一种特异的阴道毛滴虫巢氏pcr检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种特异的阴道毛滴虫巢氏PCR检测试剂盒，用于阴道毛滴虫的诊断和检测。提供了阴道毛滴虫G3粘附蛋白AP51-3基因诊断序列，根据该序列设计引物，通过优化扩增条件来提高其敏感性，电泳分析直接观察扩增结果。本发明巢氏PCR检测试剂盒设计严谨，简单易操作，灵敏性高，特异性强，能鉴定阴道毛滴虫感染，结果判定准确客观。
【专利说明】—种特异的阴道毛滴虫巢氏PCR检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及阴道毛滴虫的诊断和检测技术，更确切地说是提供了一种特异的阴道毛滴虫巢氏PCR检测试剂盒，属于寄生虫检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]阴道毛滴虫病是由阴道毛滴虫引起人兽共患的一种非病毒性性传播疾病。阴道毛滴虫主要引起男、女泌尿生殖系统疾病；也可引起孕妇流产、早产、胎膜早破、低体重儿及围产期感染；此外，阴道毛滴虫感染可以增加HIV，淋病等性传播疾病的感染机率，更可增加女性癌症发病率。
[0003]阴道毛滴虫培养方法作为诊断的金标准。Diamond’s培养基是培养阴道毛滴虫比较完善的方法，但并未普及。目前，阴道毛滴虫病的诊断及检测方法主要有病原学诊断和免疫学诊断等。其中，病原学检测阴道毛滴虫最常用的方法是湿片镜检法，此法费时、费力，且检出率低；免疫学检测方法主要有间接血凝试验(IHA)、免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、单克隆抗体(McAb)等方法； 但存在敏感性低等问题。而分子生物学PCR诊断方法具有灵敏度高等优点广泛用于病原的检测。目前临床上尚无阴道毛滴虫PCR检测试剂盒的应用。因此，开发一种特异且灵敏高的阴道毛滴虫巢氏PCR检测试剂盒已是迫在眉睫。
【发明内容】
[0004]本发明提供了一种特异的阴道毛滴虫巢氏PCR检测试剂盒，用于阴道毛滴虫的诊断和检测。
[0005]本发明提供的阴道毛滴虫G3粘附蛋白AP51-3基因诊断序列，如SEQ ID NO:1所
/Jn ο
[0006]本发明还公开了的一种特异的阴道毛滴虫巢氏PCR检测试剂盒，是通过以下方法制成的:
(1)DNA裂解液:含不同浓度的NaCl、Tris-HCl、EDTA、SDS和蛋白酶K的混合溶液； 其中，浓度配比为:NaCl IOOmM,Tris-HCl (pH 7.5) 20Mm、EDTA 25 Mm,SDS 2% (w/v)和
蛋白酶 K 0.1 μ g/ μ I ；
(2)PCR反应液:终浓度各100-300μΜ的4种dNTPs，终浓度各IO-1OOpmol/μ I的上游引物(F1),下游引物(R1)，内侧上游引物(F2)，内侧下游引物(R2)，1.5-4.5mM的Mg2+浓度；Taq酶按每个PCR反应(20 μ I)含2.0 U加入，反应液中不含Taq酶；
(3)阴道毛滴虫巢氏特异性引物:
F1: GCCCGTAACTTCAACATCC
R1:TCCTCAACACCGTTCTCGT
F2:AAGGCTCAGGTCTACTGTGGT
R2:ATTGTCTGGGCAACTTCCTCT(4)阳性对照:阳性对照为阴道毛滴虫基因组DNA，比较PCR产物以及监测PCR操作过程是否正确。
[0007]本发明的试剂盒还可以含有琼脂糖(Agarose)、溴酚蓝点样缓冲液和Taq酶，其浓度优选为溴化乙锭IOyg/μ I ;溴酚蓝点样缓冲液和Taq酶5U/yl。也还可以含有PCR反应管。
[0008]本发明所述的一种特异的阴道毛滴虫巢氏PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤:
I)样本的预处理:将标本3000r/min, IOmin,弃上清，留取沉淀。
[0009]2)样本DNA的提取:
(1)将上述沉淀转移到1.5ml离心管中，加入Iml裂解液，在液氮和65°C水浴中反复冻融二次；
(2)将冻融后的样品加入5-6μ I (20mg/ml)蛋白酶K，使其终浓度为lOOyg/ml。混匀后在65°C水浴中浸泡2h;
(3)用酹:氯仿:异戍醇(24:25:1)进行抽提两次,7000r/min离心10分钟；
3)PCR扩增:
(1)准备待检样品数+2的PCR反应管，管内包括PCR液、Taq酶等，盖紧盖子，在涡旋器上混匀备用；
(2)将阴性和阳性对照分别加入标记好的管中，然后把样品依次加入并标记好，置于PCR仪中。第一轮PCR条件为:95°C预变性5min、94°C变性45s、57°C退火45s、72°C延伸30s，共30个循环，后72°C延伸IOmin ;第二轮PCR条件为:95°C预变性5min、94°C变性45s、55°C退火45s、72°C延伸30s,共30个循环，后72°C延伸IOmin.4)PCR产物观察:
称取琼脂糖，用电泳液混匀后(0.8%-1.0%)在微波炉中加热三分钟。等胶冷却后在加样孔中分别加样，100V电压下电泳10分钟，之后在紫外灯下观察实验结果。第一轮PCR产物571bp，第二轮PCR产物377bp。(见附图1)
本发明的积极效果在于:提供了阴道毛滴虫G3粘附蛋白AP51-3基因诊断序列，根据该序列设计引物，通过优化扩增条件来提高其敏感性，电泳分析直接观察扩增结果。本发明巢氏PCR检测试剂盒设计严谨，简单易操作，灵敏性高，特异性强，能鉴定阴道毛滴虫感染，结果判定准确客观。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1:巢氏PCR产物图；
图2:二引物特异性摸索；
图3:二重PCR引物(H和C)浓度配比摸索；
图4:一重PCR体系敏感性摸索；
图5:二重PCR体系敏感性摸索。
[0011]【具体实施方式】:
实施例1
阴道毛滴虫特异性检测与诊断序列:阴道毛滴虫G3粘附蛋白AP51-3部分基因序列。见序列表1。
[0012]实施例2
根据实施例1阴道毛滴虫G3粘附蛋白AP51-3部分基因序列设计特异性巢氏PCR检测引物如下:
F1: GCCCGTAACTTCAACATCC
R1:TCCTCAACACCGTTCTCGT
F2:AAGGCTCAGGTCTACTGTGGT
R2:ATTGTCTGGGCAACTTCCTCT ；
以上两种引物在不同体系中(巢氏PCR)能扩增出特异的检测基因片断，目的条带明亮，无非特异性杂带。实现检测阴道毛滴虫的目的。
[0013]实施例3
阴道毛滴虫PCR检测试剂盒，组成结构如下:
(I)DNA裂解液:含不同浓度的NaCl、Tris-HCl、EDTA、SDS和蛋白酶K的混合溶液。各浓度配比为:NaCl lOOmM、Tris-HCl (pH 7.5) 20Mm、EDTA 25 Mm、SDS 2% (w/v)和蛋白酶 K
0.1 μ g/μ I。裂解液的作用是将尿液中有核细胞(白细胞、上皮细胞等)裂解并消化其中的蛋白质，释放出基因组DNA。
[0014](2)PCR反应液:终浓度各100-300 μ M的4种dNTPs,终浓度各IO-1OOpmol/ μ I的引物F1 R1 F2 R2,1.5-4.5mM的Mg2+浓度。Taq酶按每个PCR反应(20 μ I)含2.0 U加入，反应液中不含Taq酶。`
[0015](3)阳性对照:本发明的试剂盒所用阳性对照为阴道毛滴虫基因组DNA，其作用是比较PCR产物以及检测PCR操作过程是否正确。
[0016]此外，本发明的试剂盒还可以含有琼脂糖(Agarose)、溴酚蓝点样缓冲液和Taq酶，其浓度优选为溴化乙锭IOyg/μ I ;溴酚蓝点样缓冲液和Taq酶5U/yl。还可以含有PCR反应管。
[0017]实施例4
本发明试剂盒PCR反应条件的优化过程为:
二对引物各自浓度的优化:设置引物在体系的终浓度梯度为:0.5μΜ、1μΜ、1.5μΜ、2 μ Μ、2.5 μ Μ、3 μ Μ，用此区间的引物尝试都得到相应的扩增，其中当引物量为IOpmol (引物的贮存浓度为20ρπιΟ1/μ 1，取0.5μ I)终浓度为0.5 pmol/μ I时效果最佳。
[0018]二对引物各自退火温度的优化:第一轮设置引物的退火温度分别为:49°C、51°C、53°C、55°C、57 °C、59°C、61°C、63°C，实验发现57° C退火温度最佳。第二轮设置引物的退火温度分别为:49°C、51°C、53°C、55°C、57 °C、59°C、61°C、63°C，实验发现 55° C 退火温度最佳。
[0019]二对引物各自dNTPs浓度的优化:设置每种dNTPs (each)浓度梯度为:50μΜ、100μΜ、250μΜ、350μΜ、400μΜ。，在这个浓度段里都得到不错的扩增，其中在浓度为250 μ M时两引物均有最佳扩增。
[0020]二对引物各自Mg2+浓度的优化:设置Mg2+终浓度梯度为:lnM、l.5 ηΜ、2 ηΜ、3 ηΜ、
4ηΜ、5 ηΜ，其中浓度在1.5 mM时两引物均有最佳扩增。
[0021]两引物最佳酶浓度的摸索:设置酶浓度梯度为:0.5U、1U、2U、3U、4U，两引物在此浓度段时均有不错的扩增，但在2U时两引物均得到最优化的扩增。[0022]PCR体系条件的摸索:PCR体系的Mg2+终浓度为3mM，dNTPs (each)的终浓度为500 μ Μ，酶浓度为2U，第一轮退火温度为57°C，第二轮退火温度为55°C.引物C的浓度为0.5pmol/μ 1，引物H的终浓度为0.5pmol/y I (见附图3)。
[0023]实施例5
采集吉林地区的248份尿液标本，分别用尿沉渣镜检和巢氏PCR检测方法对样品进行
检测
(一)尿沉渣镜检
收集尿液标本，至于离心机上3000r/min, IOmin0弃上清,混匀沉洛,取其约20ul均匀涂于片上，至于高倍显微镜下查找阴道毛滴虫。
[0024](二)PCR 检测 I)样本的预处理:将标本3000r/min, IOmin,弃上清，留取沉淀。
[0025]2)样本DNA的提取:
(1)将上述沉淀转移到1.5ml离心管中，加入Iml裂解液，在液氮和65°C水浴中反复冻融二次；
(2)将冻融后的样品加入5-6μ I (20mg/ml)蛋白酶K，使其终浓度为lOOyg/ml。混匀后在65°C水浴中浸泡2h;
(3)用酹:氯仿:异戍醇(24:25:1)进行抽提两次,7000r/min离心10分钟；
3)PCR扩增:
(1)准备待检样品数+2的PCR反应管，管内包括PCR液、Taq酶等，盖紧盖子，在涡旋器上混匀备用；
(2)将阴性和阳性对照分别加入标记好的管中，然后把样品依次加入并标记好，置于PCR仪中。第一轮PCR条件为:95°C预变性5min、94°C变性45s、57°C退火45s、72°C延伸30s，共30个循环，后72°C延伸IOmin ;第二轮PCR条件为:95°C预变性5min、94°C变性45s、55°C退火45s、72°C延伸30s,共30个循环，后72°C延伸IOmin.4)PCR产物观察:
称取琼脂糖，用电泳液混匀后(0.8%-1.0%)在微波炉中加热三分钟。等胶冷却后在加样孔中分别加样，100V电压下电泳10分钟，之后在紫外灯下观察实验结果。第一轮PCR产物 571bp，第二轮 PCR 产物 377bp。
[0026](三)尿沉渣镜检和PCR检测结果
经尿沉渣镜检和PCR检测248份尿液标本，结果发现尿沉渣镜检法检出阳性标本为O例,而PCR检测方法共检出阳性标本为60例。
[0027]试验例I 试剂盒的组成
裂解液(NaCl IOOmM, Tris-HCl(pH 7.5) 20mM、EDTA 25 mM、SDS 2% (w/v)和蛋白酶 K
0.1μ g/μ l)20ml ;PCR反应液10管(20μ I体系)，其中各自dNTPs的浓度为250μΜ、上游引物，下游引物，内侧上游引物，内侧下游引物的终浓度各为0.5 pmol/μ l，Mg2+终浓度为1.5mM ；4g琼脂糖；50 μ I溴化乙锭(20 μ g/μ 1)；0.5%溴酚蓝点样缓冲液50 μ I ;10 μ I Taq酶(5υ/μ I) ；1支阴道毛滴虫基因组DNA阳性对照。
[0028]试验例2试剂盒特异性试验
取阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis),微小隐抱子虫parvum)、
蓝氏贾第虫 (Giardia lamblia)、艾美尔球虫 iEimeria tenella)、弓形虫 (Toxoplasmagoflt/ii入新抱子虫6V<ms/7ora caninum)，热紀Trypanosoma lewisi),人的基因组为模板，用建立的扩增体系分别对其进行扩增。
[0029]将阴性和阳性对照分别加入标记好的管中，然后把样品依次加入并标记好，置于PCR仪中。第一轮PCR条件为:95°C预变性5min、94°C变性45s、57°C退火45s、72°C延伸30s，共30个循环，后72°C延伸IOmin ;第二轮PCR条件为:95°C预变性5min、94°C变性45s、55°C退火45s、72°C延伸30s，共30个循环，后72°C延伸IOmin.扩增产物用0.8%的琼脂糖进行电泳分析，在凝胶成像系统上观察结果。
[0030]结果显示(见附图2):仅有阴道毛滴虫可以呈出377bp条带，其它样本均无扩增，符合特异检测标准。
[0031]试验例3
试剂盒敏感性试验
将提取出的总核酸在核酸分析仪上定量，分别将浓度稀释到第个反应体系中的含量为100ng、10 ng、l ng、0.1 ng、0.01 ng、0.001 ng、0.0001 ng。反应条件同特异性检测实施例，同时设阴性对照。产物用0.8%的琼脂糖进行电泳分析，在凝胶成像系统上观察结果。结果表明F1, R1引物的检测阈值为0.1ng(IOOpg)(见附图4)，且二重PCR检测的F2, R2阈值分为0.0Olng(Ipg)(见附图5),完全符合敏感性检测标准。
[0032]试验例4
试剂盒的稳定性和重复性试验
阳性模板，PCR反应液，EX Taq酶在-200C条件下贮存，裂解液、溴酚蓝等其它物品40C保存即可。当贮存时间为30天、60天、100天、150天、200天时取出各组分，用已知PCR阳性的样品检测试剂盒稳定性。另外，15份PCR阳性样本用此试剂盒重复试验3次，15份PCR阴性样本同样重复3次，扩增条件如前所述。结果表明在以上各时段取出的组分在已知PCR阳性样品和15份PCR阳性样本均得到了两条明亮特异的目的带，而空白对照和15份阴性样品均无任何扩增带，故此试剂盒稳定性和重复性良好。
[0033]试施例5 试剂盒的保质期试验
将分别在4°C和_20°C贮存I个月、3个月、5个月、7个月和10个月的试剂盒取出并对已知阳性样品进行检测。扩增及检查方法同前，结果表明在4°C和-20°C条件下保存达10月之久的试剂盒依然能扩增出清晰的目的条带，无杂带。
【权利要求】
1.一种阴道毛滴虫G3粘附蛋白AP51-3基因诊断序列，如SEQ ID NO:1所示。
2.一种特异的阴道毛滴虫巢氏PCR检测试剂盒，是通过以下方法制成的: 1)DNA裂解液:含不同浓度的NaCl、Tris-HCl、EDTA、SDS和蛋白酶K的混合溶液； 其中，浓度配比为:NaCl IOOmM,Tris-HCl (pH 7.5) 20Mm、EDTA 25 Mm,SDS 2% (w/v)和蛋白酶 K 0.1 μ g/ μ I ； 2)PCR反应液:终浓度各100-300μ M的4种dNTPs，终浓度各IO-1OOpmol/ μ I的上游引物(F1),下游引物(R1),内侧上游引物(F2),内侧下游引物(R2), 1.5-4.5mM的Mg2+浓度;Taq酶按每个PCR反应(20 μ I)含2.0 U加入，反应液中不含Taq酶； 3)阴道毛滴虫巢氏特异性引物:
F1: GCCCGTAACTTCAACATCC
R1:TCCTCAACACCGTTCTCGT
F2:AAGGCTCAGGTCTACTGTGGT
R2:ATTGTCTGGGCAACTTCCTCT ； 4)阳性对照:阳性对照为阴道毛滴虫基因组DNA，比较PCR产物以及监测PCR操作过程是否正确。
3.一种特异的阴道毛滴虫巢氏PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤: 1)样本的预处理:将标本3000r/min,IOmin,弃上清，留取沉淀； 2)样本DNA的提取: (1)将上述沉淀转移到1.5ml离心管中，加入Iml裂解液，在液氮和65°C水浴中反复冻融二次； (2)将冻融后的样品加入5-6μ I (20mg/ml)蛋白酶K，使其终浓度为100 μ g/ml ;混匀后在65°C水浴中浸泡2h; (3)用酹:氯仿:异戍醇(24:25:1)进行抽提两次,7000r/min离心10分钟； 3)PCR扩增: (1)准备待检样品数+2的PCR反应管，管内包括PCR液、Taq酶等，盖紧盖子，在涡旋器上混匀备用； (2)将阴性和阳性对照分别加入标记好的管中，然后把样品依次加入并标记好，置于PCR仪中；第一轮PCR条件为:95°C预变性5min、94°C变性45s、57°C退火45s、72°C延伸30s，共30个循环，后72°C延伸IOmin ;第二轮PCR条件为:95°C预变性5min、94°C变性45s、55°C退火45s、72°C延伸30s,共30个循环，后72°C延伸IOmin.4)PCR产物观察: 称取琼脂糖，用电泳液混匀后(0.8%-1.0%)在微波炉中加热三分钟；等胶冷却后在加样孔中分别加样，IOOV电压下电泳10分钟，之后在紫外灯下观察实验结果；第一轮PCR产物 571bp，第二轮 PCR 产物 377bp。
【文档编号】C12Q1/68GK103757108SQ201410013902
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月13日 优先权日:2014年1月13日
【发明者】张西臣, 于艳辉, 李建华, 宫鹏涛, 王力, 刘丽, 张国才, 杨举, 张楠, 李 赫, 杨正涛 申请人:吉林大学