巢氏pcr支原体检测用引物组、检测试剂盒及其使用方法

专利名称：：巢氏pcr支原体检测用引物组、检测试剂盒及其使用方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，尤其涉及巢氏PCR支原体检测用引物组、检测试剂盒及其使用方法。
背景技术：
：支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(最小直径O.2um)并独立生活的微生物，约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁形态呈高度多形性，可为圆形、丝状或梨形。支原体形态多变，在光境下不易看清内部结构。电镜下观察支原体膜为三层结构，其中央有电干密度大的密集颗粒群或丝状的中心束。支原体多吸附或散在于细胞表面和细胞之间。横断面与细胞微绒毛相似，但微绒毛电子密度比支原体小，且中央无颗粒群或中央束。支原体代谢需固醇类物质、部分种类需要精氨酸或葡萄糖，每一种支原体都有自身持点。多数支原体适合于偏碱条件下生存(PH7.6-8.0)，对酸耐受性差，对热比较敏感，对一般抗生素不敏感。细胞培养(特别是传代细胞)被支原体污染是个世界性问题。在细胞培养中支原体感染发生率达到63%。支原体污染细胞后，培养液可不发生混浊，多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解，因此易被忽视。但个别严重者，可致细胞增殖缓慢，甚至从培养器皿脱落。国内外研究表明，95%以上的污染是由以下四种支原体引起口腔支原体(M.orale)、精氨酸支原体(M.arginini)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)和莱氏无胆甾原体(A.laidlawii)。但能够污染细胞的支原体种类是很多的，国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染(一些支原体在人体是正常菌群)、培养基的污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。目前检测有无支原体污染的方法主要有①相差显微境检测；②荧光染色法；③电镜检查；④DNA分子条文检查或支原体培养等方法，但上述方法有的精确度不够，有的则方法过于复杂。巢式PCR检测支原体的方法灵敏度高，特异性强，检测快速，但是现有的巢氏PCR支原体检测试剂盒有对实验环境要求严格，实验成本相对较高，有时还会出现假阳性的现象的缺陷。
发明内容本发明的目的在于提供一套快速检测支原体的巢氏PCR支原体检测引物组及试剂盒。本发明的另外目的在于提供巢氏PCR支原体检测试剂盒的使用方法及其应用。本发明一方面提供了一种巢氏PCR支原体检测用引物组，包括外引物组与内引物组，外引物组的正向引物序列为5'-GATCCATGGGAGCTGGTAATGC-3'(SEQIDNO:1)，反向引物序列为5'-AGCGTTCATCGACTTTCAGACCCA-3'(SEQIDNO:2);内引物组的正向引物序列为5'-TCATGTTCTTTGAAAACTGAATATCG-3'(SEQIDNO:3)，反向引物序列为5'-CAAGGCATCCACCAAAAACTC-3'(SEQIDNO:4)。本发明第二方面提供了一种巢氏PCR支原体检测试剂盒，包括上述引物组。本发明的试剂盒是采用高灵敏性的巢式PCR技术来进行支原体检测。原核生物的rRNA操纵子上编码rRNA的DNA间隔区，如16s和23s间隔区，各种生物种间的碱基序列差别很大，而支原体各个种间在这一段既有保守又有差异部分，在16s和23s上设计一对引物(Fl和Rl)扩增16S和23S基因间区域，在16s23s序列保守区和23s上设计另外一对引物(F2和R2)进行巢式PCR，进行扩增，根据扩增情况可分析来判断支原体污染情况。因此，外引物组与内引物组的设计是本发明试剂盒的关键。基于试剂盒采用的是巢式PCR技术来进行检测的，所以试剂盒中还可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，如Taq酶、PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTPs等常用PCR反应试剂中的一种或多种。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。所述试剂盒中还含有阳性对照。阳性对照含有支原体16s和23s间隔区保守序列，可为含有支原体16s和23s间隔区保守序列的质粒，可采用现有支原体检测试剂盒中的阳性对照，也可单独市购或根据现有技术自行构建。所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为各种不含有支原体DNA序列的溶液，如PCR缓冲液、无菌水、生理盐水等。更佳的，所述试剂盒中还可含有内部对照。内部对照的存在可辅助判断PCR体系本身有没有问题。内部对照的作用是与支原体的DNA序列形成竞争关系，当没有支原体污染时，可以扩增出条带，当有污染时，它被抑制不被扩增。内部对照可为满足下列条件的人工序列，该人工序列与支原体16s和23s间隔区的序列无关，且可以被试剂盒的内外引物组扩增，并且扩增片段大小能与支原体的扩增片段明显区分。本
技术领域：
的技术人员可根据现有技术设计出符合上述条件的各种人工序列用作内部对照，如上游从外引物正向序列开始，下游到外引物反向序列结束，中间为与支原体16s和23s间隔区无关的序列且包括内引物的正向序列与外引物的反向序列。内部对照在现有的支原体检测试剂盒中也已被广泛使用。本发明第三方面，公开了上述试剂盒用于检测支原体污染的用途。所述支原体污染可以是培养基、D-Hanks液、细胞以及实验室环境中的支原体污染。所述支原体包括各禾中支原体如A.Laidlawii、M.hyorhinis、M.arginini、M.hominis、M.salivari咖、M.orale、M.fermentans、M.pirum等。用了本发明的引物PCR扩增后，不同的支原体与扩增条带之间的对应关系如下表所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>本发明第四方面，公开了上述试剂盒的使用方法，包括下列步骤1.将待检样本煮沸后离心；2.分别以步骤1离心后的上清及阴性对照为模板，外引物组为引物进行第一轮PCR扩增；再分别以第一轮PCR的扩增产物及阳性对照为模板，内引物组为引物进行第二轮PCR扩增；3.将第二轮PCR扩增产物上电泳，根据电泳扩增条带情况判断是否污染支原体或污染支原体的种类。较佳的，上述第一轮PCR的反应条件为第一循环94°C2分钟；而后94°C30秒，62°C1分钟，72t:1分钟，共30个循环；最后72°C10分钟后冷却。较佳的，上述第二轮PCR的反应条件为第一循环94°C2分钟；而后94°C30秒，53°C30秒，72。C30秒，共30个循环；最后72°C10分钟后冷却。较佳的，上述第一轮PCR扩增的反应体系中加有内部对照。较佳的，上述第一轮PCR及第二轮PCR的反应体系为5XBufferlOiil;dNTP3iU;引物2.5iU;Taq酶O.5iU;模板2iU;总体积50iU;其余用灭菌双蒸水补平。上述第一轮PCR反应体系中如加入内部对照，则内部对照的加量为2ul。由于巢式PCR容易被污染，因此检测前需用消毒酒精擦拭所有实验器材与物料，再用去支原体喷雾剂喷洒重要物料与器材，擦拭器材表面以彻底去除环境中的支原体。所述样本可为细胞培养上清、细胞培养缓冲液、血清、培养箱水槽中的水或其他细胞培养相关的液体试剂。支原体经过煮沸后其DNA片段会溶于离心后的上清中。本发明优点本发明的巢氏PCR支原体检测试剂盒具有极高的特异性，所含引物能特异性扩增支原体rRNA的保守区域，并可同时分辨多种支原体，扩增效率高，条带清晰，不会扩增细胞5基因组，大大提高了检测速度，操作简便而且成本低，用于检测所需的样品量极少，可同时高通量对样品进行检测。图1:内部对照浓度优化的电泳结果图A:PC1000倍稀释B:PC10000倍稀释C:PC100000倍稀释D:PC1000000倍稀释E:无PCIC由原液浓度390ng/ul稀释所得，条带从左至右，分别依次为稀释1000倍，104倍，105倍，2xl05倍，4xl05倍，8xl05倍，lxlO6倍，2xl06倍，4xl06倍，8xl06倍图2:阳性对照浓度优化的电泳结果图最左列的条带为Marker,其余条带从左至右，第一个条带对应PC原液稀释100倍的样品，之后分别对应在此基础上PC再逐一稀释10倍的样品图3:本发明试剂盒与市购试剂盒检测比较电泳结果图左侧条带1-8为本发明试剂盒电泳结果，右侧条带1-8为市购试剂盒电泳结果条带编码分别对应不同样本1:293T2:H12993:SGC_79014:HCCLM35:H印3B6:Panc-l7:IC8:PC图4:巢氏PCR支原体检测试剂盒灵敏度检测电泳结果图条带1-9均上样2ul，1-8最终的拷贝数依次为lxl08，lx107……，10。逐步10倍稀释8个梯度的阳性质粒，条带9对应2ul只含有1个拷贝数的阳性质粒图5:巢氏PCR支原体检测试剂盒检测支原体污染电泳结果图图6:巢氏PCR支原体检测试剂盒检测支原体污染电泳结果图具体实施例方式以下列举具体实例以进一步阐述本发明，应理解，实例并非用于限制本发明的保护范围。实施例1:巢氏PCR支原体检测试剂盒制备1.内外引物组的合成设计巢式PCR检测内外引物组，经筛选比较后获得下列可同时鉴别多种支原体的高特异性引物序列外引物组的正向引物序列为5'-GATCCATGGGAGCTGGTAATGC-3'，反向引物序列为5'-AGCGTTCATCGACTTTCAGACCCA-3';内引物组的正向引物序列为5'-TCATGTTCTTTGAAAACTGAATATCG-3'，反向引物序列为5'-CAAGGCATCCACCAAAAACTC-3'。采用常规方法合成上述弓I物。2.阳性对照和阴性对照阳性对照购自上海吉凯基因，浓度250ng/ul。阴性对照无菌水。3.内部对照序列如下内部对照采用常规方法合成。4.试剂盒的装配将上述合成的引物分别置于密闭容器中或配对混合后分别置于密闭容器，将阴性对照与阳性对照分别置于密闭容器，装配获得试剂盒。试剂盒中还可装配入内部对照。也可按需要与其他独立置于密闭容器中的PCR常用试剂一起装配入试剂盒。5.试剂盒的条件优化第一轮PCR体系5XBuffer(Mg2+)10ii1;dNTP3ii1;引物2.5ii1;Taq酶O.5ii1;模板21;内部对照21;总体积501;其余用灭菌双蒸水补平。第二轮PCR体系5XBuffer(Mg2+)10ii1;dNTP3ii1;引物2.5ii1;Taq酶O.5ii1;模板21;总体积501;其余用灭菌双蒸水补平。第一轮PCR的反应条件第一循环94t:2分钟；而后94"30秒，62°C1分钟，72°C1分钟，共30个循环；最后72°C10分钟后冷却。第二轮PCR的反应条件第一循环94。C2分钟；而后94°C30秒，53°C30秒，72°C30秒，共30个循环；最后72°C10分钟后冷却。(—)内部对照(InternalControl)浓度的优化InternalControl在支原体检测试剂盒中的作用是当没有污染时，可以扩增出条带，当有污染时，它被抑制。恰当浓度的InternalControl可以提高试剂盒的准确性。实验设计用一系列稀释的IC(InternalControl)和不同浓度的PC(PositiveControl)做PCR，当PC浓度提高后，IC会被抑制。实验目的找到一个IC浓度，既能在PC低浓度时，有明显条带，又能在PC高浓度时被抑制。结果见图1。从图1可以看到，左数第四，五个孔在PC低浓度时，条带较明显，而高浓度时，条带消失。它们的稀释倍数分别是200000倍和600000倍，采用同样的方法进一步优化得到最理想的浓度是300000倍稀释。(二)阳性对照(PositiveControl)浓度的优化在确定IC浓度的基础上，我们将高浓度PositiveControlDNA进行了7个浓度的10倍稀释，进行PCR检测，检测结果如图2。最终确定PC在高浓度稀释100倍的时候，效果最好。实施例2巢氏PCR支原体检测试剂盒灵敏度检测采用实施例1制备的试剂盒检测梯度稀释的阳性对照。逐步10倍稀释8个梯度，最后一个稀释样品取2ul只含有1个拷贝数的阳性质粒)。PCR体系及检测条件同实施例1试验结果如图4，结果表明，当拷贝数〉100时，PCR可以检测出阳性样品，说明灵敏度高。实施例3巢氏PCR支原体检测试剂盒与现有试剂盒的比较试验内容采用等量的阳性样本，同时采用实施例1制备的巢氏PCR支原体检测试剂盒与市购的支原体检测试剂盒(华大天源微探TM支原体检测试剂盒)进行检测并在相同条件下同时电泳，比较结果。试验方法实施例1制备的试剂盒检测条件参考实施例1的体系及PCR条件。市购支原体检测试剂盒的检测条件参考其说明书。检测对象在细胞培养过程中发现细胞生长明显减慢，细胞表面随便增加，黑色颗粒状物质增多，细胞容易飘起死亡，使用华大试剂盒检测出有污染，从而验证支原体污染呈阳性的6个样品，它们包括293T细胞，H1299细胞，SGC-7901细胞，HCCLM3细胞，H印3B细胞，Panc-l细胞。试验结果检测结果如图3，将6个样品进行PCR检测对比试验，与现有试剂盒相比，对于同样的检测样本，检测结果相符，同时条带更清晰，PCR效率更高，杂带更少，例如以HCCLM3细胞样本对应的检测结果来看，在等量样本的情况下，本发明试剂盒的扩增条带就比现有的试剂盒条带清晰很多。上述结果表明本发明的试剂盒特性更强，检测范围更广。实施例4巢氏PCR支原体检测试剂盒检测支原体污染实验目的通过巢式PCR技术检测细胞平台日常实验过程中培养基，D-Hanks液，细胞以及实验室环境中的支原体污染情况，找到污染源从而控制支原体污染途径，使细胞在无支原体影响的条件下做出客观与科学的实验数据；对后期支原体快速诊断试剂盒的开发提供有力数据。实验器材超镜台水浴锅离心机负80度冰箱PCR仪电泳槽凝胶成像仪电泳仪无菌PCR管无菌1.5mlEP管PCR管架无菌枪头棉球移液器(lml200ul10ul2ul)实验试剂无菌超纯水待检样品75%消毒酒精去支原体喷雾剂实施例1制备的试剂盒，包括PCR弓I物Taq酶5xBuffer(Mg2+)dNTPPositiveControlDNAInternalControlDNA2%琼脂糖胶EB电泳缓冲液Mark(DL250+)6xLoadingBuffer实验步骤1.收集需要检测的样品，负80度冰箱保存2.95度沸水浴中煮待检样品510min，12000转每分钟离心2min3.用75%消毒酒精擦拭所有实验器材与物料，再用去支原体喷雾剂喷洒重要物料与器材，均匀擦拭表面以彻底去除环境中的支原体4.取出PCR管若干，1.5mlEP管若干，放置备用5.稀释引物，PC与IC质粒到适当浓度6.配置第一轮PCR体系总管，然后每管48ul分装到事先准备的PCR管内，其中需添加水对照与IC对照7.加入待检样品，振荡器上混匀后进行第一轮PCR8.第一轮PCR结束后，配置第二轮PCR体系总管，然后每管48ul分装到事先准备的PCR管内，其中需添加PC对照9.加入第一轮PCR产物，振荡器上混匀后进行第二轮PCR10.结束后加入LoadingBuffer,配置2%琼脂糖胶，上样进行电泳，拍照PCR体系同实施例1第一轮循环1循环94°Cfor2min30循环cycle94°Cfor30sec62°Cforlmin72°Cforlmin1循环72°CforlOmin冷却至4"第二轮循环1循环94°Cfor2min30循环e94°Cfor30sec53°Cfor30sec72°Cfor30secl循环72°CforlOmin冷却至4"实验结果与分析(电泳结果如图5所示)上样编号(下列所有细胞对应的样本均为该细胞的培养上清)l:D-Hanks缓冲液2:1640完全培养基3:DMEM完全培养基4:DMEM完全培养基(加入Mycoplasma-0UT)5:293T细胞6:MCF-7细胞7:panc-l细胞8:SGC-7901细胞9:H1299细胞10:D-Hanks缓冲液0138]11:1640完全培养基0139]12掘细胞(力口入Mycoplasma-OUT)0140]13:RK0细胞0141]14:MHCC-97-H细胞(1)(刚复苏的)OH2]15;MHCC-97-H细胞(2)(复苏以后传代5次)0143]16:HCCLM3细胞0144]17:GS-2细胞0145]18:HEY细胞0146]19:阴性对照0147]20:PC0148]21:IC0149]M:Mark0150]PCR结果达到预期的效果0151]1.从1921号PCR条带可以看出，整个体系没有受到支原体的污染，IC与PC都出现在理论大小的位置，说明整个实验过程中水，样品与实验环境都是支原体呈阴性0152]2.5号与8号样品呈阳性属于重度污染，7号、9号与16号属于轻度污染，其余样品正常。0153]实施例5巢氏PCR支原体检测试剂盒检测支原体污染0154]实验目的0155]实施例4用巢式PCR支原体快速检测试剂盒检测出细胞平台日常实验过程中的一些工具细胞有支原体污染，实验中的阳性与阴性样品都很正常，而严格的环境处理也排除了外界污染的可能性，因此判断这些细胞本身带有支原体或者保种过程中就已经受到了支原体的污染，检测后期再使用支原体去除试剂对检测有污染可能的细胞进行了一个周期的处理，然后收集上清再次通过该试剂盒检测，发现所有支原体扩增条带区域全部转阴，阳性与阴性样品一切正常，事实证明绝大部分支原体已经被彻底杀灭。实验器材超镜台水浴锅离心机负80度冰箱PCR仪电泳槽凝胶成像仪电泳仪无菌PCR管无菌1.5mlEP管PCR管架无菌枪头棉球移液器(lml200ul10ul2ul)实验试剂无菌超纯水待检样品75%消毒酒精去支原体喷雾剂Mycoplasma-OUTGerm-freetestmedium实施例1制备的试剂盒(包括PCR引物Taq酶5xBuffer(Mg2+)dNTPPositiveControlDNAInternalControlDNA)2%琼脂糖胶EB电泳缓冲液Mark(DL250+)6xLoadingBuffer实验步骤1.收集需要检测的样品，负80度冰箱保存2.95度沸水浴中煮待检样品5lOmin，12000转每分钟离心2min3.用75%消毒酒精擦拭所有实验器材与物料，再用去支原体喷雾剂喷洒重要物料与器材，均匀擦拭表面以彻底去除环境中的支原体4.取出PCR管若干，1.5mlEP管若干，放置备用5.稀释引物，PC与IC质粒到适当浓度6.配置第一轮PCR体系总管，然后每管48ul分装到事先准备的PCR管内，其中需添加水对照与IC对照7.加入待检样品，振荡器上混匀后进行第一轮PCR8.第一轮PCR结束后，配置第二轮PCR体系总管，然后每管48ul分装到事先准备的PCR管内，其中需添加PC对照9.加入第一轮PCR产物，振荡器上混匀后进行第二轮PCR10.结束后加入LoadingBuffer,配置2%琼脂糖胶，上样进行电泳，拍照PCR体系及条件同实施例4实验结果与分析(电泳结果如图6所示)上样编号13:293T细胞(复苏后)；293T细胞(加药前)；293T细胞(加药后)46:panc-l细胞(复苏后)；panc-1细胞(加药前)；panc-1细胞(加药后)79:SGC-7901细胞(复苏后)；SGC-7901细胞(加药前)；SGC-7901细胞(加药后)1012:H1299细胞(复苏后);H1299细胞(加药前);H1299细胞(加药后)1315:IC;IC+PC;PC其中"复苏后"的样品是上一轮PCR的剩余上清；"加药前"的样品是细胞复苏传了4-5传后，用含有双抗的完全培养基培养到密度达到8090%的细胞培养上清；"加药后"的样品是用药物处理一周后，换成Germ-freetestmedium培养2天后密度达8090%的细胞培养上清。PCR结果处理前与处理后的细胞上清形成鲜明对比，达到预期的效果1.本次实验选择293T、panc-l、SGC_7901、H1299四株细胞进行检测，每株细胞设置3组(复苏后、加药前、加药后)，目的就是想看看细胞在复苏传代过程的污染深度情况，用抗生素处理后的细胞是否还有支原体污染的可能。2.从PCR结果可以看出，第一轮检测有污染的细胞确实受到支原体污染，细胞在加药处理后全部转成阴性。3.加药处理后的细胞，外表面碎片消失，细胞通体光滑，折光度好，细胞贴壁更开，生长速度显著提高，初步实验证明转染与感染效率提高。序列表〈110〉上海吉盛制药技术有限公司〈120〉巢氏PCR支原体检测用引物组、检测试剂盒及其使用方法〈130〉PCNJK091860〈160>5〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>22〈212〉DNA〈213〉artificialsequence〈220〉〈223〉引物<400>1gatccatgggagctggteatgc22〈210〉2<211>24〈212>DNA<213>artificialsequence〈220〉〈223〉引物<400>2agcgttcatcgactttcagaccca24〈210>3〈211〉26〈212〉DNA〈213>artificialsequence〈220〉〈223〉引物〈400〉3tcatgttctttgaaaactgaatatcg26〈210>4〈211>21〈212〉DNA〈213〉artificialsequence〈220〉〈223〉引物<400>4caaggcatccaccaaaaactc21〈210〉5<211>508〈212>DNA〈213>artificialsequence〈220〉〈223〉内部对照<400>5gatccatgggagctggteatgccttcgtggtggg卿ggcc朋caggtcgg3C3gCgCC360ggtgtegcacccaggtggtgaccacggtctggcgcatgcggcaggcttccctgcccttct120tcacctecttcttgtcatgttctttgaaaactgaatetcgg￡lgg￡lgtgC￡lgtttgcag朋180ggtggtgccctgctcccacgagtggcccacggctgttcgccagcggcttcctgctcagcg240ccttcaccctggaccgctgcctgcaggtggtgcggccggtgtgggCgC3g朋CC3CCgC3300ccgtggccgcggcgcaccgtgttgagcaccgctggtgccc3朋gC3CC3ggagtttttgg360tggatgccttgcgtgttccgggacaccatctcacggctgg3C3ggCgC3ttetgtgctec420cccggggcctgaccgcgatgccacgtgcaactcgcgccaggcggccctggccctc朋c朋■gteatgggtctg朋3gtcgatgaacgct5081权利要求一种巢氏PCR支原体检测用引物组，包括外引物组与内引物组，外引物组的正向引物序列为5’-GATCCATGGGAGCTGGTAATGC-3’，反向引物序列为5’-AGCGTTCATCGACTTTCAGACCCA-3’；内引物组的正向引物序列为5’-TCATGTTCTTTGAAAACTGAATATCG-3’，反向引物序列为5’-CAAGGCATCCACCAAAAACTC-3’。2.—种巢氏PCR支原体检测试剂盒，包括权利要求1所述巢氏PCR支原体检测用引物组。3.如权利要求2所述巢氏PCR支原体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括阳性对照，或同时包括阳性对照和阴性对照。4.如权利要求3所述巢氏PCR支原体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR所需要的常规试剂。5.如权利要求4所述巢氏PCR支原体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内部对照。6.如权利要求2-5中任一权利要求所述巢氏PCR支原体检测试剂盒用于检测支原体污染的用途。7.如权利要求6所述巢氏PCR支原体检测试剂盒的用途，其特征在于，所述支原体污染为培养基、D-Hanks液、细胞或实验室环境中的支原体污染。8.如权利要求2-5中任一权利要求所述巢氏PCR支原体检测试剂盒的使用方法，包括下列步骤a、将待检样本煮沸后离心；b、分别以步骤a离心后的上清及阴性对照为模板，外引物组为引物进行第一轮PCR扩增；再分别以第一轮PCR的扩增产物及阳性对照为模板，内引物组为引物进行第二轮PCR扩+幽《>曰5c、将第二轮PCR扩增产物上电泳，根据电泳扩增条带情况判断是否污染支原体或污染支原体的种类。9.如权利要求8所述巢氏PCR支原体检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述第一轮PCR扩增的反应体系中加有内部对照。10.如权利要求8或9所述巢氏PCR支原体检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述第一轮PCR的反应条件为第一循环94°C2分钟；而后94°C30秒，62。C1分钟，72。C1分钟，共30个循环；最后72t:IO分钟后冷却；所述第二轮PCR的反应条件为第一循环94t:2分钟；而后94°C30秒，53。C30秒，72。C30秒，共30个循环；最后72°C10分钟后冷却。全文摘要本发明公开了一种巢氏PCR支原体检测用引物组、检测试剂盒及其使用方法。本发明的巢氏PCR支原体检测用引物组包括外引物组与内引物组，外引物组的正向引物序列为5′-GATCCATGGGAGCTGGTAATGC-3′，反向引物序列为5′-AGCGTTCATCGACTTTCAGACCCA-3′；内引物组的正向引物序列为5′-TCATGTTCTTTGAAAACTGAATATCG-3′，反向引物序列为5′-CAAGGCATCCACCAAAAACTC-3′。本发明的巢氏PCR支原体检测试剂盒中包括巢氏PCR支原体检测用引物组。本发明还进一步公开了该试剂盒的使用方法。本发明的试剂盒具有极高的特异性，可同时分辨多种支原体，扩增效率高，条带清晰，可同时高通量对样品进行检测。文档编号C12N15/11GK101724693SQ20091020072公开日2010年6月9日申请日期2009年12月24日优先权日2009年12月24日发明者曹跃琼,王海峰,逄淑召,韦有恒,高博申请人:上海吉盛制药技术有限公司