一株好氧反硝化菌及其在污水脱氮中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株好氧反硝化菌及其在污水处理中的应用。该菌株为假单胞菌属物种（Pseudomonas?sp.），将其命名为AO0019，已于2014年1月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC?NO.8804。本发明采用溴百里酚蓝（BTB）选择性分离培养基，从以生活污水为原水的SBR反应器活性污泥中筛选得到该菌株。好氧反硝化性能测定结果表明，菌株AO0019在培养72h对总氮去除率达到97%，并且亚硝态氮极少累积。将菌株扩大培养后分别接种至以生活污水为原水的SBR及推流式反应器中，也表现出良好的氨氮、总氮和COD的去除效果。
【专利说明】一株好氧反硝化菌及其在污水脱氮中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于环境微生物【技术领域】，具体地涉及一株好氧反硝化菌。
[0002]本发明还涉及上述好氧反硝化菌在污水脱氮中的应用。
【背景技术】
[0003]氮素是污水中一类非常重要的污染物，可引起水体富营养化，危机水生生物及人类健康。水体中氮素主要以有机氮(如蛋白质，氨基酸等)和无机氮(氨氮，硝态氮和亚硝态氮)两种形式存在。其中，有机氮一部分被水生生物同化吸收，一部分被氨化菌转化为氨氮，然后经硝化菌的硝化作用和反硝化菌的反硝化作用最终转化为氮气释放到空气中，完成自然界的氮素循环。传统理论认为，硝化菌为自养好氧型，而反硝化菌为厌氧异养型，从而使得在污水处理工程中，硝化作用和反硝化作用是两个完全独立的过程。近几年，随着异养硝化菌和好氧反硝化菌等新型脱氮菌的发现，废水处理过程可大大简化。具体表现在以下几方面:
[0004](I)硝化和反硝化可以在同一反应池中进行，减少建筑面积。
[0005](2)硝化作用的产物可以作为反硝化作用的底物，避免了硝酸盐累积对硝化作用的抑制。
[0006](3)反硝化作用产生的碱度可以部分补偿硝化作用消耗的碱度，节约成本。
[0007]因此，高效好氧反硝化菌株在污水脱氮中具有非常广阔的前景。
[0008]好氧反硝化菌的分离主要从`驯化和筛选两个方面进行，驯化主要包括间歇曝气法以及培养基中添加硝酸盐的方式，筛选主要是通过添加呼吸抑制剂或酸碱指示剂(如溴百里酚蓝)。据文献统计，目前发现的好氧反硝化菌分布在21个属，包含了 31个物种。部分菌株已经投入污水处理工程应用并且取得了良好效果，如有人利用粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)处理高有机负荷(12000mg/L)和氨氮负荷(2000mg/L)的猪舍废水，COD和氨氮去除率高于95%,Gupta使用含有泛氧琉球菌(Thiosphaera pantotropha)混合微生物膜的生物转盘处理生活污水，取得较好的COD和氨氮去除效果。此外，好氧反硝化菌在水产养殖、废弃物治理以及难降解污染物降解方面都表现出了很高的应用潜力。然而，好氧反硝化菌在工程上的应用仅处于起步阶段，需要在获得优良菌种的基础上采用合适的脱氮工艺，使得好氧反硝化菌的工程应用逐步普及。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供一株好氧反硝化菌。
[0010]本发明的又一目的在于提供一种上述好氧反硝化菌在污水脱氮中的应用。
[0011]为实现上述目的，本发明提供的好氧反硝化细菌，为假单胞菌属(Pseudomonassp.)菌株，命名为A00019，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2014年I月22号，保藏号为CGMCC N0.8804。
[0012]所述的好氧反硝化菌种，为革兰氏阴性菌，菌落在LB固体培养基为浅黄色，可利用硝酸盐为唯一氮源生长。
[0013]本发明的好氧反硝化菌可以应用在污水生物脱氮中。
[0014]所述的应用中，好氧反硝化菌污水生物脱氮工艺形式为推流式活性污泥反应器或SBR反应器。
[0015]所述的应用中，好氧反硝化菌菌液按照体积比3~10%投加至反应器。
[0016]本发明的好氧反硝化性能测定结果表明，氨氮、总氮和COD的去除效果良好，在污水脱氮中具有很大的工程应用潜力。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1是实施例1中的菌株A00019好氧反硝化性能测定结果。
[0018]图2是实施例2中的菌株A00019在SBR脱氮效果
[0019]图3为推流式活性污泥工艺流程简图
[0020]图4为基于16S rRNA基因序列构建的菌株A00019的系统发育进化树。
【具体实施方式】
[0021]本发明通过溴百里酚蓝(BTB)平板筛选法，从SBR反应器活性污泥筛选到一株好氧反硝化菌，命名A00019。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期:2014年I月22日，保藏号=CGMCC N0.8804，保藏地址:中国科学院微生物研究所(北京市朝阳区北辰西路I号院3号)。
[0022]该菌株为革兰氏阴性菌，在LB固体培养基上为浅黄色菌落，可利用硝酸盐为唯一氮源生长。
[0023]本发明获得的菌株A0001916S rRNA基因的有效序列长度为1412bp，该序列在GeneBank的登录号为KJ187041。经BlAST序列同源性比对及系统发育进化树的构建，鉴定该菌株的分类学地位为假单胞菌属(Psedomonas sp.) 一个新菌株。
[0024]好氧反硝化性能测定结果表明，该菌株在有氧条件下对硝态氮具有很高的去除率并且极少累积亚硝酸盐，无二次污染。同时，菌株A00019扩大培养后应用于SBR(序批式活性污泥法)工艺及推流式活性污泥工艺，对生活污水中氨氮、总氮和COD均有较高的去除效率。其中，SBR反应器水力停留时间为12h，曝气时间6~9h，采用生活污水为原水，溶氧维持在1.5~4.0mg/L。推流式活性污泥工艺由I个收集池，I个曝气池和I个沉淀池组成。曝气方式为连续曝气，曝气池长宽比在15:1~8:1，控制溶氧在1.5~4.0mg/L, pH7~8，温度25~30°C，水力停留时间为10~15h，混合液回流比100%~400%，污泥回流比50%~200%。以上实验结果表明菌株A00019具备优良的好氧反硝化性能，同时还具有异养硝化作用，在生活污水以及其他各种污染水体治理中具有很高的应用价值。
[0025]通过以下具体实施例对本发明的技术方案做进一步描述。目的是为了更好地理解本发明，而不是对本发明的限制。
[0026]实施例1:好氧反硝化菌株的初筛及复筛
[0027]SBR反应器接种经过间歇曝气的活性污泥后，以小区生活污水为原水(C0D200~500mg/L, TN70-90mg/L)稳定运行6个月。从反应器中取5mL泥水混合液，至45mL灭菌的TB富集培养基中。TB富集培养基的配方为:KN03lg/L，KH2P04lg/L, FeCl2.6H200.5g/L，CaCl2.7Η200.2g/L，MgSO4.7H201g/L，琥珀酸钠 8.5g/L，ρΗ7.0。然后放入 30°C气浴摇床以160rpm转速富集培养24h。将富集液进行梯度稀释后，均匀涂布于溴百里酚蓝(BTB)分离培养基(琼脂20g/L，其余成分同TB)。在30°C恒温培养箱中培养2d后，挑取周围培养基出现蓝色晕圈的菌株至BTB培养基，划线纯化并编号保藏，经初筛共得到20个菌株。
[0028]从平板挑取一环菌落至LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.0)，30°C气浴摇床160rpm培养24h，取10% (体积比)菌液离心洗涤，接种至TB液体培养基，300C，160rpm摇瓶培养，定期取样测定硝态氮(Ν03__Ν)和亚硝态氮(Ν02__Ν)的浓度，通过分析总氮(TN)的去除率来判断菌株的好氧反硝化性能。由图1可看出，菌株A00019具备很好的脱氮性能，24h时总氮去除率达到70%以上，72h时达到97%，并且亚硝态氮极少累积，浓度均在0.02mg/L以下，72h已检测不到。
[0029]实施例2:菌株A00019在SBR反应器脱氮效果
[0030]取小区生活污水，pH为7，氨氮25mg/L，总氮94mg/L，C0D297mg/L。将生活污水引ASBR反应器，其中反应器水力停留时间为12h，曝气时间8h，溶解氧浓度维持在2mg/L左右。
[0031]从斜面培养基取菌体接种于WN液体培养基，30°C气浴摇床160rpm培养24h。按照10%体积比将处于对数生长期菌液离心洗涤后投加至SBR反应器，室温下(约25°C)曝气培养8h，每隔2h测定水样中氨氮(NH4_-N)，总氮(TN)及化学需氧量(C0D)。如图2所示为菌株8h内对生活污水的氨氮、总氮及COD的去除情况，最终出水氨氮和COD的去除率均达到95%以上，总氮去除率达到90%，取得了较好的脱氮及COD去除效果。
[0032]WN 培养基配方为=NH4Cl0.75g/L, KH2PO4L 2g/L, K2HPO40.5g/L, CaCl20.lg/L, MgSO4.7H201.32g/L, FeCl2.4H201.32g/L, FeSO4.7H200.005g/L, NaCl0.25g/L,MnSO4.4H200.005g/L，葡萄糖 lOg/L, pH6.7。
`[0033]实施例3:菌株A00019在推流反应器中脱氮效果
[0034]菌株的扩大培养:采用培养基WN，将菌株A00019扩大培养。在此期间，温度维持在25°C，使用曝气头曝气以保证培养液中溶解氧浓度在2mg/L以上，经过5天的培养，培养液C0D〈100mg/L，TN〈10mg/L，菌体密度达到最高值，OD600约为1.5。
[0035]培养液按10%体积比投加至推流反应器:本实验采用的推流式活性污泥反应器由I个收集池，I个曝气池和I个沉淀池组成(如图3所示)，将扩大培养后菌液按10%比例投加至曝气池，曝气池长宽比为10:1，控制池内溶氧在2.0~3.0mg/L, pH7~8，温度25~30°C。曝气池水力停留时间为12h，混合液回流比200%，污泥回流比100%，最终出水达到了较好的脱氮效果。
[0036]实施例4:菌株A00019的系统进化分析
[0037]采用Chelex法提取菌株基因组DNA，利用通用引物27F和1492R进行PCR扩增，弓丨物序列为 27F:5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R:5’ -CGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。扩增程序为:预变性990C 4min ;变性95°C 30s，退火54°C 30s，延伸72°C lmin，循环30次；最后于72°C延伸lOmin。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送至华大基因进行序列测定。
[0038]将16SrRNA 基因序列(1412bp)导入 Eztaxon-e (http://eztaxon_e.ezbiocloud.net/)进行BLAST比对。调取每条序列最相近菌株16S rRNA基因序列，通过软件包CLUSTAL_X进行比对分析，应用MEGA5软件,采用邻位相接法(Neighbour-joining)构建系统发育进化树。
[0039]16S rRNA 基因序列比对结果表明，菌株 A00019 与 Pseudomonas.1ndoloxydans(IPL-1T)具有最高的序列相似度，为99.57%。从图4的系统发育进化树也可看出，以上两菌株形成稳定独立的分支，位于Pseudomonas属内，可以确定菌株A00019为Pseudomonas属一个新菌株。`
【权利要求】
1.一株好氧反硝化细菌，为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)菌株,命名为A00019,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2014年I月22号，保藏号为CGMCC N0.8804。
2.根据权利要求1所述的好氧反硝化菌，其中，为革兰氏阴性菌，菌落在LB固体培养基为浅黄色，利用硝酸盐为唯一氮源生长。
3.权利要求1所述的好氧反硝化菌在污水生物脱氮中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其中，好氧反硝化菌污水生物脱氮工艺形式为推流式活性污泥反应器或SBR反应器。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其中，好氧反硝化菌菌液按照体积比3~10%投加至反应 器。
【文档编号】C12N1/20GK103849588SQ201410078681
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2014年3月5日 优先权日:2014年3月5日
【发明者】李安峰, 骆坚平, 刘玉娟, 潘涛, 董娜, 郭行 申请人:北京市环境保护科学研究院