一种用于分析促胆固醇流出能力的体外检测方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于分析促胆固醇流出能力的体外检测方法，该方法选用人THP-1巨噬细胞株等为基础，用特定细胞膜转运体抑制剂和／或RNA干扰技术沉默相关膜胆固醇转运蛋白基因的表达，加入荧光标记的胆固醇和细胞孵育，然后将细胞株接种于培养板孔中，加入待测样品，共同在37℃孵育，采用微孔板读板机检测培养液中胆固醇的浓度，计算细胞胆固醇流出率。本发明提供的方法，可快速有效地评估待测样品促胆固醇流出能力以及和各特定胆固醇转运体功能间的关系，可采用自动化检测仪器的高通量检测，检测效率更高，检测结果更准确，可用于动脉粥样硬化等心血管系统疾病风险的评估以及新药筛选，应用范围广泛。
【专利说明】—种用于分析促胆固醇流出能力的体外检测方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用培养人体细胞的体外定量方法，具体涉及一种用于分析促胆固醇流出能力的体外检测方法，该方法可用于评估人血清样品、分离的血清成分，脂蛋白颗粒或其它化合物促胆固醇流出的能力。
【背景技术】
[0002]心血管疾病是人类健康的主要威胁，具有很高的发病率和死亡率，且出现逐年增长的趋势。动脉粥样硬化是心血管疾病的一个常见形式，是心血管相关疾病高发病率和高死亡率的主要原因。其主要原因是由于体内氧化应激的增加，后者促进胆固醇沉积在动脉血管壁上，导致冠状动脉和脑、肾等动脉粥样硬化斑块的形成和扩散。斑块可以破裂和/或伴随血栓形成，从而引起心绞痛、心肌梗塞和中风等严重的临床症状。
[0003]血清HDL具有从动脉壁巨噬细胞接受多余胆固醇的能力，即促胆固醇流出(cholesterol efflux)，被广泛认为可以防止动脉粥样硬化的发展。运输到肝脏的胆固醇最终从粪便中排出，此过程称为胆固醇逆向转运(reverse cholesterol transport)。在此过程中，HDL的主要蛋白组分-载脂蛋白Al (Apol)作为细胞胆固醇的受体，促进HDL摄取外周组织的胆固醇。
[0004]现在的心血管健康测试仍然基于生物标志物包括血浆脂蛋白，或与炎症和氧化损伤等相关的生物分子浓度的测量，这已远远不能满足目前的需要。特别是近年来多项研究显示HDL的胆固醇流出功能比其血浆水平更重要，后者不再被认为是疾病预测的可靠指标，其重要原因之一是HDL可在不同状况下被化学修饰或导致结构变化，如在氧化应激的情况下被氧化，从而导致其介导巨噬细胞胆固醇流出能力的显著降低，损伤其抗动脉粥样硬化的能力。近年来的临床试验提供了有力的证据显示，病人血清或HDL促胆固醇流出的活性和动脉壁增厚及动脉粥样硬化的显著改善呈正相关性，从而更能预测血管和冠脉类疾病的发生。
[0005]现有证据表明胆固醇流出在某些细胞类型中是通过细胞膜转运体(membranetransporters)进行的,这些蛋白可以将细胞内多余的胆固醇分子转移至HDL受体颗粒。其中一种转运蛋白叫三磷酸腺苷结合盒转运体Al (ABCAl)，其在新生HDL颗粒的合成和启动胆固醇逆向转运过程中起关键作用，是维持组织或细胞内正常胆固醇浓度的关键转运体。ABCAl基因突变可导致丹吉尔疾病(Tangier disease)，即严重的HDL缺乏综合征，患者体内巨噬细胞胆固醇酯增多，常伴有高胆固醇血症和心血管疾病。ABCGl同属三磷酸腺苷结合盒转运体家族，也涉及巨噬细胞和其它细胞的胆固醇转运。另一转运蛋白清道夫受体BI (SR-Bl)也结合HDL，是胆固醇外流的另一主要机制。其在动脉壁巨噬细胞中的功能可以起到防止胆固醇沉积的效果，是体内发挥抗动脉粥样硬化作用的主要受体之一。
[0006]胆固醇流出实验，在实验室被广泛应用于研究疾病的机制，寻找新的候选药物，以及建立与疾病的关联。胆固醇流出活性一般在体外进行检测，在活体内测定胆固醇的移动十分复杂，不但费力、费时，成本高，而且不易标准化，因此体外测定是目前学术界和商业化的主要实施方法。但目前体外测定方法，基本上应用非人体来源的巨噬细胞，而它们并不是理想的测试人体标本或治疗因子的细胞系统。并且现有技术中，只能在不同实验中分别测定相关的转运体功能，由于条件差异很难进行对照和比较。
【发明内容】
[0007]发明目的:本发明的目的是为了解决现有技术的不足，采用单一类型培养细胞，可快速有效地评估待测样品促胆固醇流出能力以及和各特定胆固醇转运体功能间的关系，并且可采用自动化检测仪器的高通量检测，检测效率更高，检测结果准确性高，可用于对心血管疾病特别是动脉粥样硬化的检测/预后分析，也包括对非心血管疾病如糖尿病等并发心血管疾病检测和分析。并且可用于筛选心血管系统疾病的药物，尤其是以胆固醇逆向转运机制为靶点的新药的筛选。
[0008]技术方案:为了实现以上目的，本发明采用的技术方案为:
一种用于分析促胆固醇流出能力的体外检测方法，包括以下步骤:首先选用细胞株为基础，然后用特定细胞膜转运体抑制剂和/或RNA干扰技术沉默相关膜胆固醇转运蛋白基因的表达，然后将细胞株接种于培养板孔中，然后加入含荧光标记胆固醇的培养液和细胞孵育I小时，使细胞荷脂和标记；然后将待测样品加入以上细胞培养板孔中，共同在37°C孵育I至10小时，然后吸取培养板孔中的上清培养液，用微孔板读板机检测培养液中荧光强度以计算胆固醇的浓度和待测样品促进细胞的胆固醇流出率。
[0009]作为优选方案，以上在37°C孵育时间根据实际操作需要设定，如孵育I到10小时不等，如实验目的为动力学，即为时间依赖性研究，需在不同的培养时间点，如0，1，2，4和8小时吸取培养液。
[0010]作为优选方案，以上所述的用于分析促胆固醇流出能力的体外检测方法，所述的细胞株为人THP-1巨噬细胞，人原代巨噬细胞或人U937细胞。传统检测通常利用动物巨噬细胞如J774细胞株来作为胆固醇供体，由于物种差异，并不能完全反映药物作用于人体后促胆固醇流出能力。本发明通过大量样本实验筛选，优选出更加适用于人体的检测细胞，如THP-1细胞株，该细胞更加适合用于分析样品作用于人后促胆固醇流出能力。
[0011]作为优选方案，以上所述的用于分析促胆固醇流出能力的体外检测方法，所述的特定细胞膜转运体抑制剂包括清道夫受体BI (SR-Bl)抑制剂，脂质转运抑制剂一 I (BLT-1)和三磷酸腺苷结合盒转运体Al (ABCAl)抑制剂，环孢霉素A或丙丁酚(probucol)。
[0012]作为优选方案，以上所述的用于分析促胆固醇流出能力的体外检测方法，其特征在于，所述的RNA干扰技术包括应用siRNA介导的暂时性抑制和构建慢病毒(Ientivirus)载体转染的稳定RNA干扰细胞株，以沉默相关膜胆固醇转运蛋白基因的表达。
[0013]作为优选方案，以上所述的用于分析促胆固醇流出能力的体外检测方法，所述的荧光标记的胆固醇为荧光标记的胆固醇衍生物，作为更优选的方案，荧光标记的胆固醇衍生物为氟硼二吡咯类荧光分子探针或其它类似荧光物探针。本发明采用荧光标记胆固醇探针加96-孔细胞培养板方法，有助于自动化检测仪器的高通量应用，有助于临床上和新药筛选的大样本操作。可 减少现有基于放射性同位素标记胆固醇检测技术的繁多步骤和避免放射性同位素的环保问题。
[0014]作为优选方案，以上所述的用于分析促胆固醇流出能力的体外检测方法，所述的待测样品包括人血浆，人血清，分离的血清成分，脂蛋白颗粒，天然产物、合成化合物或生物分子。作为进一步的优选方案，所述的血浆，人血清，分离的血清成分，脂蛋白颗粒来自心血管疾病的病人，特别是动脉粥样硬化患者，也包括非心血管疾病，如糖尿病等患者。
[0015]作为进一步的优选方案，所述的天然产物、合成化合物或生物分子为具有防治心血管疾病功效的药物。
[0016]作为优选方案，以上所述的用于分析促胆固醇流出能力的体外检测方法，所述的荧光检测方法为采用自动化高通量多功能工作站检测。作为优选，所述的自动化胆固醇流出检测工作站，可采用中国专利申请号为201310702939.8记载的自动化胆固醇流出检测工作站进行高通量检测。
[0017]本发明所述的用于分析促胆固醇流出能力的体外检测方法在检测ABCA1、ABCGl或SR- BI转运体介导的胆固醇流出率中的应用。
[0018]本发明所述的用于分析促胆固醇流出能力的体外检测方法，也可以用于检测动脉粥样硬化心血管疾病或糖尿病性心血管疾病中的应用。
[0019]本发明提供的用于分析促胆固醇流出能力的体外检测方法，利用同一细胞株并在相同实验条件下量化分析人血清或其它样本对三种不同细胞膜胆固醇外转运体介导的胆固醇转运功能的影响。现有技术是在不同实验中单独测定各转运体的功能，费时且工作效率低，而且现有技术检测时，必须单独分开测定，测定结果不易对比。本发明通过对特异性胆固醇转运体抑制剂的选择性使用，达到相对专一地研究某个细胞表面转运体对胆固醇外流的作用。如应用BLT-1 (EMDMillipore)作为SR-Bl的抑制剂，环孢霉素(cyclosporineA)或丙丁酚(PiObucoI)作为ABCAl的抑制剂。另一途径是利用RNA干扰技术沉默相关膜胆固醇转运蛋白基因的表达，包括建立在siRNA (小干扰RNA)介导的暂时性抑制和构建慢病毒等载体转染的稳定RNA干扰细胞株。RNA干扰技术也可用于同时沉默两种转运体如ABCAl和ABCGl的基因表达，或和转运体抑制剂结合使用。因此，可实现在同一细胞株即可快速有效地评估待测样品促胆固醇流出能力，又能分析三种胆固醇外转运体的胆固醇转运功能，检测效率更高，检测结果更加准确，并且检测结果的可比性强，相比现有技术取得了非常好的技术效果。
[0020]作为优选方案，以上所述的用于分析促胆固醇流出能力的体外检测方法，其临床应用，除了针对心血管系统疾病的检测，特别是动脉粥样硬化，也针对非心血管疾病如糖尿病等检测。糖尿病是诱发心血管疾病非常重要的危险因素，其并发症包括冠心病、中风、肾病等。通过本发明的方法测定体外的细胞胆固醇流出活性，为临床预测心血管系统疾病，糖尿病患者动脉粥样硬化的病变程度提供科学依据。
[0021]并且，本发明提供的体外检测方法也可用于与胆固醇代谢相关新药的筛选。本发明方法既可以单独使用，也可与其他浓度测试方法相组合，例如血清高密度脂蛋白(HDL)和/或载脂蛋白A-1水平的测量。
[0022]有益效果:本发明所提供的用于分析促胆固醇流出能力的体外检测方法和现有技术相比具有如下优点:
(I)本发明直接利用培养人体细胞系统，如THP -1细胞为实验对象，对病人血清等样本进行检测，并可利用同一细胞检测三种胆固醇外转运体的胆固醇转运功能，检测结果无物种差异的考量，可对比性强，检 测效率高。[0023](2)本发明采用荧光标记胆固醇探针加96-孔细胞培养板方法，可替代放射性同位素标记的胆固醇，并具更高敏感性，能进行高通量自动化检测，可避免利用放射性同位素标记胆固醇带来的不便和环保问题，应用范围广泛。
[0024](3)本发明提供的方法，可广泛用于动脉粥样硬化为基础的心血管疾病的检测和预防分析，如用于检测糖尿病背景上心血管疾病。可用于筛选具有防治心血管疾病功效的药物，尤其是以胆固醇逆向转运机制为靶点的新药。
[0025]【专利附图】
【附图说明】
图1为本发明所述的用于分析促胆固醇流出能力的体外检测方法的流程示意图。【具体实施方式】
[0026]下面结合附图和具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
[0027]实施例1
现以临床检测人群血清促胆固醇流出功能为实施例，说明此检测法的工作原理和操作步骤。研究目的是测量2型糖尿病患者血清胆固醇流出能力，并和健康对照组相比较。文献报导此型患者动脉粥样硬化发生率高，其中HDL水平和其促胆固醇流出功能的变化有重要关连。本实验目的为研究何种膜胆固醇转运蛋白介导的胆固醇流出在2型糖尿病发生了变化。
[0028]现在已知含载脂蛋白B (ApoB)的脂蛋白，如低密度脂蛋白(LDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)可以干扰胆固醇流出`活性的测定，从而影响本检测法的敏感性。为克服此问题，病人血清样品将经过沉淀处理，即利用多聚阴离子和二价阳离子如聚乙烯甘醇和磷钥钨酸-镁选择性地将这类脂蛋白沉淀除去，留下的即为含HDL的部分。
[0029]如图1所示，试验细胞株采用人THP-1巨噬细胞株，根据实验设计加入清道夫受体BI (SR-Bl)抑制剂，BLT-1，三磷酸腺苷结合盒转运体Al (ABCA1)抑制剂，丙丁酚，沉默相关月旲胆固醇转运蛋白基因的表达(应用Western blot确定相关蛋白表达的情况)。
[0030]将THP-1细胞株按需接种于培养板孔中(可按IxlOVml/孔)，这些细胞在培养板上呈单层生长。加入含荧光标记胆固醇的培养液孵育I小时，使细胞荷脂并标记。
[0031]将以上处理过的病人血清样品进行稀释并加入细胞培养板孔中，共同在37°C孵育4小时，然后吸取培养板孔中的上清培养液，过滤后用微孔板读板机检测培养液中荧光强度以计算流出胆固醇的浓度。待测样品促细胞胆固醇流出率的计算为:流出胆固醇荧光强度除以细胞总胆固醇荧光强度。后者的测定为将非病人血清处理的细胞溶解，然后用微孔板读板机检测其荧光强度。
[0032]实验结果表明，2型糖尿病患者血清胆固醇流出能力明显弱于正常人血清，二者比较有显著性差异，P < 0.05)
实施例2
以人THP-1巨噬细胞为研究对象，探讨候选心血管疾病药物系列X对SR-Bl介导的细胞胆固醇流出的影响，SR-Bl和ABCAl是迄今为止研究最多的促进胆固醇流出的细胞表面转运蛋白。目前他汀(Statin)类降血脂药物以低密度脂蛋白胆固醇(LDL cholesterol)为目标，但仅可以降低大约30%的不良冠脉事件。寻找和筛选新的药物，特别是以HDL和逆转动脉粥样硬化为靶点，已经成为当前心血管药物研发领域中的热点课题。现以候选药物系列X研发为例说明本发明如何用于新药早期发现的筛选。
[0033]实验细胞株采用人THP-1巨噬细胞株，利用RNA干扰技术同时沉默ABCAl和ABCGl两基因的表达，并应用Western blot确定相关蛋白表达的抑制情况。将培养中的细胞按实验需要分组，并分别加入多孔培养板中，加入荧光标记的胆固醇孵育I小时，使细胞荷脂和标记。用缓冲液洗涤后加含血清或HDL的培养液孵育诱导细胞胆固醇流出。收集上清液，测量其荧光强度。再溶解并收集没有经过血清或HDL处理的细胞，测量其荧光强度。两荧光强度值被用来计算基础胆固醇流出率(见上例)。然后在同一血清中加入各候选药物分子，孵育适当时间，再重复以上步骤以测定胆固醇流出率。药物处理前后胆固醇流出率的差距即为新药分子促胆固醇流出的能力。
[0034]对于处于临床试验期的药物，在用药前后采取病人血清，然后分别测定其胆固醇流出活性，其差值即为试验药物的促SR-Bl介导的胆固醇流出活性效能。
[0035]实施例3
以人THP-1巨噬细胞为研究对象，探讨候选心血管疾病药物系列X对ABCAl介导的细胞胆固醇流出的影响，ABCAl为关键的促进胆固醇流出的细胞表面转运蛋白。它以ATP为能源，在胆固醇逆转运和高密度脂蛋白生成中起重要作用。cAMP可激活细胞膜胆固醇转运体ABCAl。
实验细胞株采用人THP-1巨噬 细胞株，利用清道夫受体BI (SR-Bl)抑制剂和RNA干扰技术沉默ABCGl基因的表达，并应用Western blot确定相关蛋白表达的抑制情况。将培养中的细胞按实验需要分组，并分别加入多孔培养板中，加入荧光标记的胆固醇孵育I小时，使细胞荷脂和标记。一组细胞和cAMP孵育18小时以激活ABCAl。用缓冲液洗涤后加含血清或HDL的培养液孵育诱导细胞胆固醇流出。收集上清液，测量其荧光强度。再溶解并收集没有经过血清或HDL处理的细胞，测量其荧光强度。两荧光强度值被用来计算基础胆固醇流出率。然后在同一血清中加入各候选药物分子，孵育适当时间，再重复以上步骤以测定胆固醇流出率。药物处理前后胆固醇流出率的差距值为筛选药物分子对ABCAl介导的胆固胆固醇流出率的影响。
[0036]对于处于临床试验期的药物，在用药前后采取病人血清，然后采用按以上处理的细胞分别测定其胆固醇流出活性，其差值即为试验药物的促ABCAl介导的胆固醇流出活性效能。
[0037]实施例4
用于高通量自动化检测大样本人群，采用中国专利申请号为201310702939.8记载的自动化胆固醇流出检测工作站检测中国人群促血清胆固醇流出能力，比较来自健康对照组和中/晚期动脉粥样硬化或相关冠状动脉疾病的检测数据。目的为建立中国人群胆固醇流出活性基线值和测试中国患者胆固醇流出活性的减少与动脉粥样硬化存在的相关性。这些数据将提供中国人群HDL的功能(即促胆固醇流出活性)以及和各相关膜胆固醇转运体功能的关系，可用来评估/检测疾病的风险。
[0038]试验细胞株采用人THP-1细胞株，加入清道夫受体BI (SR-B1)，BLT-1，或三磷酸腺苷结合盒转运体Al (ABCAl)抑制剂，丙丁酚，或沉默相关膜胆固醇转运蛋白基因的表达(应用Western blot确定相关蛋白表达的情况)。然后将细胞株接种于96孔培养板孔中，放入工作站的恒温短期孵化器中孵育。然后加入含荧光标记胆固醇的培养液孵育I小时，使细胞荷脂并标记。
[0039]实验开始时滑动板将培养板从短期恒温孵化器移出到清洗和加样平台进行清洗；移液头将健康对照组和中/晚期动脉粥样硬化疾病患者的血清样品，分别用缓冲液培养基进行稀释至不同浓度如5%，2%和1%。然后将血浆样品分送至细胞培养板孔中，然后送入恒温孵化器孵育4小时(37°C)。培养完成后将培养板放回清洗和加样平台，通过移液头吸取孔中上清培养液并移至过滤平台上的多孔过滤板过滤以去除上清液中可能的细胞碎片。然后电控机器手从多孔过滤板采集定量的过滤培养基，移至另一 96孔细胞培养板供微孔板读板机检测培养液中荧光强度，以计算胆固醇的浓度和待测样品促进细胞的胆固醇流出率。
[0040]实验结果表明:中/晚期动脉粥样硬化疾病患者的血清胆固醇流出能力明显弱于正常人血清的胆固醇流出能力，二者比较有显著性差异(P < 0.05)。
[0041]实施例5
用于高通量自动化检测大人群，采用中国专利申请号为201310702939.8记载的自动化胆固醇流出检测工作站检测中国人群促血清胆固醇流出能力，比较来自健康对照组和中/晚期动脉粥样硬化或相关冠状动脉疾病的检测数据。目的为建立中国人群胆固醇流出活性基线值和测 试中国患者胆固醇流出活性的减少与动脉粥样硬化存在的相关性。这些数据将提供中国人群HDL的功能(即促胆固醇流出活性)，可用来评估/预测疾病的风险。
[0042]试验细胞株采用人原代巨噬细胞，不加入抑制剂。然后将细胞株接种于96孔培养板孔中，放入工作站的恒温短期孵化器中孵育。然后加入含荧光标记胆固醇的培养液孵育I小时，使细胞荷脂并标记。
[0043]实验开始时滑动板将培养板从短期恒温孵化器移出到清洗和加样平台进行清洗；移液头将健康对照组和中/晚期动脉粥样硬化疾病患者的血清样品，分别用缓冲液培养基进行稀释至不同浓度如5%，2%和1%。然后将血浆样品分送至细胞培养板孔中，然后送入恒温孵化器孵育4小时(37°C)。培养完成后将培养板放回清洗和加样平台，通过移液头吸取孔中上清培养液并移至过滤平台上的多孔过滤板过滤以去除上清液中可能的细胞碎片。然后电控机器手从多孔过滤板采集定量的过滤培养基，移至另一 96孔细胞培养板供微孔板读板机检测培养液中荧光强度，以计算胆固醇的浓度和待测样品促进细胞的胆固醇流出率。
[0044]实验结果表明:中/晚期动脉粥样硬化疾病患者的血清胆固醇流出能力明显弱于正常人血清的胆固醇流出能力，二者比较有显著性差异(P < 0.05)。
[0045]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种用于分析促胆固醇流出能力的体外检测方法，其特征在于，包括以下步骤:首先选用人体细胞株为基础，然后用特定细胞膜转运体抑制剂和/或RNA干扰技术沉默相关膜胆固醇转运蛋白基因的表达，然后将细胞株接种于培养板孔中，然后加入含荧光标记胆固醇的培养液和细胞孵育I小时，使细胞荷脂和标记；然后将待测样品加入以上细胞培养板孔中，共同在37°C孵育I到12小时，然后吸取培养板孔中的上清培养液，用微孔板读板机检测培养液中荧光强度以计算胆固醇的浓度和待测样品促进细胞的胆固醇流出率。
2.根据权利要求1所述的用于分析促胆固醇流出能力的体外检测方法，其特征在于，所述的细胞株为人THP-1巨噬细胞，人原代巨噬细胞或人U937细胞。
3.根据权利要求1或2所述的用于分析促胆固醇流出能力的体外检测方法，其特征在于，所述的特定细胞膜转运体抑制剂包括清道夫受体BI抑制剂，脂质转运抑制剂一 1，三磷酸腺苷结合盒转运体Al抑制剂，环孢霉素A或丙丁酚。
4.根据权利要求1或2所述的用于分析促胆固醇流出能力的体外检测方法，其特征在于，所述的RNA干扰技术包括应用SiRNA介导的暂时性抑制和构建慢病毒载体转染的稳定RNA干扰细胞株，以沉默相关膜胆固醇转运蛋白基因的表达。
5.根据权利要求1所述的用于分析促胆固醇流出能力的体外检测方法，其特征在于，所述的荧光标记的胆固醇为氟硼二吡咯类荧光分子探针。
6.根据权利要求1或5所述的用于分析促胆固醇流出能力的体外检测方法，其特征在于，所述的荧光检测方法可采用自动化高通量多功能工作站进行。
7.根据权利要 求6所述的用于分析促胆固醇流出能力的体外检测方法，其特征在于，所述的待测样品包括人血浆，人血清，分离的血清成分，脂蛋白颗粒，天然产物、合成化合物或生物分子。
8.根据权利要求7所述的用于分析促胆固醇流出能力的体外检测方法，其特征在于，所述的天然产物、合成化合物或生物分子为具有防治心血管疾病，糖尿病，肾和神经性疾病功效的药物。
9.权利要求1所述的用于分析促胆固醇流出能力的体外检测方法在检测ABCAUABCG1或SR- BI转运体介导的胆固醇流出率中的应用。
10.权利要求1所述的用于分析促胆固醇流出能力的体外检测方法在检测动脉粥样硬化心血管疾病或糖尿病性心血管疾病中的应用。
【文档编号】C12Q1/60GK103820525SQ201410087034
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月11日 优先权日:2014年3月11日
【发明者】杭渤 申请人:南京卡迪奥密生物技术有限公司