用于从hPSC生成胰腺祖细胞和功能性β细胞的方法和组合物的制作方法

用于从hPSC生成胰腺祖细胞和功能性β细胞的方法和组合物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了用于从内胚层细胞群产生NKX6-1+胰腺祖细胞和/或胰岛素产生的细胞的方法和组合物，所述方法包括使内胚层细胞群与EGF组分、烟酰胺组分和/或Noggin组分接触，任选地与至少一种EGF组分和至少一种烟酰胺组分的组合接触，以诱导至少一个内胚层细胞分化为NKX6-1+胰腺祖细胞，所述组合任选地还包含至少一种Noggin组分。
【专利说明】用于从hPSC生成胰腺祖细胞和功能性β细胞的方法和组 合物

【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于产生ΝΚΧ6-1阳性胰腺祖细胞和功能性胰腺β细胞的方法和组合 物。

【背景技术】
[0002] 从人多能干细胞（hPSC ;包括胚胎干细胞；hESC和诱导性多能干细胞；hiPSC)生 成胰腺祖细胞的能力可以为以下提供人内分泌、外分泌及导管细胞来源：1)预测药物毒理 学和药物发现，2)用于治疗糖尿病的移植，和3)在体外建立正常的胰腺发育和糖尿病发展 模型。为了实现上述目的，要求能够从不同的hESC和hiPSC细胞系繁殖高度富集的胰腺祖 细胞群，并能够促进胰腺祖细胞在体外和体内成熟为产生胰岛素的β细胞。先前的出版物 已报道，可以从hPSC生成产生胰岛素的细胞，然而生成的是多激素（poly-hormonal)细胞。 对这些产生胰岛素的细胞的分析指出，所述产生胰岛素的细胞不表达NKX6-1，这是对功能 性β细胞的发育必不可少的关键转录因子。一项研究已证明从hESC生成NKX6-1 +祖细胞， 表明该NKX6-1+祖细胞被移植入免疫低下的受体后，能够分化为功能性β细胞（Kelly等 2011)。而且，该项研究数据基于两个具有分化为胰腺谱系倾向的hESC细胞系。当应用于 其它细胞系时，该项研究中描述的方案并不能促使NKX6-1+祖细胞的有效发育（Kelly等， 2011)。
[0003] 发明简沭
[0004] 本发明的一个方面包括一种从内胚层细胞群产生NKX6-1+胰腺祖细胞的方法，该 方法包含使内胚层细胞群与EGF组分、烟酰胺组分和/或Noggin组分接触，任选为与至少 一种EGF组分和至少一种烟酰胺组分的组合接触，所述组合的量足以诱导内胚层细胞群的 至少一部分分化为NKX6-1+胰腺祖细胞。
[0005] 在一个实施例中，EGF组分包含EGF和/或其活性缀合物和/或片段；双调蛋 白（Amphiregulin，AR)和/或其活性缀合物和/或片段；转化生长因子a (TGFa)和 /或其活性缀合物和/或片段；Betacellulin(BTC)和/或其活性变体和/或其片段； Epiregulin(EPR)和/或其活性变体和/或片段；神经调节蛋白（包括例如NRG1、NRG2、 3NRG4)和/或其活性变体和/或片段；和/或其两种或更多种的组合。
[0006] 在一个实施例中，烟酰胺组分包含烟酰胺（也被称为尼克酰胺和尼克酸酰胺）、其 盐、溶剂化物和其缀合物；聚（ADP-核糖）合成酶抑制剂，如苯甲酰胺和/或3-氨基苯甲 醜胺（Otonkoski 等，1993) ;Sir_2 抑制剂，如 sirtinol、Μ15、splitomicin (Bitterman 等， 2002);其它 HDAC 抑制剂，如八^9、(：1-994、？1(228、1^0-824、]^275、54祖、丙戊酸、了54、丁酸 钠（Bitterman等，2002)，和/或其两种或更多种的组合。
[0007] 在一个实施例中，Noggin组分包含以下中的一种或多种：Noggin和/或其活性缀 合物和/或片段；BMPRlA和/或其活性缀合物和/或片段；Dorsomorphin和/或其盐或溶 剂化物；LDN 193189,也被称为"DM-3189"，和/或其盐和/或溶剂化物；CH0RDIN和/或其 活性缀合物和/或片段；和/或其两种或更多种的任意组合。
[0008] 在一个实施例中，所述组合包含至少一种Noggin组分；至少一种EGF组分和至少 一种烟酰胺组分。
[0009] 在一个实施例中，至少一种Noggin组分；至少一种EGF组分和至少一种烟酰胺组 分的组合包含Noggin、EGF和烟酰胺（例如NENA)。
[0010] 在一个实施例中，所述方法还包括使所述细胞与Exendin-4组分接触。
[0011] 在一个实施例中,所述方法诱导内胚层细胞群的至少10%、至少15%、至少20%、 至少25 %、至少30 %、至少40 %、至少45 %、至少50 %或至少55 %分化为NKX6-1+胰腺祖 细胞。
[0012] 在一个实施例中，所述方法首先包括产生内胚层细胞群。
[0013] 在一个实施例中，所述产生内胚层细胞群的方法包括步骤（或者子步骤）a、b、c中 的一个或多个；和步骤d，所述步骤包括 ：
[0014] a)使多能干细胞群与以下的组合接触：
[0015] Dnodal激动剂（任选为ActA)和wnt信号传导激动剂（任选为Wnt3a或CIHR 99021)；
[0016] IDnodal激动剂（任选为Act A)、FGF激动剂（任选为bFGF)和任选的wnt信号 传导激动剂（任选为fct3a CIHR 99021);和
[0017] III)nodal激动剂（任选为ActA)和FGF激动剂（任选为bFGF);
[0018] 以产生阶段1分化的细胞；
[0019] b)使阶段1分化的细胞与FGF激动剂（任选为FGF10)和任选的wnt信号传导激 动剂（任选为fct3a)和/或noggin组分（任选为Dorsomorphin)接触，以生成阶段2分 化的细胞；
[0020] C)使阶段2分化的细胞与Noggin组分（任选为Noggin)，维甲酸（RA)或RA类似 物和任选的环巴明-KAAD (Cyc)、FGF激动剂（任选为FGF10)和/或Exendin-4组分（任选 为Exendin-4)接触，以提供内胚层细胞群；和
[0021] d)使内胚层细胞群与EGF组分、烟酰胺组分和/或Noggin组分接触，任选地与包 含至少一种EGF组分和至少一种烟酰胺组分的组合接触，所述组合的量足以诱发内胚层细 胞群的至少一部分分化为NKX6-1+胰腺祖细胞。
[0022] 在一个实施例中，产生NKX6-1胰腺祖细胞的组合还包含至少一种Noggin组分。
[0023] 另一方面，还包括一种用于生成NKX6-1+胰岛素产生细胞的方法，包括：
[0024] A)根据本文所述方法，产生包含NKX6-1阳性胰腺祖细胞的细胞群；和
[0025] b)将细胞群或者NKX6-1富集的或分离的细胞群引入受试者中。
[0026] 还有一个方面包括一种用于生成胰岛素产生细胞的方法，包括：
[0027] A)生成包含NKX6-1阳性胰腺祖细胞的细胞群；
[0028] b)将NKX6-1阳性胰腺祖细胞与CD34+内皮细胞共培养一段时间，所述时间足以获 得胰岛素产生细胞，任选为NKX6-1阳性胰岛素产生细胞。
[0029] 在一个实施例中，所述方法还包括富集或者分离NKX6-1阳性细胞群。
[0030] 在另一个实施例中，所述富集或者分离步骤包括使细胞群与HPx表位检测抗体接 触，和分离或部分纯化HPxl和/或HPx2结合的细胞亚群。
[0031] 另一个方面包括根据本文所述方法产生的富集的和/或分离的NKX6-1阳性细胞 群和适合的稀释剂。
[0032] 在一个实施例中，富集的或分离的NKX6-1阳性细胞群包括至少10%、至少15%、 至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至 少80%或直至约95%的^?6-1阳性细胞。
[0033] 还有一个方面包括一种培养基补充组合物，其包含EGF组分、烟酰胺组分和/或 Noggin组分和任选的Exendin-4组分。
[0034] 另一个方面还提供一种培养基组合物，其包含基础培养基和本文所述培养基补充 剂。
[0035] 进一步的一个实施例包括一种试剂盒，其包含：
[0036] a) EGF 组分，
[0037] b)烟酰胺组分；和/或
[0038] c) Noggin 组分。
[0039] 还提供包含细胞群的组合物，及所述细胞群在预测药物毒理学和药物发现、移植、 糖尿病治疗、组织工程和/或疾病建模中的应用。
[0040] 通过以下详细说明，可以明显看出本发明其它的特点和优点。但是应理解，虽然 所述详细描述和具体实例尽管指示了本发明的优选实施方案，但是它们仅以示例的方式给 出，因为基于此详细描述，本发明的精神和范围内的各种改变和变形对于本领域技术人员 来说均是显而易见的。
[0041] 附图简沭
[0042] 以下结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0043] 图1为胰腺分化方案的例子的示意图；
[0044] 图2的图显示用Noggin、EGF、烟酰胺（NENA)和Exendin-4处理后，从源自hESC的 细胞诱导得到的NKX6-1: GFP+细胞百分比；
[0045] 图3的一系列图显示样品研究中NKX6-1、PDX1、PTFlA和S0X9的mRNA表达水平；
[0046] 图4A的图显示，利用NKX6-lGFP/w HESC细胞系，在Noggin、EGF、烟酰胺（含有或不 含Exendin-4)的存在下培养内胚层细胞，与没有经过上述化合物各种组合的处理相比较， NKX6-1:GFP+细胞的百分比最高。
[0047] 图4B的图显示，利用Hl (WAOl)HESC细胞系，在Noggin、EGF、烟酰胺（含有或不 含Exendin-4)的存在下培养内胚层细胞，与没有经过上述化合物各种组合的处理相比较， NKX6-1+细胞的百分比最高。
[0048] 图5的一系列图显示，利用"NENA处理"生成的NKX6-1细胞具有生成胰岛素产生 细胞的潜力。移植Hl (WAOl)第14天分化的细胞后6周收获的乳腺脂肪垫中的NKX6-1和 胰岛素的免疫组织化学分析（A)。移植Hl (WAOl)第14天分化的细胞后6周收获的乳腺脂 肪垫中的C-肽和胰高血糖素（GCG)的免疫组织化学分析（B)。
[0049] 图6为一系列流式细胞术情况图，显示了 HPx可被用于富集NKX6-1表达细胞。经 过含有或不含有这三种组分的培养在三重处理（Noggin、EGF和烟酰胺）的存在或不存在下 培养的NKXe-I envw hESC细胞系分化的第13天，流式细胞术分析单独的NKX6-1:GFP (A)，并 与hPx⑶和CD142(C)作对比。
[0050] 图7A的图显示，利用荧光激活细胞分选术（FACS)分离HPx2+细胞，与没有经 过分选的细胞（PS =分选前）相比较，富集表达更高NKX6-lmRNA水平的细胞群，这与在 ⑶142 (⑶142+)富集的细胞群中发现的水平类似。
[0051] 图7B的图显示，利用荧光激活细胞分选术（FACS)分离HPx2+⑶142+双阳性细胞， 与没有经过分选的细胞（PS =分选前）相比较，富集表达更高NKX6-lmRNA水平的细胞群。
[0052] 图8A为中胚层第6天的一系列流式细胞术情况图；
[0053] 图8B为CD34+细胞的相图；
[0054] 图8C-D为显示乙酰化LDL摄入的细胞图像；
[0055] 图8E为显示vWF免疫组织化学的图像；
[0056] 图9A为一系列绘制图，上部的图为：在来自第14天培养物的活细胞中，FACS分析 GFP，其中：对照单层细胞（Ctrl)，胶原上的聚集体（Col)和与源自ES的内皮细胞的共培养 物（ES-E)。下部的图：细胞内FACS分析在来自每个培养条件的GFP+细胞群的C-肽。
[0057] 图9B的图显示，在不同的培养条件下，实时QPCR分析胰岛素（INS)和胰高血糖素 (GCG)。数字为相对于F0XA2。
[0058] 图10的图显示，利用荧光激活细胞分选术（FACS)分离HPxl+细胞，与HPxl-细胞 相比较，富集表达更高NKX6-1、S0X9和PTFla mRNA水平的细胞群。
[0059] 图11的图显示，利用"NENA"处理生成的NKX6-1细胞具有生成产生胰岛素的功能 性细胞的潜力。将Hl (WAOl)第13天分化的细胞移植入免疫功能低下小鼠后第6、12和18 周，通过ELISA测量响应于葡萄糖攻击的人C-肽分泌。
[0060] 详细说明
[0061] 本文描述了用于从人多能干细胞（hPSC)有效产生ΝΚΧ6-Γ胰腺祖细胞的强大、可 靠平台，其中使用包括BMP抑制剂（例如Noggin)、烟酰胺和EGF信号传导通路激动剂的因 子的限定组合。类似于本文所述产生的细胞，产生单激素（Monohormonal)胰岛素的β细 胞为ΝΚΧ6-1阳性的。本文利用小鼠移植实验，证实了根据所述方法产生的细胞为单激素和 功能性的。
[0062] 本文还证实，可以从不同的人多能干细胞（hPSC)群分化得到ΝΚΧ6-1+胰腺内分泌 祖细胞。
[0063] 本发明的一个方面包括一种从内胚层细胞群产生NKX6-1+胰腺祖细胞的方法，所 述方法包括使内胚层细胞群与EGF组分、烟酰胺组分和/或Noggin组分接触，任选地与至 少一种EGF组分和至少一种烟酰胺组分的组合接触，以诱导内胚层细胞群的至少一部分分 化为NKX6-1+胰腺祖细胞。
[0064] 在一个实施例中，所述组合还包括至少一种Noggin组分。
[0065] 术语"接触"（例如使内胚层细胞群与一种或多种组分接触）意在包括：将一种或 多种组分与细胞在体外一起孵育（例如在培养的细胞中加入所述化合物），所述接触的步 骤可以以任何合适的方式进行。例如，细胞可以贴壁培养或悬浮培养处理，在时间上，基本 上同时（例如一起存在于混合物中）或顺序（例如从添加第一组分的1个小时内）加入所 述组分。所述细胞还可以与另一试剂例如生长因子或其它分化剂或环境接触，以稳定细胞 或者使细胞进一步分化，并且包括在本领域已知的条件下培养细胞，所述条件例如实施例 中进一步所描述的用于培养多能（和/或分化的）细胞群。
[0066] 本文使用的"内胚层细胞群"是指包括至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、 至少60%、至少70%、至少80%、至少90%的对应于图1阶段3内胚层细胞的细胞群。例 如，内胚层细胞对应于胚胎后前肠细胞群，其至少表达F0XA2,可以呈roxi阴性或阳性。还 可以表达其它因子。所述细胞群可以是NKX6-1阴性的（NKX6-1-)或者表达低水平NKX6-1。 例如，可以采用流式细胞术和分子分析测定所述内胚层细胞群的一个或多个标志物例如 F0XA2。例如所述内胚层细胞群可以为2D(单层）或3D(类胚体或其它聚集体）格式。 [0067] 本文使用的术语"内胚层"是指在非常早期的胚胎中的三个主要的胚芽细胞层中 的一个（其它两个胚芽细胞层为中胚层和外胚层）。所述内胚层为三个细胞层的最内层。 内胚层细胞首先分化产生胚胎肠，而后产生肠道（食管、胃、肠、直肠、结肠）衬里，咽囊衍生 物（扁桃体、甲状腺、胸腺、甲状旁腺），肺，肝，胆囊和胰腺。
[0068] 本文使用的术语"多能干细胞"是指具有在不同条件下分化为超过一种分化的细 胞类型的能力的细胞，例如，分化三个胚芽细胞层的特征性细胞类型的能力，包括胚胎干细 胞和诱导性多能干细胞。例如通过裸鼠畸胎瘤形成实验来表征多能干细胞具有分化为超过 一个细胞类型的能力。通过胚胎干细胞（ES)标志物的表达，可以证实多能性。
[0069] 本文使用的术语"祖细胞"是指具有这样细胞表型的细胞，相对于其能分化产生的 细胞，所述细胞表型相比于完全分化的细胞处于发育途径或进展中较早期步骤。取决于发 育途径和其中细胞发育及分化的环境，祖细胞能产生多个明显不同的分化细胞类型或单一 的分化细胞类型。
[0070] 术语"胰腺祖细胞"是指能够形成以下任意种的细胞：胰腺内分泌细胞（例如产生 胰高血糖素的α -细胞或产生胰岛素的β细胞），或胰腺外分泌细胞（如淀粉酶+和/或 胰蛋白酶+胰腺细胞）或胰腺管细胞。通过添加组分例如EGF组分和烟酰胺组分的组合和 /或由于祖细胞发育的环境，可诱导胰腺内分泌细胞、胰腺外分泌细胞或胰腺管细胞中的一 种或多种的形成或发育。例如，在包括内皮接触的条件下，"ΝΚΧ6-1阳性胰腺多能祖细胞" 能够产生功能性β细胞。同样地，体内注射ΝΚΧ6-1胰腺祖细胞，能够导致此类细胞发育。 还经证实的是，如实施例中所述，ΝΚΧ6-1胰腺祖细胞产生胰岛素产生ΝΚΧ6-1阳性β细胞 和CK-19阳性导管细胞。
[0071] 本文使用的术语"功能性β细胞"是指一种胰腺细胞，其在胰腺中位于成为胰岛 的区域中，为ΝΚΧ6-1阳性和/或roxi阳性的，制造和释放胰岛素。
[0072] 本文使用的术语"干细胞"是指未分化的细胞，其能够增殖、自我更新和产生更多 祖细胞，这些祖细胞具有生成大量的母细胞而母细胞依次能够产生分化子细胞或可分化子 细胞的能力。例如，子细胞能够被诱导增殖并产生后代，其后代随后分化为一个或多个成熟 的细胞类型，而同时还保留一个或多个具有亲本发育潜力的细胞。
[0073] 在细胞的上下文中，术语"分化的（differentiated) "或者"分化 (differentiating)"是相对的术语，"分化的细胞"是指比相比较的细胞进展到沿着发育途 径更进一步的细胞。因此，干细胞可以分化为谱系限制性的前体细胞（如内胚层祖细胞）， 该谱系限制性的前体细胞依次可以分化为其它类型的前体细胞，沿着途径更进一步，进而 再分化为终末分化的细胞，所述终末分化的细胞在某个组织类型中发挥特征性功能，其可 能或不能保留进一步增殖的能力。
[0074] 本文使用的"胚胎干细胞"是指胚胎囊胚内细胞团的多能干细胞（例如见美国专 利No. 5, 843, 780、No. 6, 200, 806)。这些细胞还可以从源自体细胞核转移的囊胚内细胞团 获得（例如见美国专利No. 5, 945, 577、No. 5, 994, 619、No. 6, 235, 970)。胚胎干细胞的区别 特征决定了胚胎干细胞表型。因此，如果细胞具有一个或多个胚胎干细胞的独特特征，其 就拥有胚胎干细胞的表型，使得可以将其与其它细胞区别开来。胚胎干细胞的示例性区别 特征包括但不限于：基因表达谱，增殖能力，分化能力，染色体核型，对特定培养条件的反应 性，诸如此类。
[0075] 术语"表达"是指涉及产生RNA和蛋白质以及当适当时分泌蛋白的细胞过程，当适 当时包括但不限于，例如转录，翻译，折叠，修饰和加工。"表达产物"包括从基因转录的RNA 和通过从基因转录的mRNA的翻译获得的多肽。
[0076] 本文使用的术语"NKX6-1阳性胰腺祖细胞"是指例如源自胰腺内胚层细胞的细胞， 其具有至少分化为产生胰岛素的细胞例如胰腺β细胞的能力。NKX6-1阳性胰腺祖细胞表 达标志物ΝΚΧ6-1，并且与多能干细胞（PSC)相比，其可以表达例如增加水平的roXl、PTFlA 和 S0X9。
[0077] 本文使用的术语"NKX6-1"是指"NK6同源盒1"基因（基因 ID:4825)的mRNA (和 /或任选为cDNA)或蛋白产品，序列，包括蛋白质和mRNA序列（和/或任选为cDNA)，所述 序列通过引用并入本文。
[0078] 如本文所示，使用EGF和烟酰胺处理产生NKX6-1+细胞，通过添加 Noggin (图4) 增加所述NKX6-1+细胞。
[0079] 相应地，在另一个实施例中，所述组合还包含Noggin组分。
[0080] 本文使用的术语"Noggin组分"意为任意的多肽或BMP化合物激动剂，所述多肽或 BMP化合物激动剂通过结合TGF β家族配体抑制TGF- β /BMP家族信号传导，包括但不限于 实施例10中提供的试剂，例如包括Noggin (NOG)如具有基因识别编码（基因 ID :9241)的 人Noggin以及其活性缀合物和片段，包括自然存在的活性缀合物和片段；骨形态发生蛋白 IA型受体（BMPRlA)，例如具有如基因识别编码（基因 ID :657)的人BMPRlA以及其活性缀合 物和片段，包括自然存在的活性缀合物和片段；骨形态发生蛋白IB型受体（BMPRlB)，例如 具有如基因识别编码（基因 ID :658)的人BMPRlB以及其活性缀合物和片段，包括自然存在 的活性缀合物和片段；小分子化学抑制剂Dorsomorphin和其盐、溶剂化物和组合；小分子 化学抑制剂LDN 193189,也被称为"DM-3189"，和/或其盐和/或溶剂化物；和CH0RDIN，例 如具有如基因识别编码（基因 ID :8646)的人CH0RDIN(CHRD)以及其活性缀合物和片段，包 括自然存在的活性缀合物和片段；和/或上述两种或更多种的组合，例如包括包含Noggin 的组合。每一个（例如由基因 ID鉴定的每一个组分）的序列，包括蛋白质和mRNA序列，通 过引用并入此处。
[0081] 本文使用的术语"Noggin"是指具有基因识别编码（基因 ID :9241)的骨形态发生 蛋白拮抗剂，其序列，包括蛋白质和mRNA序列，所述序列通过引用并入本文。
[0082] 所述化合物"Dorsomorphin"包括通式表示的化合物：
[0083]

【权利要求】
1. 一种从内胚层细胞群产生NKX6-1+胰腺祖细胞的方法，所述方法包括使所述内胚层 细胞群与EGF组分、烟酰胺组分和/或Noggin组分接触，任选地与至少一种EGF组分和至 少一种烟酰胺组分的组合接触，以诱导所述内胚层细胞群的至少一部分分化为NKX6-1+胰 腺祖细胞，所述组合任选地还包含至少一种Noggin组分。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述Noggin组分包含以下中的一种或多种： Noggin和/或其活性缀合物和/或片段；BMPR1A和/或其活性缀合物和/或片段；BMPR1B 和/或其活性缀合物和/或片段；Dorsomorphin和/或其盐或溶剂化物；LDN 193189,也被 称为"DM-3189"，和/或其盐或/或溶剂化物；CH0RDIN和/或其活性缀合物和/或片段；和 /或其两种或更多种的任意组合。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中，所述Noggin组分为Noggin。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述EGF组分包含EGF和/或其活性缀合物 和/或片段；双调蛋白（AR)和/或其活性缀合物和/或片段；转化生长因子a (TGF a) 和/或其活性缀合物和/或片段；BetaCellulin(BTC)和/或其活性变体和/或片段； Epiregulin(EPR)和/或其活性变体和/或片段；神经调节蛋白（包括例如NRG1、NRG2、 3NRG4)和/或其活性变体和/或片段；和/或其两种或更多种的组合。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中，所述EGF组分为EGF和/或其活性缀合物和/或 片段。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中，所述EGF缀合物为肝素结合EGF (HB-EGF)。
7. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述烟酰胺组分包含烟酰胺（也被称为尼克酰胺 和尼克酸酰胺）、其盐、溶剂化物和缀合物；聚（ADP-核糖）合成酶抑制剂，例如苯甲酰胺和 /或3-氨基苯甲酰胺；Sir-2抑制剂，例如Sirtinol、M15、splitomicin ;HDAC抑制剂，例如 AN-9、CI-994、FK228、LAQ-824、MS275、SAHA、丙戊酸、TSA、丁酸钠，和/或其两种或更多种的 组合。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中，所述烟酰胺组分为烟酰胺和/或其盐、溶剂化物 和/或缀合物。
9. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一种Noggin组分、至少一种EGF组分和 至少一种烟酰胺组分的组合包含Noggin、EGF和烟酰胺（例如NENA)。
10. 根据权利要求1至9中任一项所述的方法，还包含Exendin-4组分。
11. 根据权利要求10所述的方法，其中，所述Exendin-4组分为Exendin-4。
12. 根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，所述内胚层细胞群分化自多能干 细胞（PSC)，例如胚胎干细胞（ESC)或诱导性多能干细胞（iPSC)。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中，所述多能干细胞为人ESC(hESC)或人 iPSC(hiPSC)。
14. 根据权利要求1至13中任一项所述的方法，首先包括产生内胚层细胞群。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中，所述产生内胚层细胞群的方法包括步骤（或子 步骤）a、b和c中的一个或多个；和步骤d，所述步骤包括： a)使多能干细胞群与以下的组合接触： I) nodal激动剂（任选为ActA)和wnt信号传导激动剂（任选为Wnt3a或CIHR 99021)， II) nodal激动剂（任选为Act A)、FGF激动剂（任选为bFGF)和任选的wnt信号传导 激动剂（任选为Wnt3a CIHR 99021);和 111)11〇(1&1激动剂（任选为4(^4)和？6?激动剂（任选为&?6?);以产生阶段1分化的 细胞； b) 使所述阶段1分化的细胞与FGF激动剂（任选为FGF10)、和任选的wnt信号传导激 动剂（任选为fct3a)和/或noggin组分（任选为Dorsomorphin)接触，以产生阶段2分 化的细胞； c) 使所述阶段2分化的细胞与Noggin组分（任选为Noggin)、维甲酸（RA)或RA类似 物、和任选的环巴胺-KAAD (Cyc)、FGF激动剂（任选为FGF10)和/或Exendin-4组分（任 选为Exendin-4)接触，以提供内胚层细胞群；和 d) 使所述内胚层细胞群与EGF组分、烟酰胺组分和/或Noggin组分接触，任选地与包 含至少一种EGF组分和至少一种烟酰胺组分的组合接触，所述组合的量足以诱导所述内胚 层细胞群的至少一部分分化为NKX6-1+胰腺祖细胞。
16. -种用于生成NKX6-1+胰岛素产生细胞群的方法，所述方法包括： a. 根据权利要求1至15中任一项所述的方法产生包含NKX6-1阳性胰腺祖细胞的细胞 群； b. 将所述细胞群或NKX6-1富集的或分离的细胞群引入受试者中。
17. -种用于生成胰岛素产生细胞的方法，所述方法包括： a. 生成包含NKX6-1阳性胰腺祖细胞的细胞群； b. 将所述NKX6-1阳性胰腺祖细胞与⑶34+内皮细胞共培养。
18. 根据权利要求17所述的方法，其中，根据权利要求1至15中任一项所述的方法产 生所述包含NKX6-1阳性胰腺祖细胞的细胞群。
19. 根据权利要求1至18中任一项所述的方法，所述方法包括富集或分离NKX6-1阳性 细胞群。
20. 根据权利要求19所述的方法，其中，所述富集或分离步骤包括使所述细胞群与HPx 表位检测抗体接触，和分离或部分地纯化HPxl和/或HPx2结合的细胞亚群。
21. 根据权利要求20所述的方法，其中，所述HPx表位检测抗体为HPxl和/或HPx2。
22. -种根据权利要求19至21中任一项所述方法产生的富集的和/或分离的NKX6-1 阳性细胞群和/或包含所述细胞群和适合的稀释剂的组合物。
23. 根据权利要求22所述的富集的NKX6-1阳性细胞群，其包含至少10%、至少15%、 至少20%、至少25%，至少30%、至少35%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%，至 少80%或直至约95%的^?6-1阳性细胞。
24. 根据权利要求23所述的分离的NKX6-1阳性细胞群，其包含至少30%、35%、40% 或至少50%的NKX6-1阳性胰腺祖细胞。
25. 根据权利要求23所述的富集的/分离的NKX6-1阳性细胞群，其包含至少15%、至 少20%、至少25%、至少30%，、至少35%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至 少80%或直至约95%的NKX6-1阳性胰岛素产生细胞。
26. -种培养基补充组合物，其包含EGF组分、烟酰胺组分和任选的Noggin和/或 Exendin-4 组分。
27. -种培养基培养组合物，其包含适合的基础培养基、EGF组分、烟酰胺组分和任选 的Noggin组分和/或Exendin-4组分。
28. -种试剂盒，其包含： EGF组分， 烟酰胺组分，和/或 Noggin组分，和/或 任选的Exendin-4组分。
29. 根据权利要求22至25中任一项所述的细胞群的用途，其用于预测药物毒理学、药 物发现、移植组织工程和/或疾病建模。
【文档编号】C12N5/02GK104411815SQ201380035022
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2013年4月30日 优先权日:2012年4月30日
【发明者】凯勒·G, 诺斯特罗·M·C, 霍尔特辛格尔·A, 萨兰奇·F 申请人:大学健康网络