解纤维梭菌（ cellulolyticum)。
19. 权利要求6的重组细胞，其中所述细菌细胞是蓝细菌门（phylum Cyanobacteria) 的成员。
20. 任何前述权利要求的重组细胞，其中所述微生物细胞是光合的。
21. 任何前述权利要求的重组细胞，其中所述微生物细胞是分解纤维素的。
22. 权利要求1和3-21中任一项的重组细胞，其中相比于野生型对照增加的戊酸的生 物合成包括相比于野生型对照L-天冬氨酸转化为L-苏氨酸中的增加，相比于野生型对照 L-苏氨酸转化为2-酮丁酸中的增加，相比于野生型对照2-酮丁酸延长活性中的增加，相比 于野生型对照2-酮戊酸延长活性中的增加，相比于野生型对照酮酸脱羧酶活性中的增加， 相比于野生型对照对预定底物的酮酸脱羧酶选择性中的增加，或相比于野生型对照醛脱氢 酶活性中的增加。
23. 权利要求2-21中任一项的重组细胞，其中相比于野生型对照增加的2-甲基丁酸的 生物合成包括相比于野生型对照L-天冬氨酸转化为L-苏氨酸中的增加，相比于野生型对 照L-苏氨酸转化为2-酮丁酸中的增加，2-酮丁酸转化为2-酮-3-甲基戊酸中的增加，相 比于野生型对照酮酸脱羧酶活性中的增加，相比于野生型对照对预定底物的酮酸脱羧酶选 择性中的增加，或相比于野生型对照醛脱氢酶活性中的增加。
24. 方法，其包括： 在包含碳源的培养基中在对于重组细胞产生戊酸有效的条件下孵育权利要求1和 3-23中任一项的重组细胞，其中所述碳源包含以下的一种或多种：葡萄糖、丙酮酸、L-天冬 氨酸、L-苏氨酸、2-酮丁酸、2-酮戊酸、2-酮己酸、戊醛、⑶ 2、纤维素、木糖、蔗糖、阿拉伯糖 或甘油。
25. 方法，其包括： 在包含碳源的培养基中在对于重组细胞产生2-甲基丁酸有效的条件下孵育权利要求 2-23中任一项的重组细胞，其中所述碳源包含以下的一种或多种：葡萄糖、丙酮酸、L-天冬 氨酸、L-苏氨酸、2-酮丁酸、2-酮-3-甲基戊酸、2-甲基丁醛、CO 2、纤维素、木糖、蔗糖、阿拉 伯糖或甘油。
26. 方法，其包括： 将编码至少一种催化碳源转化为戊酸的多肽的异源多核苷酸引入宿主细胞，其中将至 少一种多核苷酸可操作地连接于启动子，从而使得经修饰的宿主细胞催化所述碳源转化为 戊酸。
27. 权利要求26的方法，其中所述碳源包含以下的一种或多种：葡萄糖、丙酮酸、L-天 冬氨酸、L-苏氨酸、2-酮丁酸、2-酮戊酸、2-酮己酸、戊醛、CO 2、纤维素、木糖、蔗糖、阿拉伯 糖或甘油。
28. 方法，其包括： 将编码至少一种催化碳源转化为2-甲基丁酸的多肽的异源多核苷酸引入宿主细胞， 其中将至少一种多核苷酸可操作地连接于启动子，从而使得经修饰的宿主细胞催化所述碳 源转化为2-甲基丁酸。
29. 权利要求28的方法，其中所述碳源包含以下的一种或多种：葡萄糖、丙酮酸、L-天 冬氨酸、L-苏氨酸、2-酮丁酸、2-酮-3-甲基戊酸、2-甲基丁醛、CO 2、纤维素、木糖、蔗糖、阿 拉伯糖或甘油。
30. 权利要求24-29中任一项的方法，其中所述宿主细胞是真菌细胞。
31. 权利要求30的方法，其中所述真菌细胞是酵母科的成员。
32. 权利要求31的方法，其中所述真菌细胞是酿酒酵母、皱落假丝酵母或白色念珠菌。
33. 权利要求24-29中任一项的方法，其中所述宿主细胞是细菌细胞。
34. 权利要求33的方法，其中所述细菌细胞是变形菌门的成员。
35. 权利要求34的方法，其中所述细菌细胞是肠杆菌科的成员。
36. 权利要求35的方法，其中所述细菌细胞是大肠杆菌。
37. 权利要求34的方法，其中所述细菌细胞是假单胞菌科的成员。
38. 权利要求37的方法，其中所述细菌细胞是恶臭假单胞菌。
39. 权利要求33的方法，其中所述细菌细胞是厚壁菌门的成员。
40. 权利要求39的方法，其中所述细菌细胞是芽孢杆菌科的成员。
41. 权利要求40的方法，其中所述细菌细胞是枯草芽孢杆菌。
42. 权利要求39的方法，其中所述细菌细胞是链球菌科的成员。
43. 权利要求42的方法，其中所述细菌细胞是乳酸乳球菌。
44. 权利要求39的方法，其中所述细菌细胞是梭菌科的成员。
45. 权利要求44的方法，其中所述细菌细胞是解纤维梭菌。
46. 权利要求33的方法，其中所述细菌细胞是蓝细菌门的成员。
47. 权利要求24-46中任一项的方法，其中所述宿主细胞是光合的。
48. 权利要求24-46中任一项的方法，其中所述宿主细胞是分解纤维素的。
【文档编号】C12N15/52GK104520426SQ201380035331
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年3月13日 优先权日:2012年5月11日
【发明者】张 K., K. 汉德 Y. 申请人:明尼苏达大学评议会