一种生物法合成异戊二烯醇的方法
【专利摘要】本发明提供了一种重组大肠杆菌菌株以及利用该重组大肠杆菌菌株通过生物法合成异戊二烯醇的方法。本发明通过在大肠杆菌体内构建并改造甲羟戊酸途径(MVA途径)，通过过表达枯草芽孢杆菌的焦磷酸酶，使工程大肠杆菌菌株可以高特异性地合成异戊二烯醇。
【专利说明】一种生物法合成异戊二烯醇的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及异戊二烯醇化合物的生物合成，具体地涉及一种重组大肠杆菌工程菌株、该工程菌株的制备方法以及利用该重组大肠杆菌工程菌株合成异戊二烯醇的方法。
【背景技术】
[0002]异戍二烯醇(Isoprenol)又名3_甲基_3_ 丁烯-1-醇，甲基_3_ 丁烯-1-醇是一种重要的有机合成中间体，可用于合成聚羧酸类混凝土减水剂以及低毒、高效的拟除虫菊醋杀虫剂。合成MBOH的传统工艺为在SnCl4, ZnCl2等催化剂作用下，异丁烯与甲醛经PrinS缩合反应得到。该工艺使用的催化剂对设备腐蚀严重且不易与产物分离，污染环境。固体碱、离子液体和分子筛等催化剂可用于Prins缩合反应，能有效解决上述问题。耿艳霞等以叔丁醇为溶剂，采用固体碱催化异丁烯与甲醛进行Prins缩合反应，在200°C下反应4h，甲醛转化率达到90%，异戊二烯醇选择性为92%。宋河远等(宋河远，唐中华，陈静.功能化酸性离子液体催化甲醛与烯烃的Prins缩合反应.分子催化，2008，22 (5) =403-407)以离子液体为催化剂考察了异丁烯与甲醛水溶液的Prins缩合反应，在80°C、5MPa下反应5h，甲醛转化率为51.8 %，对4，4- 二甲基-1，3- 二氧六环的选择性为45.9 %。目前用于合成MBOH的分子筛催化剂主要有ZSM系列分子筛。但与均相氯化物催化剂相比，分子筛催化剂的反应活性较低，如采用ZSM系列分子筛催化剂，在102°C、1.0MPa下反应7h，甲醛转化率仅为58.2%，烯醇(异戊二烯醇及其异构体)的总选择性为79.8%，而且催化剂的稳定性较差，不能用于工业化生产。
[0003]因此，为这种有价值的化合物的生产提供更有效更绿色的方法将是本【技术领域】的进步。一种有可能的解决方法是利用生物合成途径来生产异戊烯醇和异戊二烯醇。工程大肠杆菌具有生长速度快、发酵 周期短、遗传背景清楚、易于工程化操作、可利用廉价的可再生资源等特点，因此工程大肠杆菌作为生物催化剂已成为近年来生产生物基化学品的有效手段。Genencor和Goodyear公司则是将外源的MVA途径重组入大肠杆菌细胞中，进而再利用MVA途径的终产物二甲基丙烯基焦磷酸作为直接前体来转化生产异戊二烯(美国专利公开，2009/0203102)。MVA途径首先在甲基戊二酰辅酶A合成酶和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的作用下利用糖来合成甲羟戊酸，然后甲羟戊酸再在甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的作用下转化为异戊烯基焦磷酸(IPP)，IPP再在异戊烯基焦磷酸异构酶的作用下转化为二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)。
[0004]Wither等鉴定了一种来源于枯草芽孢杆菌的焦磷酸酶基因，并通过体内和体外反应进行了其功能，发现其能够水解IPP和DMAPP生成异戊烯醇和异戊二烯醇(Wither etal，2007)，但没有对其底物特异性进行研究，也没有对异戊烯醇和异戊二烯醇生产途径进行优化。但是，为了特异性生产异戊二烯醇，需要对烯醇生物合成途径进行代谢工程改造，该发明首次通过表达部分MVA途径，即不表达异戊烯基焦磷酸异构酶来特异性合成IPP，阻止IPP到DMAPP的转化，以尽量避免产物中引入3-甲基-2- 丁烯-1-醇等杂质。
【发明内容】
[0005]为解决上述现有技术中存在的问题，本发明主要通过代谢工程改造甲羟戊酸途径(MVA途径)，特别是过量表达来源于枯草芽孢杆菌的焦磷酸酶，从而在工程大肠杆菌中实现了选择性生产异戊二烯醇单一组分。通过该方法，获得了产物纯度超过99%以上的异戊二烯醇，实现了异戊二烯醇的高特异性生产。
[0006]因此，在第一个方面，本发明提供了一种重组大肠杆菌菌株，其包含:
[0007](1)编码羟甲基戊二酰辅酶A合成酶的基因片段和编码羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因片段或分别与羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因具有70%以上同源性的核酸分子；
[0008](2)编码甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的基因片段或分别与甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶具有70%以上同源性的核酸分子；
[0009](3)编码焦磷酸酶的基因片段，或与焦磷酸酶基因具有70%以上同源性的核酸分子，或与焦磷酸酶基因无明显同源性但其表达产物能够水解异戊烯基焦磷酸的核酸分子。
[0010]在第二个方面，本发明提供了一种制备重组大肠杆菌菌株的方法，该方法包括以下步骤:
[0011](I)制备包含羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因片段或与羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因具有70%以上同源性的核酸序列的重组质粒A ;
[0012](2)将重组质粒A与羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因片段或与羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因具有70%以上同源性的核酸序列连接成重组质粒B ；
[0013](3)制备包含甲羟戊酸激酶基因片段、磷酸甲羟戊酸激酶基因片段和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因片段或分别与甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶具有70%以上同源性的核酸分子的重组质粒C ；
[0014](4)制备包含焦磷酸酶基因片段，或与焦磷酸酶基因具有70%以上同源性的核酸分子，或与焦磷酸酶基因无明显同源性但其表达产物能够水解异戊烯基焦磷酸的核酸分子的重组质粒D ；
[0015](5)将重组质粒B、C和D共同转化大肠杆菌感受态细胞，通过筛选获得含有三种重组质粒的工程重组大肠杆菌菌株。
[0016]在第三个方面，本发明提供了一种合成异戊二烯醇的方法，该方法包括将本发明的工程重组大肠杆菌菌株在适宜于其生长的条件下在包含合适的碳源和诱导剂的培养基中进行培养，在培养过程中不断通入空气，从尾气中分离包含异戊二烯醇的产物。
[0017]本发明的有益效果如下:
[0018]1.本发明的方法可以以可再生糖类为原料。
[0019]2.根据本发明的菌株制备方法制备的工程大肠杆菌菌株可以获得单一组分的异
戊二烯醇。
[0020]3.根据本发明的异戊二烯醇生物合成方法，异戊二烯醇的摇瓶培养产量超过
1.3g/L。
[0021]4.本发明经济、绿色，从根本上解决了目前异戊二烯醇生产中存在的原料不可持续、污染严重、成本高等瓶颈问题。【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1图示了本发明的大肠杆菌体内选择性合成异戊二烯醇的途径。
[0023]图2图示了通过本发明的方法生产的异戊二烯醇的气相色谱图，其中图2A为异戊醇和异戊二烯醇标准品的峰，图2B为通过本发明生产的异戊醇和异戊二烯醇的峰。
[0024]图3A和图3B分别是异戊二烯标准品通过GC-MS测定时采集到的总离子流色谱图和质谱图。
[0025]图4A和图4B分别是E.coli YY159工程菌株经过摇瓶或发酵罐培养后所获得的中间产物异戊二烯醇在氧化铝的催化下加热反应生成的终产物通过GC-MS测定时采集到的总离子流色谱图和质谱图。
[0026]图5是pISP213重组质粒的构建流程图。
[0027]图6是pISP214重组质粒的构建流程图。
[0028]图7是pISP9重组质粒的构建流程图
[0029]图8是pYY15重组质粒的构建流程图。
【具体实施方式】
[0030]本发明通过基因工程在大肠杆菌细胞中引入HMG-CoA合成酶基因，HMG-CoA还原酶基因，甲羟戊酸激酶基因、磷酸甲羟戊酸激酶基因和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因来重建甲羟戊酸途径(MVA途径)，同时通过过量表达来源于枯草芽孢杆菌的焦磷酸酶，从而在工程大肠杆菌中实现了选择性生产异戊二烯醇和异戊烯醇。
[0031]在一个优选实施方案中，提供了一种重组大肠杆菌菌株，其包含以下几种核酸分子:
[0032](I)编码羟甲基戊二酰辅酶A合成酶的基因片段和编码羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因片段，所述基因片段任选地与本领域公知的抗生素抗性基因可操作地连接；
[0033](2)编码甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的基因片段，上述基因片段以上述次序连接并任选地与本领域公知的抗生素抗性基因可操作地连接；
[0034](3)编码焦磷酸酶的基因片段，该基因片段任选地与本领域公知的抗生素抗性基因可操作地连接。
[0035]优选地，所述羟甲基戊二酰辅酶A合成酶和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶分别由来源于幾肠球菌(Enterococcus faecalis)的HMG-CoA合成酶基因mvaS和HMG-CoA还原酶基因mvaE编码；所述甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶分别由来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的甲轻戍酸激酶基因ERG12,甲轻戍酸磷酸激酶基因ERG8和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因MVDl编码；所述焦磷酸酶由来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的焦磷酸酶基因BsNudF编码,或由来源于其它生物体的与所述大肠杆菌焦磷酸酶基因同源性超过70%的核酸分子编码，或由与枯草芽孢杆菌焦磷酸酶基因无明显同源性但其表达产物能够水解异戊烯基焦磷酸的核酸分子编码。优选地，所述焦磷酸酶或不同于焦磷酸酶的能够水解异戊烯基焦磷酸的表达产物在本发明的重组大肠杆菌中是过量表达的。
[0036]在另一个优选的实施方案中，提供了一种制备重组大肠杆菌菌株的方法，该方法包括以下步骤:
[0037](I)制备包含任选地与本领域公知的抗生素抗性基因可操作地连接的羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因片段的重组质粒A ；
[0038](2)将重组质粒A与任选地与本领域公知的抗生素抗性基因可操作地连接的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因片段连接成重组质粒B ；
[0039](3)制备包含任选地与本领域公知的抗生素抗性基因可操作地连接的甲羟戊酸激酶基因片段、磷酸甲羟戊酸激酶基因片段和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因片段的重组质粒C，其中所述基因片段以上述次序连接；
[0040](4)制备包含任选地与本领域公知的抗生素抗性基因可操作地连接的焦磷酸酶基因片段的重组质粒D ;
[0041](5)将重组质粒B、C和D共同转化大肠杆菌感受态细胞，通过筛选获得含有三种重组质粒的工程重组大肠杆菌菌株。
[0042]优选地，所述羟甲基戊二酰辅酶A合成酶和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因分别是来源于幾肠球菌(Enterococcus faecalis)的HMG-CoA合成酶基因mvaS和HMG-CoA还原酶基因mvaE ;所述甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶分别是来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的甲轻戍酸激酶基因ERG12,甲轻戍酸磷酸激酶基因ERG8和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因MVDl ;所述焦磷酸酶基因是来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的焦磷酸酶基因BsNudF，或来源于其它生物体的与所述枯草芽孢杆菌焦磷酸酶基因同源性超过70%的核酸分子，或与大肠杆菌焦磷酸酶基因无明显同源性但其表达产物能够水解异戊烯基焦磷酸的核酸分子。优选地，所述焦磷酸酶基因，或其表达产物能够水解异戊烯基焦磷酸 的核酸分子在本发明的重组大肠杆菌中被过量表达。
[0043]在本发明的制备重组大肠杆菌菌株的方法中，质粒或载体的构建以及转化感受态细胞的方法不受限制，可以采用本领域中已知的常规方法。
[0044]上述重组质粒A、B、C和D中的抗生素抗性基因可以是相同的或不同的。所述抗生素抗性基因可以选自本领域中公知的抗生素抗性基因，例如，氯霉素、氨苄霉素、卡那霉素、四环素等等。通过不同的抗生素抗性基因组合可以更高效和准确地筛选出包含上述三个重组质粒或表达载体的工程大肠杆菌。
[0045]在本发明的制备重组大肠杆菌菌株的方法中，筛选利用各种重组质粒所具有的抗生素抗性来进行，即根据不同的筛选阶段可以在平板培养基中添加与相应重组质粒所具有的抗生素抗性对应的抗生素或抗生素组合。
[0046]在另一个优选的实施方案中，提供了一种合成异戊二烯醇的方法，该方法包括将本发明的重组大肠杆菌菌株在适宜于其生长的条件下在包含合适的碳源和诱导剂的培养基中进行培养，在培养过程中不断通入空气，从尾气中分离包含异戊二烯醇的产物。
[0047]优选地，所述碳源可以是糖类、甘油(例如，生物柴油或制皂工艺的副产物)、油类(例如，植物油诸如棉籽油、棕榈油或大豆油)、动物脂肪、脂肪酸(例如不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸或多不饱和脂肪酸)、脂质、磷脂、甘油酯(例如，甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯等)、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)，可再生碳源(例如，生物质碳源诸如可水解的生物质碳源)、酵母提取物、来自酵母提取物的成分、聚合物、酸、醇、醛、酮、氨基酸、琥珀酸酯、乙酸酯等。在本发明中，碳源优选是可再生糖类，如水解生物质，包括甘蔗渣、玉米秸杆、木浆、转化糖、光合作用产物(包括，但不限于葡萄糖)，以及其它单糖(例如，果糖、甘露糖、半乳糖、木糖或阿拉伯糖等)、二糖、多糖等。
[0048]在本发明的生物合成异戊二烯醇的方法中，可使用适合于工程大肠杆菌的中等至大规模培养的任何液体培养基，例如M9液体培养基,在所述液体培养基中可以添加与所述工程大肠杆菌的抗生素抗性相对应的抗生素或组合以提高生长选择性，例如，如果在工程大肠杆菌的筛选过程中分别使用了氯霉素、氨苄霉素和卡那霉素三种抗生素，则在生物合成过程(例如摇瓶培养或发酵罐培养)中，在培养基中可以添加上述三种抗生素。此外，在本发明的生物合成过程中，可以在培养基中添加常规的诱导剂例如IPTG以进行诱导培养。
[0049]根据本发明的菌株制备方法制备的工程大肠杆菌菌株可以获得单一组分的异戊二烯醇。
[0050]根据本发明的异戊二烯醇生物合成方法，异戊二烯醇的摇瓶培养产量超过1.3g/L0
[0051]定义和缩写
[0052]在本文中使用下列的缩写或简称:
[0053]甲羟戊酸途径:MVA途径
[0054]羟甲基戊二酰辅酶A =HMG-CoA
[0055]大肠杆菌(Escherichiacoli):Ε.coli
[0056]枯草芽抱杆菌(Bacillussubtilis):Β.subtilis [0057]“基因片段”在本文中根据具体的使用场合应理解为是与体内特定基因序列相对应的分离的核酸分子或核酸序列，而非存在于生物体体内的基因组内的基因片段。
[0058]“可操作地连接”指在表达调控元件和受调控序列(例如基因)的多核苷酸之间的功能连接，使得受调控序列在适于表达该受调控序列的条件下表达，从而产生所期望的肽或多肽。例如，表达调控元件可以是转录调控元件如启动子、增强子序列和其他顺式作用元件等。
[0059]“过量表达”或“过表达”是指特定基因在生物体中的表达超过正常水平(即，野生型表达水平)，例如，通过增强内源表达或引入外源基因来实现。
[0060]保藏说明:
[0061]根据本发明的制备方法制备的一株工程重组大肠杆菌菌株于2012年02月08日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC N0.5746，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。
[0062]以下将以实施例方式，以工程大肠杆菌生产异戊二烯醇为例，详细描述本发明:
[0063]实施例1
[0064]通过在大肠杆菌(E.coli)中共同过量表达来源于粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)的 HMG-CoA 合成酶基因(mvaS) (SEQ ID NO:1)和 HMG-CoA 还原酶基因(mvaE)(SEQ ID NO:2),来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的甲轻戍酸激酶基因(ERG12)，甲羟戊酸磷酸激酶(ERG8)，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因(MVDl)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)焦磷酸酶基因(BsNudF) (SEQ ID NO:3)，所得到的工程大肠杆菌可以利用糖来生物合成异戊二烯醇，所得到的异戊二烯醇在Al2O3的催化下加热脱水生成终产物异戊二烯。[0065]1.1外源基因的克隆和表达载体的构建
[0066]1.1.1外源基因的克隆
[0067]1.1.1.1 幾肠球菌(Enterococcus faecalis)HMG-CoA 合成酶基因的克隆
[0068]按照细菌基因组提取试剂盒(购自OMEGA，Cat.N0.D3350-01)提供的操作步骤，提取 Enterococcus faecalis (购自 ATCC, N0.29212)的基因组 DNA,根据 GenBank 序列设计引物，PCR扩增HMG-CoA合成酶基因mvaS，G1:9937382。PCR扩增采用的引物序列如下:
[0069]mvaS-F
[0070]5’-CCAGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGGATTGATAAAATTA(SEQ ID NO:5)
[0071]mvaS-R:5，-CAACTGCAG-TTAGTTTCGATAAGAGCGAACG(SEQ IDNO:6)
[0072]PCR反应条件如下:94°C预变性3分钟，然后94°C变性30秒，48_58°C退火30秒，72°C延伸1-4分钟，以上变性、退火、延伸三步重复进行35个循环后，最后72°C延伸10分钟。利用胶回收试剂盒(购自Fermentas，Cat.N0.K0692)回收目的基因片段。
[0073]1.1.1.2 幾肠球菌(Enterococcus faecalis)HMG-CoA 还原酶基因的克隆
[0074]按照细菌基因组提取试剂盒(购自OMEGA，Cat.N0.D3350-01)提供的操作步骤，提取粪肠球菌(^Enterococcus faecalis)的基因组DNA,根据GenBank序列设计引物，PCR扩增烯酰-CoA水解酶基因mvaE，G1:9937382。PCR扩增采用的引物序列如下:
[0075]mvaE-F:
[0076]5，-CATGCCATGGGCATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC(SEQ IDNO:7)
[0077]mvaE-R:5，-CGCGGATCC-TTAGTTTCGATAAGAGCGAACGGT(SEQID NO:8)
[0078]PCR反应条件如1.1.1.1。利用胶回收试剂盒(购自Fermentas, Cat.N0.K0692)回收目的基因片段。
[0079]1.1.1.3 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)甲轻戍酸激酶基因 ERG12,憐酸甲羟戊酸激酶基因ERG8和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因MVDl的克隆
[0080]将酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)甲轻戍酸激酶基因 ERG12 (GeneID:855248)，磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8 (GeneID =855260)和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因MVDl (GeneID =855779)三个基因的序列依次排列在一起，通过化学合成制备。化学合成由生工生物工程(上海)有限公司完成。总序列见序列表ERG12-ERG8-MVD1(SEQ ID NO:4)。
[0081]1.1.1.4枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)焦磷酸酶基因BsNudF的克隆
[0082]按照细菌基因组提取试剂盒(购自OMEGA，Cat.N0.D3350-01)提供的操作步骤，提取 B.subtilis BU169(购自 ATCC，ATCC N0.10774)的基因组 DNA，根据 GenBank 序列设计引物，PCR扩增来源于B.subtilis的焦磷酸酶基因BsNudF, Gene ID:938719。PCR扩增采用的引物序列如下:
[0083]BsNudF-F:5，-CTAGCCATGGGCATGAAATCATTAGAAGAAAAAAC(SEQ ID NO:9)
[0084]BsNudF-R:5’ -CAGGGATCCTCATTTTTGTGCTTGGAGCG (SEQ IDNO: 10)
[0085]PCR反应条件如1.1.1.1。利用胶回收试剂盒(购自Fermentas, Cat.N0.K0692)回收目的基因片段。。
[0086]1.1.2表达载体的构建
[0087]1.1.2.lpISP213载体的构建(构建过程参见图5)[0088]将胶回收后的mvaE基因与pACYQ)uet_l载体(购自Novagen)分别用NcoI和BamHI进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1: 5的比例，4°C连接过夜或16°C连接4~6h，连接产物42°C热激转化E.coli DH5 α感受态细胞(购自TaKaRa，TaKaRa Code D9057)，然后涂布加有氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆。PCR扩增引物为mvaE-F和mvaE-R(见上)，反应条件如1.1.1.1。按照细菌质粒小量提取试剂盒(购自OMEGA，Cat.N0.D6942-02)提供的操作步骤，从阳性克隆中提取重组质粒pISP213后，再通过限制性酶切和测序验证。
[0089]1.1.2.2pISP214载体的构建(构建过程参见图6 )
[0090]将胶回收后的mvaS基因与pISP213载体用SacI和PstI进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1: 5的比例，4°C连接过夜或16°C连接4~6h，连接产物42°C热激转化E.coli DH5a 感受态细胞(购自 TaKaRa, TaKaRa Code D9057)，然后涂布加有 34 μ g.ml/1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆。PCR扩增引物为mvaS-F和mvaS-R(见上)，反应条件如1.1.1.1。按照细菌质粒小量提取试剂盒(购自OMEGA, Cat.N0.D6942-02)提供的操作步骤，从阳性克隆中提取重组质粒PISP214后，再通过限制性酶切和测序验证。
[0091]1.1.2.3pISP9载体的构建(构建过程参见图7)
[0092]将化学法合成的ERG12-ERG8-MVD1用的Xhol和PstI进行双酶切。pTrcHis2B载体用的Xhol和PstI进行双酶切。酶切后的载体与外源片段按摩尔比1: 5的比例，4°C连接过夜或16°C连接4~6h，连接产物42°C热激转化E.coli DH5 α感受态细胞(购自TaKaRa, TaKaRa Code D9057)，然后涂布加有50 μ g.ml/1氨苄霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆。PCR 扩增引物 ISP9-F(5’-TTT GCCAGATATTGGAAGTG-3’)(SEQ ID NO:11)和ISP9-R(5，-CGTGCAGTAAAGTTA GATGA-3，) (SEQ ID NO:12)，反应条件如 1.1.1.1。按照细菌质粒小量提取试剂盒(购自0MEGA，Cat.N0.D6942-02)提供的操作步骤，从阳性克隆中提取重组质粒PISP9后，再通过限制性酶切和测序验证。
[0093]1.1.2.4pYY15载体的构建(构建过程参见图8)
[0094]将胶回收后的BsNudF基因与pCOLADuet-Ι载体(购自Novagen)用NcoI和BamHI进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1: 5的比例，4°C连接过夜或16°C连接4~6h，连接产物42°C热激转化E.coli DH5a感受态细胞(购自TaKaRa，TaKaRa Code D9057)，然后涂布加有50μ g.mL—1卡那霉素素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆。PCR扩增引物为BsNudF-F和BsNudF-R(SEQ ID NO:9和10)，PCR反应条件如1.1.1.1。按照细菌质粒小量提取试剂盒(购自0MEGA，Cat.N0.D6942-02)提供的操作步骤，从阳性克隆中提取重组质粒PYY15后，再通过限制性酶切和测序验证。。
[0095]1.2E.coli YY159重组菌株的构建
[0096]pISP214，pISP9和pYY15三个重组质粒共同42°C热激转化E.coliBL21 (DE3)感受态细胞(购自Invitrogen，SKU#C6000_03)，涂布加有氯霉素，氨苄霉素和卡那霉素三种抗生素的LB固体平板，平板上长出的单菌落即为含有三个表达载体的工程大肠杆菌E.coliYY159(已保藏为 CGMCCN0.5746)。
[0097]1.3工程大肠杆菌Ε.coli YY159的摇瓶培养
[0098]将Ε.coli YY159按1: 100的比例接种到装有M9液体培养基(0.6%磷酸氢二钠，0.3 %磷酸二氢钾，0.1 %氯化铵，0.05 %氯化钠，0.025 %硫酸镁，3 %葡萄糖)的摇瓶中，培养基中含有50 μ g.ml/1的卡那霉素，100 μ g.ml/1的氨节霉素和34 μ g.ml/1氯霉素，37°C，225rpm条件下振荡培养，当OD6tltol为0.6-0.8时，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mmol.L-1~1.0mmol.L'然后在25~30°C, 180~225rpm条件下,继续诱导培养 24-72h。
[0099]1.4工程大肠杆菌E.coliYY159的发酵罐培养 [0100]将E.coliYY159按1: 100的比例接种到装有M9液体培养基的发酵罐中，培养基中含有50 μ g ?mU1的卡那霉素和34 μ g.mL_1氯霉素,在温度为37°C,溶氧为10% -30%,PH为6.0-8.0条件下培养，当OD6tltlnm为2~20时，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度
0.1mmol ?1-1 ~1.0mmol.171,然后在温度为 25°C _37°C，溶氧为 10% -30%，pH 为 6.0-8.0条件下，继续诱导培养24-72h，期间不断补加葡萄糖，并控制残糖量在0.1% -0.3%。
[0101]实施例2异戊二烯醇的合成
[0102]2.1异戊二烯醇产物分离(以下的测定结果以CGMCC N0.5746菌株为例)
[0103]发酵过程中不断通入空气，尾气会将发酵液中的异戊二烯醇不断带出，将尾气进行低温冷却，尾气中的水和异戊二烯醇产物将被冷凝下来，从而得到浓缩的异戊二烯醇产物，最后得到的异戊二烯醇通过蒸馏和水分离。
[0104]2.2异戊二烯醇产物测定
[0105]将2.1中得到的异戊二烯醇通过气相色谱(GC)和气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对其进行分析测定。GC采用CP-FFAP CB毛细管色谱柱(25mX 0.25mm ;0.2 μ m)，方法为50°C维持I分钟，50C /分钟程序升温至100°C，然后25°C /分钟升温至250°C。GC-MS采用Agilent HP-1NNOffax 毛细管色谱柱(30mX 0.32mm, 0.25 μ m.)，方法为 50°C维持 2 分钟，然后10°C/分钟程序升温至240°C，240°C维持3分钟。实验结果显示，样品峰的保留时间(图2A)和异戊二烯醇标准品(购自梯希爱，货号:M0726)峰的保留时间(图2B) —致，证明工程大肠杆菌E.coli YY159可以生产异戊二烯醇，摇瓶产量超过1.3g/L。
[0106]2.3异戊二烯的生产
[0107]以Al2O3作为催化剂，将在2.1中分离的异戊二烯醇在300°C以上的温度下进行加热脱水，即可以获得异戊二烯。得到的异戊二烯通过Agilent5975C GC-MS系统对其进行分析。采用Agilent DB-5毛细管色谱柱(50m，0.25mm，0.25 μ m)，方法为40°C维持I分钟，然后5°C /分钟程序升温至80°C，继续25 V /分钟升温至300°C，300°C维持5分钟。实验结果显示，样品峰的保留时间(图4A)和异戊二烯标准品(购自TCI，产品编码:10160)峰的保留时间(图3A) —致，而且样品峰的质谱图(图4B)和标准谱图库中异戊二烯标准品的质谱图(图3B) —致，因此证明了异戊二烯的产生，同时也说明了该方法确实能够利用糖类原料来合成异戊二烯。
【权利要求】
1.一种重组大肠杆菌菌株，其包含: (1)编码羟甲基戊二酰辅酶A合成酶的基因片段和编码羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因片段或分别与羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因具有70%以上同源性的核酸分子； (2)编码甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的基因片段或分别与甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶具有70%以上同源性的核酸分子； (3)编码枯草芽孢杆菌焦磷酸酶的基因片段，或与枯草芽孢杆菌焦磷酸酶基因具有70%以上同源性的核酸分子。
2.一种制备重组大肠杆菌菌株的方法，该方法包括以下步骤: (1)制备包含羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因片段或与羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因具有70%以上同源性的核酸序列的重组质粒A ； (2)将重组质粒A与羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因片段或与羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因具有70%以上同源性的核酸序列连接成重组质粒B ； (3)制备包含甲羟戊酸激酶基因片段、磷酸甲羟戊酸激酶基因片段和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因片段和或分别与甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶具有70%以上同源性的核酸分子的重组质粒C ； (4)制备包含焦磷酸酶基因片段，或与焦磷酸酶基因具有70%以上同源性的核酸分子，或与焦磷酸酶基因无明显同源性但其表达产物能够水解异戊烯基焦磷酸的核酸分子的重组质粒D ； (5)将重组质粒B、C和D共同转化大肠杆菌感受态细胞，通过筛选获得含有三种重组质粒的工程重组大肠杆菌菌株。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述重组质粒B、C和D分别包含与表达调控元件可操作地连接的不同的抗生素抗性基因片段。
4.一种合成异戊二烯醇的方法，该方法包括将权利要求1所述的重组大肠杆菌菌株在适宜于其生长的条件下在包含合适的碳源和诱导剂的培养基中进行培养，在培养过程中不断通入空气，从尾气中分离包含异戊二烯醇的产物。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组大肠杆菌或方法，其中所述羟甲基戊二酰辅酶A合成酶和轻甲基戍二酰辅酶A还原酶分别由来源于粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)的HMG-CoA合成酶基因mvaS和HMG-CoA还原酶基因mvaE编码。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组大肠杆菌或方法，其特征在于所述甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶分别由来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的甲羟戊酸激酶基因ERG12，甲羟戊酸磷酸激酶基因ERG8和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因MVDl编码。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的重组大肠杆菌或方法，其特征在于所述焦磷酸酶由来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的焦磷酸酶基因BsNudF编码，或由来源于其它生物体的与所述枯草芽孢杆菌焦磷酸酶基因同源性超过70%的核酸分子编码，或由与枯草芽孢杆菌焦磷酸酶基因无明显同源性但其表达产物能够水解异戊烯基焦磷酸的核酸分子编码。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的方法，其特征在于所述碳源是可再生糖类，如水解生物质，包括甘蔗渣、玉米秸杆、木浆、转化糖，以及单糖、二糖、多糖等。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的重组大肠杆菌或方法，其特征在于所述焦磷酸酶基因在所述大肠杆菌中过量表达。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的重组大肠杆菌或方法，其特征在于所述重组大肠杆菌是保藏号为CGMCC N0.5746的大肠杆菌菌株。
【文档编号】C12N1/21GK103540557SQ201210243033
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2012年7月12日 优先权日:2012年7月12日
【发明者】咸漠, 郑艳宁 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所