一种附子多糖诱导nkt细胞增殖的制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了中药附子多糖诱导自然杀伤T细胞(Nature?Killer?T?cell，NKT)增殖的培养方法，其中包括如下特征：人外周血、骨髓或脐带血来源的单个核细胞，在中药附子多糖和人重组白介素2条件下连续培养，获得大量自然杀伤T细胞，表达NK1.1+和CD8+，并分泌干扰素γ，在第14天时占淋巴细胞的比例16.15％以上，数量级可达5×109以上；具有有效的抗肿瘤和抗病毒功能。本发明还提供了一种含通过上述方法而得到的NKT细胞的临床应用。
【专利说明】一种附子多糖诱导NKT细胞增殖的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种附子多糖诱导自然杀伤T细胞增殖的制备方法及其应用。本发明涉及的采用人外周血、骨髓或脐带血经体外分离纯化获得的单个核细胞，在中药附子多糖和人重组白介素2条件下连续培养，简便地获得大量的NKT细胞，表达NKl.1+和CD8+，并分泌IFN-Y，具有抗肿瘤和抗病毒的功能，可用于各类癌症包括实体瘤和血液肿瘤在内，以及多种病毒感染的多个疗程的免疫治疗。
【背景技术】
[0002]免疫细胞抗肿瘤抗病毒已在临床上得到广泛的应用，特别是细胞因子诱导杀伤细胞，没有目前常规治疗带来的毒副作用，其相对安全，保证了患者的生活品质和尊严。构成机体免疫系统的淋巴细胞中，除T、B、NK细胞外，还存在一种新的细胞系-NKT细胞。这种细胞不仅其本身具有抗肿瘤、抗病毒和抑制自身免疫性疾病的功效，而且还能刺激T、NK等免疫细胞的活性，增强其细胞毒效应，抑制GVHD的发生。NKT细胞疫苗多疗程治疗对患者疗效和生存期有着明显的帮助，并得到临床上认可。
[0003]目前，获得NKT细胞的来源主要为从患者外周血或骨髓中分离出单个核细胞，在多种细胞因子单独或组合诱导作用下，如重组人白介素2、重组人白介素15、重组人白介素
4、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、重组人白介素12、重组人白介素18,或与α-半乳糖神经鞘胺醇(a -Galcer)联合诱导作用，得到NKl.1+和TCR β +的NKT细胞，细胞数量级为5Χ IO8个左右，仅满足1-2次的临床治疗，很大程度上影响了给患者的治疗，而且多疗程治疗时需要再次采血，给予患者很大的精神压力。
[0004]附子多糖对免疫系统有重要的调节作用，不仅能激活T细胞、B细胞、NK细胞、细胞毒细胞和LAK，能有效促使树突状细胞成熟，还能促进白介素、肿瘤坏死因子α、集落刺激因子和干扰素等细胞因子的生成。本发明通过人外周血、骨髓或脐带血中白细胞，经体外纯化获得的单个核细胞，应用附子多糖和重组白介素2联合连续培养，简便地获得大量的NKl.1+和⑶8+ΝΚΤ细胞，并分泌IFN- Y。这样不仅可以满足多疗程NKT细胞免疫治疗，持续发挥NKT细胞的免疫功能，有助于提高临床疗效和延长患者生存期，而且应用附子多糖可以大大降低成本。
【发明内容】
[0005]现有技术主要通过从人外周血、骨髓或脐带血中分离纯化出单个核细胞，一般为20毫升到300毫升， 在多种细胞因子单独或组合诱导作用下，如重组人白介素2、重组人白介素15、重组人白介素4、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、重组人白介素12、重组人白介素18，或与α-半乳糖神经鞘胺醇(a-Galcer)联合诱导作用，连续培养获得NKT细胞，其数量是有限的，仅为5X IO8个细胞左右。若一次NKT细胞疫苗治疗至少使用5X IO8个细胞，最多能满足1-2次的治疗。另外，NKT细胞激活后可通过分泌IL-4和IFN- Y调节Th细胞的分化，从而实现对免疫应答和自身免疫的调节。因而，为了实现NKT细胞的抗肿瘤、抗病毒的免疫应答，还需要促使NKT细胞分泌IFN- Y，发挥Thl的细胞免疫应答作用。
[0006]NKT细胞能对外源性快速增殖的肿瘤细胞进行杀伤，NKT细胞需要持续地进行加强，维持对机体“非我”的肿瘤细胞进行杀伤，有效地抑制肿瘤细胞的复发和转移。因而NKT细胞疫苗在临床应用中需要进行多次治疗，更好地提高患者临床疗效和延长生存期。通过现有技术获得的NKT细胞数量，没法完成患者的多次的治疗和保证患者的长期疗效。
[0007]附子多糖具有促进B、T淋巴细胞增殖的作用，并促使人白细胞分泌干扰素Y、肿瘤坏死因子α等，促使淋巴细胞向Thl细胞分化，而介导免疫应答。本发明技术通过人外周血、骨髓和脐带血经体外纯化获得单个核细胞，经附子多糖和IL-2共同刺激作用，简便地增殖获得大量的NKT细胞，数量级可大于5 X IO9以上，每次治疗时使用0.5 X IO9NKT细胞，可用于多达5次以上。同时NKT细胞可表达NKl.1+和⑶8+，分泌IFN-Y，可产生对肿瘤细胞的Thl细胞免疫应答。
[0008]本发明涉及一种中药附子多糖诱导自然杀伤T细胞增殖的制备方法，其特征在于，包括如下工序:人外周血、骨髓或脐带血来源的单个核细胞，在中药附子多糖和人重组白介素2条件下连续培养，获得大量自然杀伤T细胞，表达NKl.1+和⑶8+，并分泌干扰素Y，在第14天时占淋巴细胞的比例12.61%以上，酶联免疫斑点检测干扰素Y为30个以上，数量级可达5 X IO9以上；具有有效的抗肿瘤和抗病毒的Thl细胞免疫应答功能。
[0009]采集的约50mL人外周血进行体外分离纯化，去除红细胞、血小板和粒细胞等，获得单个核细胞，单个核细胞用RPMI1640培养基重悬，苔盼兰染色计数，使用RPMI1640完全培养基(含 lug/mL-1000ug/mL 附子多糖，lIU-400IU/mL IL-2,10% (v/v)胎牛血清)调整到细胞浓度为1-5X106/mL，将细胞培养液放置到75cm2培养瓶中，每瓶30ml，于37°C、5%CO2培养箱中培养；
[0010]于第3、6、9、11、13、15、17天补充一倍体积的新鲜RPMI1640完全培养基(含Iug/mL-1000ug/mL 附子多糖，lIU-400IU/mLIL-2,10% (v/v)胎牛血清)，培养到第 14、16 和 18天收获NKT细胞；
[0011]优选地，本发明所述方法为:诱导培养NKT细胞使用的RPMI1640完全培养基优选为含有 10ug/mL-500ug/mL 附子多糖，5IU-200IU/mL IL-2,10% (v/v)胎牛血清。
[0012]将所述的NKT细胞进行细胞活率、细胞表型和干扰素Y酶联免疫斑点检测，细胞活率达到98%以上;其表达NKl.1+和CD8+分子，其中，NKl.1+和CD8+细胞为大于12.61%,干扰素Y酶联免疫斑点检测为30个以上。
[0013]培养到第7-12天收获的NKT细胞均可用于冻存，即将获得NKT细胞苔盼兰计数，5 X IO7个NKT细胞冻存1毫升，冻存管放置程序降温盒中，放入_80°C超低温冰箱过夜，第二天转至液氮冻存。NKT可在需要时复苏进行增殖培养，仍可保持同样的细胞活率、细胞表型以及分泌干扰素Y，促使Thl细胞免疫应答的功能。
[0014]优选地，本发明所述方法为:培养到第7天收获的NKT细胞均可用于冻存。
[0015]其中，优选的细胞活率检测方法为:计算培养到第14天的活细胞数。取ImL培养的培养液，1000rpm、4°C下离心10分钟，细胞用培养基重悬，取20ul细胞液用IXPBS稀释20倍，稀释液加入I倍体积的苔盼兰溶液，混匀后加入到细胞计数板，于倒置显微镜下观察计数，蓝色染色的为死细胞，不染色的为活细胞，细胞活率达到98%以上。
[0016]优选的细胞表型检测方法为:取苔盼兰染色计数后的2X IO6细胞，分两组，第一组分别添加到有20 μ L FITC标记鼠抗人⑶8单抗和20 μ L PE标记鼠抗人NKl.1单抗；第二组为同型对照，分别添加到有20 μ L FITC标记鼠IgGl和20 μ L PE标记鼠IgGl (BD公司)。置于4°C冰箱染色30分钟，然后用ImL的IX磷酸盐缓冲液洗涤三次，最后用0.5mL的IXPBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur基本型流式细胞仪检测。经检测，NKl.1+/CD8+细胞为 12.61%, NKl.1+细胞为 15.72%, CD8+细胞为 52.23%.检测结果表明通过本发明所述方法得到的细胞为NKT细胞具有表达其典型的表型。
[0017]NKT细胞通过斑点酶联反应试剂盒(美国R&D公司)检测干扰素Y分泌水平，NKT细胞形成很多IFN-Y的酶联斑点，表明其能分泌IFN-Y的能力，从而引发Thl细胞的免疫应答。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1表示本发明附子多糖诱导培养获得的NKT细胞的流式细胞图(FLl通路为FITC-CD8，FL2 通路为 PE-NK1.1)；
[0019]图2表示本发明附子多糖诱导培养的NKT细胞酶联免疫斑点试验检测干扰素Y分泌结果图。
【具体实施方式】
[0020]本发明发现通过中药附子多糖联合白介素2对人外周血、骨髓或脐带血经体外纯化的单个核细胞进行诱导，可简便地增殖获得大量的NKT细胞，数量级可大于5X 109，若每次治疗时使用0.5X IO9NKT细胞，`可用于多达5次以上。同时NKT细胞可表达NKl.1+和CD8+，分泌IFN-Y，可产生对肿瘤细胞的Thl细胞免疫应答获得特异的NKT细胞疫苗，可用于多达13次以上与3个疗程以上的临床应用。
[0021]对本发明涉及的一种大规模培养NKT细胞疫苗的制备方法进行具体说明。本发明涉及采用血细胞分离机通过采集人外周血中白细胞，经体外分离纯化获得大量的单个核细胞，在人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白介素4诱导培养获得大量未成熟NKT细胞；未成熟NKT细胞负载肿瘤特异抗原后，并在肿瘤坏死因子α与脂多糖诱导培养条件下获得具有抗肿瘤作用的成熟NKT细胞疫苗。
[0022]本发明涉及中药附子多糖诱导自然杀伤T细胞增殖的制备方法，其特征在于，包括如下工序:人外周血、骨髓或脐带血来源的单个核细胞，在中药附子多糖和人重组白介素2条件下连续培养，获得大量自然杀伤T细胞，表达NKl.1+和⑶8+，并分泌干扰素Y，在第14天时占淋巴细胞的比例12.61%以上，数量级可达5Χ109以上，干扰素、酶联免疫斑点检测为30个以上；具有有效的抗肿瘤和抗病毒的Thl细胞免疫应答功能。
[0023]采集的约50mL人外周血进行体外分离纯化，去除红细胞、血小板和粒细胞等，获得单个核细胞，单个核细胞用RPMI1640培养基重悬，苔盼兰染色计数，使用RPMI1640完全培养基(含 lug/mL-1000ug/mL 附子多糖，lIU-200IU/mL IL-2,10% (v/v)胎牛血清)调整到细胞浓度为1-5X106/mL，将细胞培养液放置到75cm2培养瓶中，每瓶30ml，于37°C、5%CO2培养箱中培养；
[0024]于第3、6、9、11、13、15、17天补充一倍体积的新鲜RPMI1640完全培养基(含Iug/mL-1000ug/mL 附子多糖，lIU-200IU/mLIL-2,10% (v/v)胎牛血清)，培养到第 14、16 和 18天收获NKT细胞；
[0025]优选地，本发明所述方法为:诱导培养NKT细胞使用的RPMI1640完全培养基优选为含有 10ug/mL-500ug/mL 附子多糖，5IU-200IU/mL IL-2,10% (v/v)胎牛血清。
[0026]将所述的NKT细胞进行细胞活率、细胞表型和干扰素Y酶联免疫斑点检测，细胞活率达到98%以上;其表达NKl.1+和CD8+分子，其中，NKl.1+和CD8+细胞为大于12.61%,干扰素Y酶联免疫斑点检测为30个以上。
[0027]培养到第7-12天收获的NKT细胞均可用于冻存，即将获得NKT细胞苔盼兰计数，5 X IO7个NKT细胞冻存I毫升，冻存管放置程序降温盒中，放入_80°C超低温冰箱过夜，第二天转至液氮冻存。NKT可在需要时复苏进行增殖培养，仍可保持同样的细胞活率、细胞表型以及分泌干扰素Y，促使Thl细胞免疫应答的功能。
[0028]优选地，本发明所述方法为:培养到第7天收获的NKT细胞均可用于冻存。
[0029]作为本发明制造方法中使用的细胞培养板、细胞培养皿、培养瓶、细胞培养袋，可例举，为75cm2细胞培养瓶、175cm2细胞培养瓶、250mL细胞培养袋等细胞培养用器材(容器)，均可用于本发明，优选细胞培养袋。
[0030]本发明的制造方法中对NKT细胞进行冻存，对冻存液无特殊限制，但优选例如为50%小牛血清、40%细胞培养液和10%二甲基亚砜，其中细胞培养液更优选为NKT细胞培养液。
`[0031]在培养基中可以添加血清或血浆进行培养。它们在培养基中的添加量不受特殊限制，如大于O容量％至20容量％，且可以根据不同的培养阶段而改变血清或血浆的用量，优选为5% (体积比)。例如，可以阶段性减少血清或血浆浓度来使用。另外，作为血清或血衆的来源，可以是自己(意味着与所培养的细胞来源相同)或非自己(意味着与所培养的细胞的来源不同)中的任一种，从安全性的观点出发，优选自己来源的血清或血浆。另外，也可以添加如人血清白蛋白之类经分离纯化的血清成分。
[0032]本发明的中药附子多糖诱导NKT细胞增殖的制备使用上述各种成分及培养基来实施。本发明中使用的培养培养条件也没有特殊限制，可以使用通常的细胞培养中使用的条件。例如，可在37°C、5% C02等条件下培养。还可以实施如下等操作:间隔适当的时间添加新鲜培养基来稀释细胞培养液，或更换培养基，或更换细胞培养用器材等。
[0033]本发明还提供NKT细胞在临床应用中多次多疗程的抗肿瘤治疗，更好地在生物体内发挥抗肿瘤免疫应答，达到很好的治疗效果。此外，上述NKT细胞还具有如下优点，多次多疗程NKT细胞治疗将更好地引发Thl细胞免疫应答，产生高效、长效地抗肿瘤免疫效应，因此非常利于患者疗效的提闻和生存期的延长。
[0034]以下，结合实施例对本发明做更具体的描述，但本发明不限于此。
[0035]实施例一
[0036]人外周血来源单个核细胞培养获得NKT细胞
[0037]乳腺癌患者，女，24岁，血常规检测结果为3.7 X IO9个白细胞/升，采集患者50ml外周血(与该患者签署知情同意书)；采集的外周血1500rpm离心10分钟，收集上层血浆，并在56°C水浴锅中灭活30分钟后，3000rpm离心10分钟获得自体血浆，备用。血细胞溶液用I倍体积的I XPBS (pH = 7.4)重悬后，加入1/4的0.6%羟乙基淀粉的生理盐水，混匀后静置30分钟，尽量吸取白色细胞层；白色细胞层经Ficoll-Hypaque密度梯度离心，得到单个核细胞用RPMI1640培养基重悬，苔盼兰染色计数为1.62X 108。
[0038]外周血单个核细胞用RPMI1640培养基调整到细胞浓度为3X106，培养基含有150ug/mL附子多糖，20IU/mL IL-2和10% (v/v)胎牛血清，加入到75cm2细胞培养瓶(康宁公司)中，在37°C、5%C02培养箱中孵育；在培养到第三天时补充I倍体积新鲜RPMI1640培养基，该新鲜培养基含150ug/mL附子多糖，20IU/mL IL-2和体积比10% (v/v)胎牛血清。
[0039]连续培养到第6天，将NKT细胞培养液转移至250mL细胞培养袋中，补充I倍体积的新鲜RPMI1640完全培养基(含150ug/mL附子多糖，20IU/mLIL-2，10% (v/v)胎牛血清)，继续于37 °C、5 % CO2培养箱中培养。于第9、11、13、15、17天补充I倍体积的新鲜RPMI1640完全培养基(含150ug/mL附子多糖，20IU/mLIL-2，10% (v/v)胎牛血清)，培养到第14、16和18天收获NKT细胞。
[0040]培养到第7天取其中I瓶NKT细胞，收获NKT细胞，苔盼兰计数，数量为18.7 X IO7,NKT细胞可冻存起来，50 X IO6个NKT细胞冻存I毫升，冻存管放置程序降温盒中，放入_80°C超低温冰箱过夜，第二天转至液氮冻存，以备用。
[0041]计算培养到第14天的活细胞数。取ImL最后一天培养的培养液，1000rpm、4°C下离心10分钟，细胞用RPMI1640培养基重悬，取20 μ L细胞液用lXPBS(pH7.4)稀释20倍，稀释液加入I倍体积的苔盼兰溶液，混匀后加入到细胞计数板，于倒置显微镜下观察计数，蓝色染色的为死细胞，不染色的为活细胞，细胞活率达到98%以上。
[0042]取苔盼兰染色计数后的2 X IO6细胞，分两组，第一组分别添加到有20 μ LFITC标记鼠抗人⑶8单抗和20 μ L PE标记鼠抗人NKl.1单抗；第二组为同型对照，分别添加到有20 μ L FITC标记鼠IgGl和20 μ L PE标记鼠IgGl (BD公司)。置于4°C冰箱染色30分钟，然后用ImL的IX磷酸盐缓冲液洗涤三次，最后用0.5mL的I XPBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur基本型流式细胞仪检测。经检测流式细胞结果见图一(FLl通路为 FITC-CD8，FL2 通路为 PE-NK1.1) ,NKl.1+/CD8+细胞为 12.61%, NKl.1+细胞为 15.72%,CD8+细胞为52.23%。检测结果表明通过本发明所述方法得到的细胞为NKT细胞具有表达其典型的NKl.1+表型。
[0043]实施例二
[0044]酶联免疫斑点实验(Elispot)检测NKT细胞分泌IFN- Y水平
[0045]用IFN-gamma 抗体包被 Elispot96_ 孔板:
[0046]在5ml PBS 中力卩入 lmg/mL 的抗人 IFN-Y 抗体 R4_6A2 (Pharmingen 公司-18181D) 25ul，使浓度达5ug/ml，每孔加入50ul，加盖4°C过夜。弃去包被抗体，用含10 %胎牛血清的完全培养基(RPM1-10)洗涤一次，每孔加入200ul完全培养基，加盖于室温封闭2小时，弃去培养基。
[0047]NKT细胞激活:
[0048](I)取培养到第14天NKT细胞，胎盘蓝计数，用R-5无酚红培养基稀释3个稀释度(1X106、3.3X105和1X105)。分别加入到IFNi抗体包被Elispot96孔板中，使每孔体积为IOOul。
[0049](2)实验组每孔加入IOOul含MHC-1限制性9肽(终浓度为lug/ml储存浓度Iug/ul，应为 1: 500 稀释)的 R1640-10。
[0050](3)对照组每孔加入IOOul培养基。[0051](4)阴性对照加入培养基。
[0052]混匀于37 °C，5 % CO2培养箱中培养24小时。
[0053]ELISP0T试剂盒操作:
[0054](I)用无菌水洗板2次，用I X洗涤缓冲液或PBST洗涤6次，每次洗涤时浸洗I~2min。
[0055](2)将抗体(生物素偶联鼠抗人IFN- Y抗体)加至12ml (10组量)的稀释缓冲液I中，终浓度为2ug/ml。
[0056](3)每孔加入50ul上步混合液，4°C过夜或室温2小时。
[0057](4)用I X洗涤缓冲液或PBST洗涤3次。
[0058](5)将链霉亲和素-辣根过氧化酶浓缩液A(BD公司)加至稀释缓冲液比值为1: 100，每孔加入50ul混合液。
[0059](6) 4 °C过夜，用PBST洗涤4次，用PBS洗涤2次。[0060](7)每孔加50ul Elispot染色液(AEC底物，货号:551951, 20ul的色原体(chronogen)加入到ImL的AEC底物溶液中)。
[0061](8)避光室温放置5-60分钟，弃去染色液，用蒸馏水洗涤
[0062](9)室温空气干燥2小时或过夜干燥，保存数据。
[0063]96孔Elispot板通过酶联斑点图像自动分析仪检测斑点数，图2中为酶联斑点图像自动分析仪检测图和斑点计数结果，左侧为相应稀释度的对照组，无IFN-Y Elispot斑点产生；右侧为3个稀释度的试验组，IFN- Y Elispot斑点分别为37个、12个和8个；表明本发明制备的NKT细胞能分泌出IFN-Y细胞因子，在IO6的数量级是IFN-YElispot斑点可达到30个以上。
[0064]实施例三
[0065]患者外周血来源NKT细胞的培养
[0066]患者一:乳腺癌患者，女，34岁，血常规检测结果为6.1 X IO9个白细胞/升。
[0067]患者一:肝癌患者，男，36岁，血常规检测结果为3.6X109个白细胞/升。
[0068]患者三:黑色瘤患者，男，56岁，血常规检测结果为7.0XlO9个白细胞/升。
[0069]患者四:卵巢癌患者，女，45岁，血常规检测结果为6.6X IO9个白细胞/升。
[0070]患者五:肺癌患者，男，49岁，血常规检测结果为4.7X IO9个白细胞/升。
[0071]与患者均签署知情同意书。
[0072]采集患者50mL外周血经Ficoll-Hypaque密度梯度离心,得到单个核细胞。患者一、患者二和患者三按照实施例一的方法中药附子多糖诱导培养NKT细胞。
[0073]患者四和患者五外周血来源的单个核细胞应用现有技术进行诱导培养，即使用含100ng/mL α -半乳糖神经鞘胺醇(a-Galcer)、50IU/mL白介素2和10% (v/v)胎牛血清的RPMI1640培养基(美国Gibco公司)进行连续培养，使用75cm2培养瓶进行扩瓶，并连续培养到第18天。
[0074]采用苔盼兰染色计算培养到14天的NKT细胞数和细胞活率，以及NKT细胞通过流式抗体染色和流式细胞仪检测，分析细胞表型；取IO6个NKT细胞通过Elispot检测NKT细胞分泌IFN-Y水平。
[0075]表一
【权利要求】
1.中药附子多糖诱导自然杀伤T细胞(NatureKiller T cell，NKT)增殖的制备方法，其特征在于人外周血、骨髓或脐带血来源的单个核细胞，在中药附子多糖和人重组白介素2条件下连续培养，获得大量自然杀伤T细胞，表达NKl.1+和⑶8+，并分泌干扰素Y，在第14天时占淋巴细胞的比例12.15%以上，数量级可达5X IO9以上。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于人外周血、骨髓或脐带血经体外分离纯化，去除红细胞、血小板和粒细胞等，获得单个核细胞，单个核细胞用RPMI1640培养基重悬，苔盼兰染色计数，使用RPMI1640完全培养基(含lug/mL-1000ug/mL附子多糖，lIU-400IU/mL IL-2,10% (v/v)胎牛血清)调整到细胞浓度为1_5X 106/mL，将细胞培养液放置到75cm2培养瓶中，每瓶30ml，于37°C、5% CO2培养箱中培养； 于第3、6、9、11、13、15、17天补充一倍体积的新鲜RPMI1640完全培养基(含Iug/mL-1000ug/mL 附子多糖，IIU-400IU/mLIL-2,10% (v/v)胎牛血清)，培养到第 14、16 和 18天收获NKT细胞。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，诱导培养NKT细胞使用的RPMI1640完全培养基优选为含有10ug/mL-500ug/mL附子多糖，5IU-200IU/mL IL-2,10% (v/v)胎牛血清。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将所述的NKT细胞进行细胞增殖和细胞表型检测，苔盼兰计数细胞增殖达到5X IO9以上；其高表达NKT细胞表型NKl.1+和CD8+，并分泌干扰素Y (IFNi)，其中，在第14天NKT细胞中含NKl.1+和CD8+双阳性细胞为12.61%以上，酶联免疫斑点检测干扰素Y为30个以上。
5.权利要求1-4所述 制备NKT满足在临床抗肿瘤、抗病毒治疗中的应用。
【文档编号】C12N5/0783GK103834614SQ201410087827
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月12日 优先权日:2014年3月12日
【发明者】金光瑞, 王琳 申请人:甘肃中科生物科技有限公司