重组人dkk1多表位核酸疫苗、其制备方法及应用的制作方法

重组人dkk1多表位核酸疫苗、其制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种新型的重组人DKK1多表位核酸疫苗，其核酸序列为编码人DKK1的4段（110-144aa、153-181aa、182-216aa、228-253aa）免疫原性较高的片段与T细胞表位片段的融合序列。实验表明，重组人DKK1多表位核酸疫苗免疫小鼠产生的抗体能够拮抗DKK1的生物学活性，发挥拮抗骨破坏的作用，有可能经开发用于治疗类风湿关节炎等疾病。本发明提供的核酸疫苗属于治疗性疫苗，可为类风湿关节炎等疾病提供一种新的治疗途径和思路。该疫苗制备简单、成本低廉、稳定性好、贮存方便，且具有良好的免疫原性，适于规模化生产。
【专利说明】重组人DKK1多表位核酸疫苗、其制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体地说，涉及重组人DKKl多表位核酸疫苗、其制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis, RA)是一种慢性系统性自身免疫性疾病，以侵蚀性滑膜炎及对称性、破坏性关节病变为主要病理学特征。最终可导致患者关节畸形和功能丧失，是造成人群劳动力丧失与致残的主要病因之一，给个人和社会带来沉重的负担。
[0003]由RA慢性、持续性炎症最终导致骨侵蚀的机制尚不清楚。因此，研究RA发病及骨损害的分子机制至关重要。近年来，越来越多的研究表明，fct信号通路在RA发病过程中起重要作用。fct信号可直接影响多潜能的前体细胞向软骨细胞和成骨细胞(Osteoblast, 0B)分化的过程，并且通过上调0PG/RANKL/RANK系统中0PG/RANKL的比率影响破骨细胞(Osteoclast, 0C)的发育成熟。目前，Wnt信号通路主要由两条途径调节骨代谢:(O经典途径:Wnt/ β -catenin信号通路，主要通过富集细胞内的β -catenin,进而促进β-catenin进入细胞核，调控下游成骨细胞靶基因的表达，促进成骨细胞分泌I型胶原而加速骨组织矿化，促进间充质前体和骨-软骨细胞前体增殖分化为成骨细胞和软骨细胞，延长成骨细胞的存活时间；并且抑制成骨细胞和破骨细胞的偶联，调节骨保护素(osteoprtegerin, 0PG)和核因子-κ B 受体活化因子配体(Receptor activator ofnuclear factor- κ B ligand, RANKL)的表达,影响骨吸收；使包埋在骨基质中的骨细胞最终分化为成骨细胞，并改变0B/0C的胞外基质以及在骨表面的定位，刺激骨折修复和影响骨重塑。(2)旁路途经:Wnt/Ca2+信号通路，主要通过调节G蛋白激活胞质中多种对Ca2+敏感的酶，包括磷脂酶 C (phospholipase C, PLC),蛋白激酶 C (protein kinase C, PKC)和钙离子-1丐调素依赖性蛋白激酶II (calcium-calmodulin dependent kinase II, CamKII)等，进而调节细胞内Ca2+的释放；Wnt/PCP(Planar Cell Polarity)信号通路,主要通过小G蛋白RhoA和Cdc42等激活JNK (Jun N-terminal kinase),促进软骨细胞的去分化。目前为止，这些途径在骨和骨细胞的作用尚不很清楚。
[0004]DKKl是Wnt信号通路的抑制因子，属于DKK家族中的一员。DKK家族是在进化过程中很保守的一个基因家族，在脊椎动物中包括DKK1、2、3、4四个成员，都是分泌型糖蛋白，其中DKK1、2、4可以参与调控Wnt信号通路，尤其以DKKl抑制Wnt通路而介导骨破坏的途径及其拮抗剂的研究最为重视。人类DKKl基因位于10号染色体IOqll.2，其编码的分泌性糖蛋白由266个氨基酸组成，结构上包括三个部分:(I)一个N端的信号序列，介导DKKl肽链穿越粗面内质网并分泌至细胞外。(2)两个保守的半胱氨酸富集区域。(3)靠近蛋白质C端的N-糖基化位点。DKKl是成骨细胞生长和分化的重要调节因子，DKKl与Wnt蛋白竞争性结合膜受体LRP5/6,并与膜受体Kremen结合,形成DKKl-LRP-Kremen复合体,经由吞饮作用进入胞衆并被溶酶体分解，从而减少了 Wnt膜表面受体的数量,抑制Wnt/ β -catenin信号通路活性，下调胞浆β -catenin水平，抑制成骨细胞生长和分化的转录因子，使成骨细胞数量减少、活性降低、寿命缩短。同时，成骨细胞fct/ β -catenin通路被阻断后，下调骨保护素的表达水平，从而促进破骨细胞的分化。可见，过表达的DKKl可抑制骨的形成并促进骨的吸收。研究表明，RA患者的血清和滑液中DKKl水平升高，并与疾病严重程度呈正相关，是介导RA骨损伤的重要致病因子。应用抗DKKl抗体治疗绝经后骨质疏松，可增加成骨细胞数量、提高血清骨钙素水平，增加小梁骨体积，促进膜内成骨，减少骨吸收。
[0005]目前临床上治疗RA的药物主要包括非甾体抗炎药(non-steroidalant1-1nflammatory drugs, NSAIDs)、改善病情抗风湿药(disease modifyingantirheumatic drug, DMARDs)及生物制剂等。这些药物在一定程度上缓解了 RA病情,但并不能完全抑制骨结构破坏的放射学进展，因此开发抑制RA骨破坏的药物显得尤为重要。而DKKl作为Wnt信号通路的抑制因子在RA发病机制及骨侵蚀中起关键作用，可能成为RA治疗新的分子靶点。

【发明内容】

[0006]本发明的目的是提供一种新型的重组人DKKl多表位核酸疫苗。其及应用。
[0007]本发明的另一目的是提供所述核酸疫苗的制备方法。
[0008]本发明的再一目的是提供所述核酸疫苗在制备治疗类风湿关节炎的药物中的应用。
[0009]为了实现本发明目的，本发明首先提供一种融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDN0.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0010]本发明还提供编码上述融合蛋白的基因。
[0011]本发明还提供一种重组人DKKl多表位核酸疫苗，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所
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[0012]本发明还提供含有上述基因或所述核酸疫苗的载体。
[0013]本发明还提供含有上述基因或所述核酸疫苗的宿主细胞。
[0014]本发明还提供含有上述基因或所述核酸疫苗的转基因细胞系。
[0015]本发明还提供含有上述基因或所述核酸疫苗的工程菌。
[0016]本发明还提供制备所述核酸疫苗的方法，包括如下步骤^fSEQ ID N0.2所示的基因序列克隆到真核表达载体，将获得的重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，经菌体扩增培养，提取质粒，即得重组人DKKl多表位核酸疫苗。
[0017]优选使用的真核表达载体为PCMV6-XL5。
[0018]本发明还提供所述核酸疫苗在制备治疗类风湿关节炎的药物中的应用。
[0019]本发明进一步提供一种治疗类风湿关节炎的药物，其有效成分包括所述核酸疫苗。
[0020]本发明提供的重组人DKKl多表位核酸疫苗，其核酸序列为编码人DKKl的4段(110-144aa、153-181aa、182-216aa、228-253aa)免疫原性较高的片段与T细胞表位片段的融合序列。DKKl是介导RA骨损伤的重要致病因子，由于DKKl为自体成分，自然状态下很难产生抗体。为了增强其免疫原性并降低其生物学活性，本发明在疫苗中引入编码泛DR辅助T细胞表位(PADRE)的序列来增强其免疫原性；同时，本发明还突变了候选表位(110-144aa、153-181aa、182-216aa、228-253aa)中 4 个氨基酸位点(R203E、H204E、K211E、R236E)来降低其生物学活性。为保证蛋白酶能在各个表位之间进行适当的切割，在串联的表位之间加入间隔肽一ΑΑΥ,ΑΑΥ是一种广泛的蛋白酶作用位点。并在疫苗的N端加入天然人DKKl的信号肽(SPl-31aa)，使其在真核细胞中以分泌型表达。
[0021]真核表达载体是制备核酸疫苗的主体，其表达抗原蛋白能力的强弱，主要取决于其启动子的强弱。一般认为含有巨细胞病毒(CMV)启动子的载体表达水平高，因此应用的最为广泛。本发明选用的真核表达载体PCMV6-XL5，含有CMV启动子，保证了目的基因在肌肉细胞中的高效表达。
[0022]实验表明，本发明的重组人DKKl多表位核酸疫苗能够有效刺激小鼠产生特异性的抗体，该抗体可以中和DKKl的生物学活性，减轻胶原诱导关节炎(Collagen-1nducedarthritis, CIA)小鼠骨破坏的程度，可用于治疗类风湿关节炎等骨破坏性疾病。
[0023]本发明的重组人DKKl多表位核酸疫苗为类风湿关节炎等疾病提供了一种新的治疗途径和思路。该核酸疫苗制备简单、成本低廉、稳定性好、贮存方便，且具有良好的免疫原性，适于规模化生产
【专利附图】

【附图说明】
[0024]图1 (a)为本发明实施例1中B细胞表位预测软件分析人DKKl全长氨基酸序列的免疫原性，其中，下划线所示的部位为本发明所选取的4段免疫原性较高的片段；图1(b)为重组人DKKl多表位核酸疫苗的全基因序列以及载体示意图，其中，串联的表位之间用连接子AAY连接，两端各引入一段编码泛DR辅助T细胞表位(PADRE)的序列，在疫苗的N端加入天然人DKKl 信号肽。
[0025]图2 Ca)为本发明实施例1中重组质粒pCMV_DP PCR以及双酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图谱，其中，泳道1:分子量Marker ;泳道2:重组质粒pCMV_DP ;泳道3:重组质粒pCMV-DP双酶切鉴定(EcoR1、Xbal I);泳道4:重组质粒pCMV-DP PCR鉴定;图2 (b)为重组质粒pCMV-DP测序鉴定图谱。
[0026]图3为本发明实施例3中Western Blot分析重组质粒pCMV_DP体外表达情况，其中，泳道1:未转染pCMV-DP的C0S7细胞；泳道2:转染pCMV-DP的C0S7细胞。
[0027]图4为本发明实施例3中免疫组化检测重组质粒pCMV-DP体内表达情况(100倍显微镜下)。
[0028]图5为本发明实施例4中重组人DKKl多表位核酸疫苗刺激机体产生的抗体的滴度以及持续时间(均数土标准差)。
[0029]图6为本发明实施例5中重组人DKKl多表位核酸疫苗刺激机体产生抗体对胶原诱导关节炎小鼠保护作用的评估；其中，图6 (a)是阳性对照组小鼠和疫苗组小鼠Micro-CT的骨侵蚀程度变化；图6 (b)是阳性对照组小鼠和疫苗组小鼠总的骨密度的统计学分析结果；图6 (c)是阳性对照组小鼠和疫苗组小鼠甲苯胺兰染色软骨的侵蚀程度变化(50倍显微镜下)。
【具体实施方式】[0030] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&RussellDff, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001),或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0031]实施例1重组人DKKl多表位核酸疫苗真核表达载体的构建
[0032]应用B细胞表位预测软件分析人DKKl全长氨基酸序列，从中选择4段(110-144aa、153-181aa、182-216aa、228_253aa)免疫原性较高的片段，见图1 (a)。将其中发挥DKKl生物学活性的氨基酸(R203、H204、K211、R236)突变为更易与MHC II类分子结合的谷氨酸。将筛选到的表位之间用连接子AAY连接，两端引入T细胞表位的氨基酸序列。人工合成多表位核酸疫苗的全基因序列，命名为DP。相应的重组基因序列如SEQ ID N0.2所示。PCR扩增目的片段DP，扩增所用的引物序列如下:
[0033]上游引物:5’ -CGGAATTCATGATGGCTCTGGGCGCAGCGG-3 ’
[0034]下游引物:5，-TGCTCTAGATTAAGCGGCTGCTTTCAG-3’
[0035]PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收。分别用EcoRI和XbalI双酶切经凝胶纯化的目的基因产物及PCMV6-XL5载体DNA。用T4连接酶处理，室温2h，见图1 (b)。取5 μ I连接产物转化感受态大肠杆菌DH5 α菌株。挑取单菌落抽提质粒，通过对重组质粒的PCR鉴定和双酶切鉴定，见图2 (a)，PCR扩增出现预期大小的目的条带，且双酶切鉴定重组质粒含有目的基因片段为预期大小，测序结果见图2(b)，表明成功构建了含有重组人DKKl多表位核酸疫苗的真核表达载体，将其命名为pCMV-DP。
[0036]实施例2重组人DKKl多表位核酸疫苗在大肠杆菌中的扩增与提取
[0037]将转化了重组质粒的大肠杆菌接种于IOmL LB培养基(含100mg/L氨苄青霉素)，37°C、250rpm振荡培养过夜。次日将IOmL过夜培养物转接于ImL LB培养基(含100mg/L的氨苄青霉素)，371:，250印111培养至00600值2.0左右。离心收集菌体。依次加入悬浮液、裂解液和中和液，加入裂解液后轻轻翻转混匀6-8次，室温放置2-3min (不要超过5min)。离心后，将上清过柱子，Washing Buffer洗柱子两遍,然后用预热(50°C )的洗脱液将重组质粒洗下来。异丙醇沉淀后，70%乙醇洗一遍，最后加入适量无菌生理盐水溶解沉淀。
[0038]紫外分光光度计测定DNA的浓度以及纯度，确保提取的质粒A260/A280比值在
1.8-2.0 之间。
[0039]实施例3重组人DKKl多表位核酸疫苗体内、外表达情况的鉴定
[0040]重组质粒pCMV-DP瞬时转染非洲绿猴肾成纤维细胞C0S7，DMEM培养基(10%FBS，100U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素)，37°C、5%C02孵箱孵育。待转染后72h，收集细胞，用浓度12%SDS-PAGE胶电泳分离；半干法转入硝酸纤维素(NC)膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2h，TBST洗三次；山羊抗人DKKl抗体1:1000稀释，4°C过夜孵育，TBST洗三次；HRP标记的驴抗山羊抗体1:10000稀释，室温孵育lh，TBST洗三次；化学发光底物覆盖膜显色lmin，暗室内曝光，显影、定影。Western Blot分析表明真核细胞C0S7能表达目的蛋白(图3)。
[0041 ] 将重组质粒pCMV-DP肌肉注射BALB/c小鼠，7d后，取注射部位肌肉组织进行免疫组化染色。冰冻切片8-1(^111，丙酮固定51^11，PBS洗涤3次；灭活内源性酶及封闭内源性生物素后，将山羊抗人DKKl抗体稀释为5 μ g/mL，4°C，过夜孵育，用PBS洗3次；加入I滴生物素标记的二抗，室温孵育lh，PBS洗3次；加入I滴HSS-HRP，室温孵育30min，PBS洗3次；DAB显色20min，复染细胞核；脱水、透明、封片后，置于显微镜下观察。注射了 pCMV-DP的肌肉组织内可以见到目的蛋白的表达(图4 )。
[0042]实施例4动物免疫实验
[0043]重组质粒pCMV-DP免疫6_8w雌性BALB/c小鼠(SPF级)，按体重将小鼠分为生理盐水组和pCMV-DP组，于0、2、4周，肌肉注射小鼠，100 μ g/只，共免疫3次。从初次免疫开始，每隔两周眼眶采血，收集血清后用间接ELISA法检测小鼠体内的抗人DKKl抗体的滴度以及持续时间。用rhDKKl (200ng/mL)包被ELISA板，4°C过夜，并用1%BSA37°C封闭lh，PBST洗4次；待检血清1:200稀释，4°C过夜孵育，PBST洗4次；HRP标记的抗体1:10000稀释，37°C孵育Ih ;加入底物，37°C孵育20min后，加入终止液，测450nm处吸光度。血清抗体滴度测定结果显示，PCMV-DP组抗体产生水平明显高于生理盐水组(图5)。
[0044]实施例5疫苗对胶原诱导关节炎小鼠保护作用的实验
[0045]用重组人DKKl多表位核酸疫苗免疫5w雄性DBA/1小鼠(SPF级)，方法及免疫流程参照实施例4。末次免疫后lw，各组小鼠距尾根部1.5cm处皮内免疫等量的牛II型胶原与完全弗氏佐剂的乳化物(100 μ I/只)，3w后用等量的牛II型胶原与不完全弗氏佐剂的乳化物(100 μ I/只)，以同样的方法加强免疫。末次免疫后20d断颈处死小鼠，MiciO-CT断层扫描，评估各组小鼠的骨侵蚀程度。结果显示，与阳性对照组(空质粒组)相比，pCMV-DP组小鼠的骨结构相对完整，骨破坏程度明显减轻，见图6 (a)。
[0046]对两组小鼠总的骨密度进行统计学分析，结果显示，pCMV-DP组小鼠总的骨密度要高于阳性对照组，差异具有统计学意义(P < 0.05)，见图6 (b)。
[0047]选取小鼠后肢足爪，固定、脱钙后包埋于石蜡中切片，进行甲苯胺兰染色:将组织切片浸入1%甲苯胺兰染色液中染色40s，ddH20漂洗Imin ;脱水、透明、封片后镜下观察。阳性对照组小鼠关节面不完整，关节腔狭窄，大部分关节软骨被侵蚀；pCMV-DP组小鼠关节结构相对完好，关节面光滑，关节软骨相对完整，厚度接近正常水平，见图6 (C)。
[0048]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
[0049]参考文献
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【权利要求】
1.一种融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述融合蛋白的基因。
3.重组人DKKl多表位核酸疫苗，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0.2所示。
4.含有权利要求2所述基因或权利要求3所述核酸疫苗的载体。
5.含有权利要求2所述基因或权利要求3所述核酸疫苗的宿主细胞。
6.含有权利要求2所述基因或权利要求3所述核酸疫苗的工程菌。
7.制备权利要求3所述核酸疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤:将SEQID N0.2所示的基因序列克隆到真核表达载体，将获得的重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，经菌体扩增培养，提取质粒，即得重组人DKKl多表位核酸疫苗。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述真核表达载体为PCMV6-XL5。
9.权利要求3所述核酸疫苗在制备治疗类风湿关节炎的药物中的应用。
10.一种治疗类风湿关节炎的药物 ，其有效成分包括权利要求3所述的核酸疫苗。
【文档编号】C12N1/21GK103910801SQ201410101801
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年3月18日 优先权日:2014年3月18日
【发明者】袁慧慧, 张晓清, 赵文明, 李慎涛 申请人:首都医科大学