一种低温木聚糖酶XynAGN16及其基因、重组载体、重组菌株的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种低温木聚糖酶XynAGN16及其基因、重组载体、重组菌株。本发明提供了一种来源于节杆菌（Arthrobacter?sp.）的木聚糖酶XynAGN16，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，且本发明提供了上述木聚糖酶的编码基因xynAGN16，木聚糖酶基因xynAGN16的重组载体和木聚糖酶基因xynAGN16的重组菌株。本发明的木聚糖酶具有以下性质：最适pH6.5；最适温度为45℃，在0℃、10℃及20℃下分别具有17.2%、27.6%和41.8%的酶活；在60℃下处理1h，剩余酶活分别为23.3%，比其它低温木聚糖酶稳定。本发明的木聚糖酶可应用于饲料及食品行业。
【专利说明】—种低温木聚糖酶XynAGN16及其基因、重组载体、重组菌株
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程【技术领域】，具体地说是一种具有低温活性的木聚糖酶XynAGN16及其基因、重组载体、重组菌株。
【背景技术】
[0002]半纤维素是植物细胞壁的主要组分，是自然界中继纤维素之后的第二丰富碳水化合物。木聚糖是半纤维素的重要组分，广泛存在于蕨类、裸子植物和被子植物中，如农业副产物中的玉米芯、麦麸、米糠、秸杆和甘蔗渣等。木聚糖酶是可将木聚糖主链和侧链降解的一类酶，包括内切-1, 4-β -D-木聚糖酶(endo-1, 4-β -D-xylanase, EC3.2.1.8)、α -L-阿拉伯呋喃糖苷酶(a -L-arabinofuranosidase, EC3.2.1.55)、a -D-葡糖醒酸糖苷酶(a -D-glucuronidase, EC3.2.1.139)和 β -D-木糖苷酶(β -D-xylosidase,EC3.2.1.37)等(Collins et al.FEMS Microbiol Rev, 2005, 29:3 - 23.)D 根据氨基酸序列同源性，木聚糖酶主要归类于糖苷水解酶第10、11、30、39、43、52、62和67家族(Finn etal.Nucleic Acids Res, 2008，36:D281 - D288.)。内切-1，4-β-D-木聚糖酶，也就是我们通常所说的木聚糖酶，主要归类于糖苷水解酶第10和11家族。在木聚糖的降解过程中，内切-1，4- β -D-木聚糖酶可随机地切割木聚糖的主链骨架，生成木糖或低聚木糖，是木聚糖降解相关酶中研究最多和最有应用价值的一类酶。
[0003]内切-1，4-β -D-木聚糖酶在饲料、食品、酿酒、纺织及造纸等领域具有广泛的应用性，如内切-1，4_i3-D-木聚糖酶在饲料行业中可改善饲料性能并消除或降低抗营养作用、在造纸和纸浆工业中可取代有毒的漂白用化学物质但仍能使纸张达到漂白效果、在酿酒行业中可改善酒的色泽并增加酒精的产率、在食品行业中可改善食品性能、在纺织业中可辅助原料脱胶等。低温木聚糖酶在低温环境中具有较高的酶活，可用于低温到中温的生境或加工过程，相对于中温或高温木聚糖酶有其特有的应用优势(Gerday et al.TrendsBiotechnol, 2000, 18:103 - 107)，如水产生境常常为10 - 25°C、食品行业中的醒面和杆面过程需要在35°C以下进行等。将中温或者高温加工的过程转为低温加工过程还可起到降低能耗的作用(Beg et al.Appl Microbiol Biotechnol, 2001，56:326 - 338.)。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种具有低温活性的木聚糖酶。
[0005]本发明的再一目的是提供编码上述木聚糖酶的基因。
[0006]本发明的另一目 的是提供包含上述基因的重组载体。
[0007]本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
[0008]本发明所述木聚糖酶XynAGN16可得自节杆菌(Arthrobacter sp.)。XynAGNl6的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0009]本发明的木聚糖酶XynAGN16总共含1212个氨基酸，理论分子量为131.6kDa。该酶的最适pH值为6.5，在pH6.0-8.0的范围内维持50%以上的酶活性，在pH9.0 - 11.0的范围内维持20%以上的酶活性；经pH7.0-12.0的缓冲液处理lh，该酶酶活剩余达45%以上；该酶最适温度为45°C，在0°C、10°C及20°C下分别具有17.2%,27.6%和41.8%的酶活；在37°C、50°C和60°C下处理lh，剩余酶活分别为52.4%、21.2%和23.3% ;该酶可水解燕麦木聚糖、桦木木聚糖和山毛榉木聚糖，不能水解羧甲基纤维素纳、普鲁兰多糖和β -葡聚糖。
[0010]本发明提供了编码上述木聚糖酶的基因xynAGN16，该基因序列如SEQ ID N0.2所示。
[0011]本发明通过基因组测序的方法克隆了木聚糖酶XynAGN16的编码基因xynAGN16，其全长3639bp，起始密码为ATG，终止密码为TGA。经氨基酸序列同源比对，该木聚糖酶XynAGN16为多结构域蛋白，从N端到C端依次为糖苷水解酶第10家族结构域、多聚糖脱乙酰酶结构域(polysaccharide deacetylase)、碳水化合物结合结构域(CBM_4_9)和糖苷水解酶第10家族结构域。GenBank中还未检索到与XynAGN16有相似结构域构成的木聚糖酶。木聚糖酶XynAGN16与Cellulomonas fimi JCFX5来源的潜在木聚糖酶(CAA90745)具有最高的一致性，为30.7%。以上分析说明木聚糖酶XynAGN16是一种新的木聚糖酶。
[0012]本发明还提供了包含上述木聚糖酶基因xynAGN16的重组载体，优选为pET-xynAGN16。将本发明的木聚糖酶基因插入到表达载体中，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，将本发明的木聚糖酶基因插入到质粒pET-28a ( + )上的HindIII和NotI限制性酶切位点之间，得到重组大肠杆菌表达质粒pET_xynAGN160
[0013]本发明还提供了包含上述木聚糖酶基因xynAGN16的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21 (DE3)/xynAGN16。
[0014]本发明制备木聚糖酶XynAGNie的方法按以下步骤进行:
[0015]I)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
[0016]2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达；
[0017]3)回收所表达的木聚糖酶XynAGN16。
[0018]其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21 (DE3)，得到重组菌株BL21 (DE3)/xynAGN16。
[0019]本发明提供了一个新的木聚糖酶基因，其编码的木聚糖酶最适pH值为6.5，在pH6.0-8.0的范围内维持50%以上的酶活性，在pH9.0 - 11.0的范围内维持20%以上的酶活性；经PH7.0-12.0的缓冲液处理lh，该酶酶活剩余达45%以上；该酶最适温度为45°C，在(TC、10。。及20°C下分别具有17.2%,27.6%和41.8%的酶活；在37°C、50°C和60°C下处理lh，剩余酶活分别为52.4%、21.2%和23.3% ;该酶可水解燕麦木聚糖、桦木木聚糖和山毛榉木聚糖，不能水解羧甲基纤维素纳、普鲁兰多糖和β_葡聚糖。该酶可应用于饲料及食品行业。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1:在大肠杆菌中表达的重组木聚糖酶XynAGN16的SDS-PAGE分析，其中，M:蛋白质Marker ；CK:含有载体pET_28a ( + )的大肠杆菌菌体破碎上清液；S:含有重组载体pET-xynAGN16的大肠杆菌菌体破碎上清液。[0021]图2:重组木聚糖酶XynAGN16的pH活性。
[0022]图3:重组木聚糖酶XynAGN16的pH稳定性。
[0023]图4:重组木聚糖酶XynAGN16的热活性。
[0024]图5:重组木聚糖酶XynAGN16的热稳定性。
【具体实施方式】
[0025]以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
[0026]试验材料和试剂
[0027]1、菌株及载体:节杆菌(Arthrobacter sp.)同文献报道菌种性质,如中国普通微生物菌种保藏管理中心菌株Arthrobacter citreus CGMCC1.1893 ;大肠杆菌Escherichiacoli BL21 (DE3)和表达载体 pET_28a ( + )购于 Novagen 公司。[0028]2、酶类及其它生化试剂:DNA聚合酶、限制性内切酶和dNTP购自TaKaRa公司；燕麦木聚糖、桦木木聚糖、山毛榉木聚糖、羧甲基纤维素纳、普鲁兰多糖和β_葡聚糖购自 Sigma 公司；Genomic DNA Clean&Concentration 试剂盒购自 Zymo Research 公司，TureseqTM DNA Sample Preparation Kit购自Illumima公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
[0029]3、培养基:
[0030]LB 培养基:PeptonelOg, Yeast extract5g, NaClIOg,加蒸懼水至 1000ml, pH 自然(约为7)。固体培养基在此基础上加2.0% (w/v)琼脂。
[0031]说明:以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
[0032]实施例1:木聚糖酶基因xynAGN16的克隆
[0033]提取节杆菌基因组DNA:将液体培养2d的菌液离心取菌体，加入ImL溶菌酶，37°C处理 60min，再加入裂解液，裂解液组成为:50mM Tris, 20mM EDTA, NaC1500mM, 2%SDS (w/v),pH8.0, 70°C水浴裂解60min,每隔IOmin混匀一次，在4°C下1000Orpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4°C下1000Orpm离心lOmin。弃上清,沉淀用70%的乙醇洗漆两次,真空干燥,加入适量TE溶解，置于-20°C备用。
[0034]用超声打断仪Biorupter将5μ g的节杆菌基因组打断为400 - 600bp的片段，用Genomic DNA Clean&Concentration试剂盒对打断的DNA片段进行纯化，纯化后用TureseqTM DNA Sample Preparation Kit进行DNA片段的末端补平、3’端加A喊基和加接头、及DNA片段的PCR扩增(操作按试剂盒说明书进行)。用MiSeq基因组测序仪(Illumima公司)对上述制备好的文库进行基因组测序。
[0035]基因组测序得到的数据经读码框预测和本地BLAST比对，得到木聚糖酶基因xynAGN16，该基因序列如SEQ ID N0.2所示。
[0036]实施例2:重组木聚糖酶XynAGN16的制备
[0037]以 5’CCCAAGCTTGCGTGCAGCCGGAGGAAAAACGTC3’ 和 5’ATAAGAATGCGGCCGCGTGCCTTCCGTGGTGCCGGT3’为引物对，节杆菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应参数为:94°C变性 5min ;然后 94°C变性 30sec，63°C退火 30sec，72°C延伸 3min30sec，30 个循环后72°C保温lOmin。PCR结果得到木聚糖酶基因xynAGN16，并在该基因5’和3’端分别引入了 HindIII和NotI酶切位点。将编码木聚糖酶的基因xynAGN16进行双酶切(Hindm和NotI),同时将表达载体pET-28a ( + )进行双酶切(Hindm和Notl)，将上述酶切的木聚糖酶基因xynAGN16与表达载体pET_28a ( + )相连接，获得含有木聚糖酶基因xynAGN16的重组质粒pET-xynAGN16，将pET_xynAGN16转化大肠杆菌BL21 (DE3)，获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/xynAGN16。
[0038]取含有重组质粒pET-xynAGN16的重组大肠杆菌菌株BL21 (DE3)/xynAGN16，以0.1%的接种量接种于LB (含50μ g Hir1Kan)培养液中，37°C快速振荡16h。然后将此活化的菌液以1%接种量接种到新鲜的LB (含50 μ g mLlan)培养液中，快速振荡培养约2 - 3h(OD600达到0.6 - 1.0)后，加入终浓度0.7mM的IPTG进行诱导，于20°C继续振荡培养约20h或26°C振荡培养约8h。12000rpm离心5min，收集菌体。用适量的pH7.0Tris-HCl缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体，破碎后经13，OOOrpm离心lOmin，吸取上清进行SDS-PAGE分析。以上过程以含有载体pET-28a( + )的大肠杆菌菌株为对照{将pET_28a(+ )转化大肠杆菌BL21 (DE3)，即获得含有载体pET-28a ( + )的大肠杆菌菌株}。SDS-PAGE结果(图1)表明，在大约130Kda的位置，含有载体pET-28a ( + )的大肠杆菌菌体破碎上清液无条带，而含有重组载体pET-xynAGN16的大肠杆菌菌体破碎上清液有明显条带；同时，含有载体pET-28a ( + )的大肠杆菌菌体破碎上清液无木聚糖酶酶活，而含有重组载体pET-xynAGN16的大肠杆菌菌体破碎上清液有木聚糖酶酶活。以上结果说明重组木聚糖酶XynAGN16在大肠杆菌中得到了表达。
[0039]实施例3:重组木聚糖酶XynAGN16的性质测定
[0040]1、重组木聚糖酶XynAGN16的活性分析
[0041]实施例2重组木聚糖酶XynAGN16的活性测定方法采用3，5 一二硝基水杨酸(DNS)法:将底物溶于0.1M缓冲液中，使其终浓度为0.5% (w/v);反应体系含100 μ L适量酶液，900 μ L底物；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液后再反应lOmin，然后加1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min，冷却至室温后在540nm波长下测定OD值。I个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟分解底物产生I μ mol还原糖(以木糖计)所需的酶量。
[0042]2、重组木聚糖酶XynAGN16的pH活性和pH稳定性测定:
[0043]酶的最适pH测定:将木聚糖酶XynAGN16在37°C下和0.1M pH5.0 - 12.0的缓冲液中进行酶促反应。酶的PH稳定性测定:将酶液置于0.1M pH5.0-12.0的缓冲液中，在37°C下处理lh，然后在pH6.5及37°C下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。缓冲液为:0.1M McIlvaine buffer (ρΗ5.0-8.0)和 0.1Mglycine-NaOH (ρΗ9.0 - 12.0)。以山毛榉木聚糖为底物，反应lOmin，测定XynAGN16的酶学性质。结果表明:XynAGN16的最适pH为6.5，在pH6.0-8.0的范围内维持50%以上的酶活性，在pH9.0 - 11.0的范围内维持20%以上的酶活性(图2);经pH7.0 - 12.0的缓冲液处理lh，该酶酶活剩余达45%以上(图3)。
`[0044]3、重组木聚糖酶XynAGN16的热活性及热稳定性测定:
[0045]酶的最适温度测定:在pH6.5的缓冲液中，于O - 70°C下进行酶促反应。酶的热稳定性测定:将同样酶量的酶液置于37°C、50°C和60°C中，处理O -60min后，在pH6.5及37°C下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以山毛榉木聚糖为底物，反应lOmin，测定XynAGN16的酶学性质。结果表明:XynAGN16的最适温度为45°C，在(TC、10°C及20°C下分别具有17.2%,27.6%和41.8%的酶活(图4);该酶在37°C、50°C和60°C下处理lh，剩余酶活分别为52.4%、21.2%和23.3% (图5)。该结果表明重组木聚糖酶XynAGN16具有低温活性，同时在60°C时的热稳定性要优于已报导的低温木聚糖酶(专利号:ZL201010238563.6、ZL201110360254.0 和 ZL201110142556.0)
[0046]4、不同金属离子及化学试剂对重组木聚糖酶XynAGN16活力的影响:
[0047]在酶促反应体系中加入10.0mM的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。在37°C及pH6.5条件下，以山毛榉木聚糖为底物测定酶活性。结果(表1)表明，10.0mM的SDS 和 HgCl2 可完全抑制 XynAGN16，AgN03、MnSO4 和 ZnSO4 对 XynAGN16 的抑制较强，PbAC 和FeSO4对XynAGN16的抑制较弱，其余金属离子和化学试剂对XynAGN16的影响较小。
[0048]表1.金属离子及化学试剂对重组木聚糖酶XynAGN16活力的影响
【权利要求】
1.一种木聚糖酶XynAGN16，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.—种编码权利要求1所述的木聚糖酶XynAGN16的木聚糖酶基因xynAGN16，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.一种包含权利要求2所述木聚糖酶基因xynAGN16的重组载体。
4.一种包 含权利要求2所述木聚糖酶基因xynAGN16的重组菌株。
【文档编号】C12N15/56GK103834627SQ201410087811
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月11日 优先权日:2014年3月11日
【发明者】黄遵锡, 周峻沛, 张蕊, 唐湘华, 李俊俊, 许波, 丁俊美, 沈骥冬, 高雅洁 申请人:云南师范大学