一种酮还原酶突变体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种酮还原酶突变体及其应用，所述突变体酮还原酶是将SEQ?ID?NO：7所示氨基酸序列的第21位的色氨酸残基突变为谷氨酰胺或丝氨酸，同时将第86位的色氨酸残基突变成谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺或缬氨酸；本发明突变体酮还原酶改变了野生型酮还原酶对酮酯类化合物（如：2-氧代-4-苯基丁酸乙酯或2,4-二氧代-4-苯基丁酸乙酯）催化的立体倾向性，生成的主要产物（如：2-羟基-4-苯基丁酸乙酯或2-羟基-4-氧代-4-苯基丁酸乙酯）由（S-）构象变成了（R-）构象，并且对映体过量值（ee值）由76.7%（S-）转变为99.4%（R-）。
【专利说明】一种酮还原酶突变体及其应用
(-)【技术领域】
[0001]本发明涉及一种酮还原酶及制备手性羟基酯中的应用，特别涉及突变体酮还原酶、编码基因、载体、重组工程菌及应用。
(二)【背景技术】
[0002]酮还原酶(Ketoreductase)是一种普遍存在于自然界中的氧化还原酶,它能将含羰基物质(如酮酯、酮酸等)不对称还原成相应的手性醇。酮还原酶催化酮类的还原需要辅因子向羰基转移氢，常用的辅因子是还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。
[0003]相较于化学合成过程中出现的催化剂价格昂贵、污染环境、产物纯度不高、催化条件苛刻等问题，酮还原酶因其高效、高立体选择性、条件温和及绿色环保等众多优点而广泛用于光学活性物质的合成。比如，还原二氧羧酸类(例如美国专利第6，399，339号)；还原(S)氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯(例如美国专利第6，645，746号和WOO1/40450)；还原基于吡咯并三嗪的化合物(例如美国申请第2006/0286646号)；还原取代的乙酰苯(例如美国专利第6，800,477号)；以及还原羟基四氢噻吩(hydroxythiolanes)(W02005/054491)。可见，酮还原酶是一种非常有效的生物催化剂。
[0004]虽然野生型酮还原酶对于其天然底物通常具有较好的反应活性和选择性，但是对于非天然底物，它们的反应活性、稳定性和选择性却常不尽人意。然而，酮还原酶在工业生产当中多数情况下是非天然底物，这就要求对野生型酮还原酶进行改造，以提高其对非天然底物的反应活性、稳定性和选择性(包括化学选择性、区域选择性和立体选择性)。
(三)
【发明内容】
[0005]本发明目的是提供一种突变体酮还原酶(即酮还原酶突变体)，以及该突变体在高效、高立体选择性催化非天然底物中的应用。
[0006]本发明采用的技术方案是:
[0007]本发明提供一种突变体酮还原酶，所述酮还原酶的氨基酸序列为SEQ ID N0:7所示(优选从超嗜热菌(Thermotoga maritima筛选得到),所述突变体酮还原酶是将SEQ IDNO:7所示氨基酸序列的第21位的色氨酸残基突变为谷氨酰胺或丝氨酸，同时将第86位的色氨酸残基突变成谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺或缬氨酸。
[0008]进一步，优选所述突变体酮还原酶的氨基酸序列具有SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5 或 SEQ ID NO:6 所示氨基酸序列 80% 以上同源性，更优选所述突变体酮还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5 或 SEQ ID NO:6 所示。
[0009]本发明还提供一种编码所述突变体酮还原酶的基因。
[0010]本发明提供一种含有所述突变体酮还原酶编码基因的重组载体。
[0011]本发明提供一种含有所述重组载体的重组基因工程菌，所述重组基因工程菌的构建方法为:构建含突变体酮还原酶编码基因的重组载体，将所述重组载体转化至所述宿主体内，将获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化得到含突变体酮还原酶的菌体细胞。
[0012]此外，本发明提供一种所述突变体酮还原酶在制备光学活性羟基酯中的应用，所述的应用为:将含突变体酮还原酶基因的重组工程菌经发酵培养获得的湿菌体用PBS缓冲液重悬后进行超声破碎、离心，取上清液在70°C下水浴lh，再次离心，取再次离心获得的上清液作为酶源，以酮酯类化合物为底物，以葡萄糖为辅助底物，以葡糖糖脱氢酶和还原性辅酶NADP+作为辅助酶源，加入二甲基亚砜，于水中构成pH7.2~7.4的转化体系，在25~37°C、150~250rpm条件下转化反应(优选37°C、200rpm反应12小时)，反应完全后，取反应液用等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层即获得含有光学活性羟基酯的混合液，将混合液分离纯化，即获得光学活性羟基酯；所述酶源的用量以超声破碎前湿菌体的菌体干重计为10~20g/L转化体系，所述底物的初始浓度为7~lOmmol/L，葡萄糖的初始浓度为10~20mmol/L，所述葡糖糖脱氢酶的用量为5~10U/L，所述还原性辅酶NADP+的用量为0.05~0.1mM，所述二甲基亚砜的体积终浓度为1.5%。
[0013]进一步，所述酮酯类化合物为2-氧代-4-苯基丁酸乙酯、2，4- 二氧代-4-苯基丁酸乙酯、乙酰乙酸乙酯、4-氯乙酰乙酸乙酯、甲酰乙酸乙酯、丙酰乙酸乙酯或甲酰甲酸乙酯。
[0014]更进一步，所述酶源的用量以超声破碎前湿菌体的菌体干重计为10g/L转化体系，所述底物的初始浓度为7mmol/L转化体系，所述葡萄糖的初始浓度为lOmmol/L转化体系，所述葡糖糖脱氢酶的用量为5U/L转化体系，所述还原性辅酶NADP+的用量为0.05mM转化体系，所述二甲基亚砜的体积终浓度为1.5%。
[0015]本发明所述酶源按如下方法制备:将含有突变体酮还原酶基因的重组工程菌接种至液体LB培养基，37°C培养3~5h，获得种子液；所述液体LB培养基质量终浓度组成为:1%酵母粉，1%蛋白胨，0.5%NaCl，溶剂为水，pH值为7.2~7.4 ;
[0016]将种子液以体积比1:100的接种量接种至自诱导培养基，20~25°C培养48h，将培养液离心，收集湿菌体，将湿菌体用PH7.2~7.4的PBS缓冲液重悬，在200W条件下超声破碎5min，再将破碎液离心，取上清液(即粗酶液)在70°C下水浴lh，再次离心，取再次离心获得的上清液(即纯酶液)作为酶源；所述自诱导培养基的终浓度组成为:阿拉伯糖3g/L，葡萄糖 0.5g/L,甘油 5g/L,蛋白胨 10g/L，磷酸盐 6.8g/L,硫酸盐 1.2g/L, NH4Cl2.65g/L,MgSO40.98g/L，CaCl20.lg/L，溶剂为水，pH 值为 7.2 ~7.4。
[0017]本发明所述突变体酮还原酶的酶活定义:每分钟消耗I μ mol NADPH所需要的酶量为一个酶活单位(U)。
[0018]相对酶活:以野生型酮还原酶催化EOPB的酶活力为100%标准，测得的突变体酮还原酶的酶活力即为相对酶活。
[0019]由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.6之一所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在80%以上，均属于本发明保护范围之列。具体的所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。[0020]在已知该氨基酸序列情况下，该氨基酸序列的获得，以及相关载体、宿主细胞的获得，对于本领域技术人员来说均是显而易见的。
[0021]与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在:
[0022]本发明突变体酮还原酶改变了野生型酮还原酶对酮酯类化合物(如:2_氧代-4-苯基丁酸乙酯或2，4- 二氧代-4-苯基丁酸乙酯)催化的立体倾向性，生成的主要产物(如:2_羟基-4-苯基丁酸乙酯或2-羟基-4-氧代-4-苯基丁酸乙酯)由(S-)构象变成了(R-)构象，并且对映体过量值(ee值)由76.7% (S-)转变为99.4% (R-)。
(四)【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为酮还原酶粗酶液和纯酶液电泳对照图，泳道1、2、3、4、5、6、7分别是蛋白Maker、野生型酮还原酶(Tm)粗酶液、Tm纯酶液、W21Q/W86E粗酶液、W21Q/W86E纯酶液、W21S/W21E 粗酶液、W21S/W21E 纯酶液。
[0024]图2为突变体酮还原酶催化EOPB转化为R-EHPB的反应式。[0025]图3为2-氧代-4苯基丁酸乙酯反应后液相色谱图:10.132分钟的峰为S-EHPB，峰面积为14 ；10.739分钟的峰为R-EHPB，峰面积为4555。
[0026]图4为突变体酮还原酶催化2，4-二氧代-4-苯基丁酸乙酯转化为R_2_羟基-4-氧代-4-苯基丁酸乙酯的反应式。
[0027]图5为2，4-二氧代-4-苯基丁酸乙酯反应后液相色谱图:10.101分钟的峰为S-产物，峰面积为22 ；10.704分钟的峰为R-产物，峰面积为4416。
[0028]图6为野生型酮还原酶与单突变体型酮还原酶基因测序图。
[0029]图7为野生型酮还原酶与单突变体型酮还原酶基因测序图。
[0030]图8为野生型酮还原酶与双突变体型酮还原酶基因测序图。
[0031]图9为野生型酮还原酶与双突变体型酮还原酶基因测序图。
(五)【具体实施方式】
[0032]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0033]本发明液体LB培养基质量终浓度组成为:1%酵母粉，1%蛋白胨，0.5%NaCl，溶剂为水，pH值为7.2~7.4。
[0034]所用LB固体培养基质量终浓度组成为:lwt%NaCl，lwt%蛋白胨，0.5wt%酵母粉，
1.5wt%琼脂，溶剂为水，pH值为7.2~7.4。
[0035]所述自诱导培养基的终浓度组成为:阿拉伯糖3g/L，葡萄糖0.5g/L，甘油5g/L，蛋白胨 10g/L，磷酸盐 6.8g/L，硫酸盐 1.2g/L，NH4Cl2.65g/L，MgSO40.98g/L，CaCl20.lg/L，溶剂为水，pH值为7.2~7.4。
[0036]实施例1突变体酮还原酶
[0037](I)野生型酮还原酶(SEQ ID NO:7)的获得
[0038]从超嗜热菌(Thermotoga maritima)中克隆编码酮还原酶的基因tadh (核苷酸序列为SEQ ID N0:8所示)，连接到载体pET28a ( + )上形成重组子，并将重组子转化到大肠杆菌JM109 (DE3)内发酵表达:先将重组菌于液体LB培养基中，37°C培养3~5h，得到种子液；再将种子液按体积比1:100的比例接种到自诱导培养基中，20~25°C培养48h，即可得到含野生型酮还原酶的细胞，野生型酮还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:7所示，其野生型酮还原酶的核苷酸序列已经通过基因测序得到了验证。
[0039](2)突变和筛选
[0040]在同源建模和分子对接的基础上，选择可能的关键性氨基酸残基(W21，W86)进行饱和突变，筛选后获得突变体酮还原酶。
[0041]饱和突变过程如下:
[0042]首先设计针对W21和W86 二个氨基酸残基分别设计饱和突变引物(具体如下所示)；然后以野生型酮还原酶编码基因(SEQ ID NO:8所示)为模板进行基于PCR的定点饱和突变。
[0043]简并引物设计:
[0044]突变21位氨基酸:
[0045]正向引物:5’ NNKGGTATCGGCGGTTTTGA3 ’
[0046]反向引物:5’ GGTACCCAGACCCAGTGCCGGA3 ’
[0047]突变86位氨基酸:
[0048]正向引物:5，NNKCCGACCCATCTGCGTCGCGAT3’
[0049]反向引物:5’ AACTTTGCTCACAATGAACAGATC3 ’
[0050]50 μ I反应体系:
【权利要求】
1.一种突变体酮还原酶，所述酮还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:7所示，其特征在于:所述突变体酮还原酶是将SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的第21位的色氨酸残基突变为谷氨酰胺或丝氨酸，同时将第86位的色氨酸残基突变成谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺或缬氨酸。
2.如权利要求1所述突变体酮还原酶，其特征在于所述突变体酮还原酶的氨基酸序列具有 SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5 或 SEQ ID NO:6所示氨基酸序列80%以上同源性。
3.如权利要求1所述突变体酮还原酶，其特征在于所述突变体酮还原酶的氨基酸序列为 SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5 或 SEQ ID NO:6所示。
4.一种编码权利要求1所述突变体酮还原酶的基因。
5.一种含有权利要求4所述突变体酮还原酶编码基因的重组载体。
6.一种含有权利要求5所述重组载体的重组基因工程菌。
7.—种权利要求1所述突变体酮还原酶在制备光学活性羟基酯中的应用，其特征在于所述的应用为:将含突变体酮还原酶基因的重组工程菌经发酵培养获得的湿菌体用PBS缓冲液重悬后进行超声破碎、离心，取上清液在70°C下水浴lh，再次离心，取再次离心获得的上清液作为酶源，以酮酯类化合物为底物，以葡萄糖为辅助底物，以葡糖糖脱氢酶和还原性辅酶NADP+作为辅助酶源，加入二甲基亚砜，于水中构成pH7.2~7.4的转化体系，在25~37°C、150~250rpm条件下转化反应，反应完全后，取反应液用等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层即获得含有光学活性羟基酯的混合液，将混合液分离纯化，即获得光学活性羟基酯；所述酶源的用量以超声破碎前湿菌体的菌体干重计为10~20g/L转化体系，所述底物的初始浓度为7~lOmmol/L转化体系，所述葡萄糖的初始浓度为10~20mmol/L转化体系，所述葡糖糖脱氢酶的用量为5~10U/L转化体系，所述还原性辅酶NADP+的用量为0.05~0.1mM转化体系，所述二甲基亚砜的体积终浓度为1.5%。
8.如权利要求7所述应用，其特征在于所述酮酯类化合物为2-氧代-4-苯基丁酸乙酯、2，4-二氧代-4-苯基丁酸乙酯、乙酰乙酸乙酯、4-氯乙酰乙酸乙酯、甲酰乙酸乙酯、丙酰乙酸乙酯或甲酰甲酸乙酯。
9.如权利要求7所述应用，其特征在于所述酶源的用量以超声破碎前湿菌体的菌体干重计为10g/L转化体系，所述底物的初始浓度为7mmol/L转化体系，所述葡萄糖的初始浓度为lOmmol/L转化体系，所述葡糖糖脱氢酶的用量为5U/L转化体系，所述还原性辅酶NADP+的用量为0.05mM转化体系，所述二甲基亚砜的体积终浓度为1.5%。
10.如权利要求7所述应用，其特征在于所述酶源按如下方法制备:将含有突变体酮还原酶基因的重组工程菌接种至液体LB培养基，37°C培养3~5h，获得种子液；所述液体LB培养基质量终浓度组成为:1%酵母粉，1%蛋白胨，0.5%NaCl，溶剂为水，pH值为7.2~7.4 ; 将种子液以体积比1:100的接种量接种至自诱导培养基，20~25°C培养48h，将培养液离心，收集湿菌体，将湿菌体用pH7.2~7.4的PBS缓冲液重悬，在200W条件下超声破碎5min,再将破碎液离心，取上清液在70°C下水浴lh，再次离心，取再次离心获得的上清液作为酶源；所述自诱导培养基 的终浓度组成为:阿拉伯糖3g/L，葡萄糖0.5g/L，甘油5g/L，蛋白胨 10g/L，磷酸盐 6.8g/L，硫酸盐 1.2g/L，NH4Cl2.65g/L，MgSO40.98g/L，CaCl20.lg/L，溶剂为水，pH值为7.2~7.4。
【文档编号】C12N15/70GK103898072SQ201410067936
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年2月26日 优先权日:2014年2月26日
【发明者】陈振明, 张飒, 王志国, 周硕, 赖敦岳, 张双玲 申请人:杭州师范大学