一种鉴别花鳗鲡和太平洋双色鳗鲡苗种的引物和方法
【专利摘要】本发明应用微卫星标记对花鳗鲡（Anguilla?marmorata）和太平洋双色鳗鲡（Anguilla?bicolor?pacifica）苗种进行鉴别，发明的一对引物命名为E-EEL170，序列如SEQ?ID?No.1和2所示。鉴定时用普通DNA提取试剂盒提取2种鳗鲡鳗苗基因组DNA并用该对引物对2种鳗鲡DNA样品进行PCR扩增，再用1%琼脂糖凝胶(EB染色)电泳对PCR产物进行检测，250bp左右大小的条带为花鳗鲡鳗苗，500bp左右大小的条带为太平洋双色鳗鲡鳗苗。本发明仅需剪取少量尾鳍而不处死鱼苗即可进行鉴别，具有稳定性高、重复性好、实用性强、操作简单并可快速准确鉴别等优点。
【专利说明】一种鉴别花鳗鲡和太平洋双色鳗鲡苗种的引物和方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于水产养殖学领域分子标记技术在生产实践中的应用。具体地说，本发明涉及应用微卫星标记技术对花鳗鲡和太平洋双色鳗鲡苗种进行鉴别。
【背景技术】
[0002]花鳗鲡(Anguilla marmorata)隶属于硬骨鱼纲、鳗鲡目、鳗鲡科、鳗鲡属，俗称鱼卢鳗，大鳗，鳗王，鳝王等，属于降河洄游性鱼类，花鳗鲡分布于中国、澳大利亚、日本、东南亚和非洲等热带、亚热带地区，在我国福建、广东、广西、海南和台湾均有零星分布。花鳗鲡营养丰富，蛋白质含量高于同属鳗鲡，同时脂肪含量远低于同属鳗鲡，氨基酸组分丰富齐全，又称“淡水人参”，是一种经济价值极高的名贵鱼类，1988年被列为国家二级野生保护动物。
[0003]太平洋双色鳗鲡(Anguilla bicolor pacifica)同属于硬骨鱼纲、鳗鲡目、鳗鲡科、鳗鲡属，俗称黑鳗，也属于降河洄游性鱼类。该鳗鲡分布于印度太平洋区，我国两广、台湾和菲律宾附近海域为太平洋双色鳗鲡的主要产地。
[0004]花鳗鲡和太平洋双色鳗鲡各具特色，太平洋双色鳗鲡虽然生长性能优异，生长速度快于花鳗鲡，具集约化养殖的潜力，但是口感和营养价值均不及花鳗鲡。目前2种鳗鲡市场需求量与日俱增，在我国南部沿海和东南亚等地两种鱼的养殖规模也在逐年扩大，苗种需求量也大幅度的增加，随之而来的是鳗苗的来源问题。由于花鳗鲡和太平洋双色鳗鲡在鳗苗期外观体型十分相似，即使是养殖经验丰富的渔民用肉眼也难以区分2者。多年来鳗鲡的人工繁殖技术仍未有所突破，花鳗鲡和太平洋双色鳗鲡的苗种均通过捕捞天然玻璃鳗获得，而2种鳗苗的产区混杂，在菲律宾海域以及我国海南海域一带捕捞到的往往是2种鳗苗的混合群体。致使我国鳗苗市场常常鱼龙混杂，但由于2种鳗鲡苗种的需求对象不同，且2种商品鳗鲡市场价格相差很大。若不能有效地把2种鳗苗区分出来，将极大影响到养鳗企业和渔民的经济效益。
[0005]由于花鳗鲡鳗苗和太平洋双色鳗鲡鳗苗在形态学上的相近和产地的混杂，迫切需要找到一种高效而且准确的方法去区分这2种鳗苗。而基因组中的微卫星DNA遵守孟德尔遗传法则，呈共显性表达，且同时具有分布广、遗传信息含量高和便于PCR检测等优点，已被广泛用于鱼类亲缘关系鉴定、遗传多样性分析、遗传连锁图构建及系统进化等方面的研究。研究表明:微卫星侧翼序列在属内种间和有较近亲缘关系的属间相当保守。因此，鉴于2种鳗苗形态学鉴定的不确定性，我们利用微卫星分子标记技术对2种鳗鲡苗种进行鉴别区分，从而指导我国鳗鲡产业的健康发展。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种快速准确鉴别花鳗鲡和太平洋双色鳗鲡苗种的鉴别引物和方法，以克服现有从形态学上鉴定存在主观性强且不能有效地鉴定2种鳗苗的缺陷，本发明只需剪取少量尾鳍而不处死鳗苗即可进行鉴别，具有稳定性高、操作简单重复性好、实用性强并可快速准确鉴别等优点。[0007]本发明的技术方案是
[0008]一种花鳗鲡鳗苗和太平洋双色鳗鲡苗种的鉴别引物，命名为E-EEL170，序列如下:
[0009]F:5，-GCCCGAAAATACCAAGATGA-3, (SEQ ID N0.1)
[0010]R:5，-CCTGCTCCCAAAACATCCTA-3, (SEQ ID N0.2)
[0011]本发明还公开了花鳗鲡和太平洋双色鳗鲡苗种的鉴别方法，包括下列步骤:
[0012]I)提取鳗鲡鉴定样品DNA ；
[0013]2)用上述引物对步骤I)提取的样本进行DNA扩增，获得PCR产物；
[0014]3)用1%琼脂糖凝胶(EB染色)电泳对PCR产物进行检测，250bp左右大小的条带为花鳗鲡，500bp左右大小的条带为太平洋双色鳗鲡。
[0015]本发明是首次基于分子生物学手段建立起对花鳗鲡和太平洋双色鳗鲡苗种进行鉴别的方法，利用从花鳗鲡中合成、筛选的特异微卫星引物E-EEL170，建立了一个普通的PCR反应就可以实现鉴别2种鳗鲡种质的新方法。本方法无需依赖专业的鱼类分类学知识，也不需要具有长期从事鱼类鉴别的丰富经验，仅需取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测得到稳定、清晰、差异明显的扩增条带，成本低，操作简单，实用性强，可以用于指导鳗鲡养殖生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1:E_EEL170引物在花鳗鲡和太平洋双色鳗鲡2个群体中的扩增结果。
[0017]M-Marker ;1_10为花鳗鲡；11-20为太平洋双色鳗鲡。
【具体实施方式】
[0018]以下结合附图实施例对本发明作进一步的详细描述。
[0019]实施例
[0020]1.花鳗鲡和太平洋双色鳗鲡基因组DNA的提取及定量
[0021]采用北京Trans海洋生物基因组试剂盒快速提取2种幼鳗尾鳍10~30mg。(来源于海南岛南部海域，体长7~10cm，经形态学综合鉴定，确定为花鳗鲡鳗苗和太平洋双色鳗鲡鳗苗各10尾)的DNA，试剂盒提取样品DNA较之传统方法提取样品DNA具有提取效率高、速度快、提取DAN质量高等特点。
[0022]2.微卫星位点的筛选及引物的合成
[0023]将I中所得花鳗鲡鳗苗样品的基因组DNA交给生物公司测序，利用所得数据筛选出微卫星位点并合成其引物。
[0024]3.花鳗鲡鳗苗和太平洋双色鳗鲡苗鉴别引物的筛选
[0025]用PCR仪检验2中引物在花鳗鲡鳗苗和太平洋双色鳗鲡鳗苗中的扩增情况
[0026]I) PCR扩增体系
[0027]PCR扩增反应体系如下:灭菌水(12.3 μ L)，10 X buffer缓冲液(2 μ L)，2mM的dNTP (2μ L)，2.5mM 的 Mg2+ (1.5μ L),5U 的 Taq 酶(0.2 μ L)，IOuM 正反引物(各 0.5 μ L)，鳗苗模板DNA (lyL)。
[0028] 2) PCR扩增反应[0029]在PCR扩增仪上于94°C预变性5min，30个循环:94°C变性30sec，49 °C下退火30sec，72°C延伸 lmin，最后 72°C延伸 5min，4°C保存。
[0030]3)琼脂糖凝胶电泳检测
[0031]取PCR扩增反应产物5 μ L进行琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色并用紫外凝胶成像系统拍照。
[0032]4)鉴别引物的确定
[0033]挑选出能在花鳗鲡鳗苗和太平洋双色鳗鲡鳗苗中成功扩增且产物经3)检测可得出明显差别条带的一对引物，所述的引物序列为:
[0034]F:5，-GCCCGAAAATACCAAGATGA-3, (SEQ ID N0.1)；
[0035]R:5, -CCTGCTCCCAAAACATCCTA-3, (SEQ ID N0.2)。
[0036]此对引物所得产物的电泳图如图1所示，根据电泳条带与标准Marker比较:250bp左右大小的条带为花鳗鲡鳗苗，500bp左右大小的条带为太平洋双色鳗鲡鳗苗。
[0037]4.其他鳗鲡属鳗苗干扰的排除
[0038]在菲律宾海域以及我国海南海域一带捕捞到的往往是花鳗鲡鳗苗和太平洋双色鳗鲡鳗苗的混合群体，属于热带鳗鲡种类，可排除同属其它鳗鲡种类的干扰。
【权利要求】
1.一种花鳗鲡和太平洋双色鳗鲡苗种的鉴别引物，其特征在于所述该引物命名为E-ELL170，其序列如下: F:5，-GCCCGAAAATACCAAGATGA-3,；
R:5，-CCTGCTCCCAAAACATCCTA-3,。
2.一种花鳗鲡和太平洋双色鳗鲡苗种的鉴别方法，其特征在于，包括下列步骤: 1)提取待鉴定的鳗苗DNA； 2)用权利要求1所述引物对步骤1)提取的样本进行DNA扩增，获得PCR产物； 2)用1%琼脂糖凝胶EB染色电泳对PCR产物进行检测，250bp大小的条带为花鳗鲡鳗苗，500bp大小的条带为太平洋双色鳗鲡鳗苗。
【文档编号】C12N15/11GK103911444SQ201410101871
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年3月19日 优先权日:2014年3月19日
【发明者】尹绍武, 王小鲁, 贾一何, 李丽, 许芳, 胡亚丽 申请人:南京师范大学