一种北极海洋细菌与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种北极海洋细菌与应用，该菌株于2013年9月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武昌珞珈山武汉大学，菌种保藏号：CCTCC?M2013437。该菌株可以大量分泌北极海洋细菌胞外多糖。该多糖具有良好的流变学性质，吸湿、保湿和清除有机自由基，羟自由基、氧自由基的活性，安全无毒、无刺激性等特点。
【专利说明】一种北极海洋细菌与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种北极海洋细菌与应用，属于微生物【技术领域】。
【背景技术】[0002]微生物胞外多糖是微生物的次级代谢产物，是微生物在生长过程中分泌到细胞壁外形成与菌体分离的可溶性多糖及多糖复合物。微生物胞外多糖种类繁多，主要由D-葡萄糖、D-半乳糖和D-甘露糖等单糖组成。它们具有植物多糖不具备的优良性质:生产周期短，不受季节、地域和病虫害条件限制，具有较强的市场竞争力和广阔的发展前景。微生物多糖在工业生产与生活的许多领域具有广泛的应用价值，如作为微生物絮凝剂、微生物采油中的生物化学调剖剂、食品添加剂、保鲜剂、抗癌医药品、包装材料、化妆品等。尤其在化妆品领域，多糖作为人体皮肤真皮层重要组成成分，在皮肤新陈代谢过程中具有突出调节作用。多糖的生物学活性和理化性质为其在化妆品中的应用提供了理论依据，将各种多糖应用于化妆品中，能产生保湿、稳定、改善肤色、抗氧化和抗菌、保护血管、促进上皮纤维的细胞增殖和美化皮肤等功能，其中在保湿和抗氧化作用上显得尤为重要。在保湿方面，保湿作用一直是护肤化妆品最主要的研究课题之一。当皮肤组织细胞和细胞间的水分含量减少时，细胞排列紧密，胶原蛋白失水硬化，皮肤就会显得干燥、失去弹性、起皱、老化。多糖的糖分子链相互交织成网状保持了一定的水分，且多糖分子中极性基团可与水分子形成氢键而结合大量的水分，这便为皮肤提供了水分来源。多糖还有具有良好的成膜性能，可在皮肤表面形成一层均匀的薄膜，减少皮肤表面的水分蒸发，保存皮肤自身的水分。在抗氧化方面，根据自由基理论，过氧化作用是造成人体皮肤衰老的根本原因。多糖能够捕获或淬灭脂质过氧化反应中产生的自由基，起到抗氧化的作用。
[0003]但是，当前只有黄原胶、结冷胶等很少种类的微生物多糖被应用于实际生产中。因此，有必要筛选、分离新的多糖产生菌，并对它们所产多糖的结构、物理化学特性进行深入探究，以进一步拓展它们的应用领域。近几年，随着对微生物多糖研究的深入，世界上微生物多糖产量的年增长量在10%以上，而一些新型多糖年增长量在30%以上，现在世界上每年多糖总需求量在100万吨以上，总价值50-100亿美元。因此，多糖的生产具有巨大的市场价值。
[0004]海洋微生物因其独特的生活环境，分泌的胞外多糖具有特殊结构，预示着可能在生物【技术领域】中将有新的潜在用途。虽然海洋微生物分泌的胞外多糖国内外已经有一些研究，但总体来看开发利用程度仍然很低。北极独特的地理和气候条件，形成了一个低温、干燥、强辐射的极端环境，而在北极海洋中生存着大量可产胞外多糖的微生物菌群。生存于北极海洋这个极端环境中的微生物所产的胞外多糖更是具有独特的分子结构与物理化学性质，使其在制药、化妆品、食品添加剂等方面具有广阔的市场前景。因此制备北极海洋微生物所产胞外多糖，并研究其结构及性质，对于开发和利用北极海洋微生物胞外多糖的应用潜力具有非常重要的意义，也是开辟和利用北极海洋自然资源的迫切需要。
【发明内容】
[0005]本发明针对现有技术的不足，提供一种北极海洋细菌与应用，该北极海洋细菌能够产生具有新颖结构、良好流变学性质、安全无毒的胞外多糖。
[0006]一株北极海洋细菌(Polaribacter sp.) SM1127菌株，该菌株于2013年9月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国武汉市武昌珞珈山武汉大学，菌种保藏号:CCTCC M2013437。
[0007]提取该北极海洋细菌的16S rRNA基因进行菌种鉴定。将其基因序列在NCBI数据库中比对后发现，与北极海洋细菌相似性较高的菌株有Polaribacter sejongensisK0PRI21160T (相似度:99.13%)，Polaribacter butkevichii KMM3938T (相似度:98.67%)和Polaribacter irgensii23_PT (相似度:97.43%)。因此，北极海洋细菌属于极杆菌属(Polaribacter)。
[0008]上述北极海洋细菌(Polaribacter sp.) SM1127菌株在制备北极海洋细菌胞外多糖中的应用。
[0009]根据本发明优选的，上述应用，步骤如下:
[0010](I)将活化后的北极海洋细菌(Polaribacter sp.) SM1127菌株接种于液体种子培养基中，在15~20°C条件下震荡培养I~2天，然后按2~3% (v/v)的接种量接种于发酵培养基中，在10~15°C、溶解氧饱和度高于30%、培养过程中pH控制在7.5~8.0的条件下，培养6~9天，在培养期间补加工业葡萄糖溶液，制得发酵液；
[0011](2)向步骤(1)制得的发酵液中加入1.5~3倍体积的无水乙醇，经醇沉，分离取沉淀，无水乙醇洗涤，经干燥后，溶于水中配制浓度为0.02~0.03g/mL的溶液；然后，加入复合蛋白酶使溶液中复合蛋白酶的浓度为10~15U/mL，在45~50°C、120~150rpm的条件下，酶解5~6h ;再加入1.5~3倍体积的无水乙醇醇沉，分离取沉淀，无水乙醇洗涤，经干燥，制得北极海洋细菌胞外多糖粗品；
[0012](3)将步骤(2)制得的北极海洋细菌胞外多糖粗品溶于蒸馏水中，制得浓度为
0.5~2mg/mL的溶液，然后经离子交换层析、凝胶过滤层析纯化，干燥，制得北极海洋细菌胞外多糖。
[0013]根据本发明优选的，所述步骤(1)中活化后的北极海洋细菌(Polaribacter sp.)SMl 127菌株是将北极海洋细菌(Polaribacter sp.) SMl 127菌株在温度为15~20°C条件下，在固体培养基活化培养2~3天后制得的。
[0014]根据本发明进一步优选的，上述固体培养基组分如下，均为重量份:
[0015]蛋白胨0.8~1.0份，酵母粉0.5~0.75份、琼脂1.0~1.5份，人工海水100份，pH 为 7.5 ~8.0。
[0016]根据本发明优选的，所述步骤(1)中的液体种子培养基组分如下，均为重量份:
[0017]蛋白胨0.8~1.0份，酵母粉0.5~0.75份，人工海水100份，pH为7.5~8.0。
[0018]根据本发明优选的，所述步骤(1)中的发酵培养基组分如下，均为重量份:
[0019]蛋白胨0.943份，酵母粉0.5份，工业葡萄糖3.65份，人工海水100份，pH为7.5。
[0020]根据本发明优选的，所述步骤(1)中的工业葡萄糖溶液为由人工海水和工业葡萄糖配制的浓度625g/L的溶液。
[0021] 根据本发明优选的，所述步骤(1)中的补加工业葡萄糖溶液的次数为三次，补加时间为培养的第3天、第4天和第5天，补加的体积分别为发酵培养基体积的4%、4%和2%。
[0022]根据本发明优选的，所述步骤(2)中的复合蛋白酶购自上海金穗生物科技有限公司。添加复合蛋白酶的目的是分解溶液中的蛋白质，因此本领域技术人员可以根据需要选择合适的市售产品。
[0023]根据本发明优选的，所述步骤(2)和步骤(3)中的醇沉，温度为3~6°C，时间为20 ~40min。
[0024]根据本发明优选的，所述步骤(2)和步骤(3)中的干燥为真空冻干，温度为-50 ~-60 0C ο
[0025]根据本发明优选的，所述步骤(3)中的离子交换层析次数为一次，层析柱规格:16_X 250mm,凝胶类型:DEAE-Sepharose Fast Flow, O ~0.7M NaCl 溶液梯度洗脱,流速36mL/h。
[0026]根据本发明优选的，所述步骤(3)中凝胶过滤层析次数为二次，层析柱规格:16mmX950mm,凝胶类型:Sepharose4B,以蒸懼水洗脱,流速15mL/h。
[0027]上述制备方法制得的北极海洋细菌胞外多糖，其特征在于，分子量为220kDa ；
[0028]上述制备方法制得的北极海洋细菌胞外多糖，其特征在于，其组分如下，均为摩尔百分比:
[0029]N-乙酰己糖胺28%、甘露糖23.4%、葡萄糖醛酸21.4%、半乳糖17.4%、海藻糖7.4%、葡萄糖1.6%、鼠李糖0.8% ；
[0030]上述制备方法制得的北极海洋细菌胞外多糖，其特征在于，糖苷键连接方式如下，均为摩尔百分比:
[0031]4-连接的葡萄糖醛酸残基13.2%、2_连接的半乳糖残基13.0%、末端半乳糖残基
11.5%、4_连接的葡萄糖残基10.2%、末端海藻糖残基9.2%、2，3-连接的甘露糖残基8.5%、4-连接的海藻糖残基7.9%、3-连接的半乳糖残基7.9%、4_连接的N-乙酰己糖胺残基6.5%、末端甘露糖残基5.6%、末端N-乙酰己糖胺残基2.9%、3_连接的甘露糖残基1.8%、末端葡萄糖残基1.0%、4，6-连接的甘露糖残基0.6%、2_连接的鼠李糖残基0.2%。
[0032]有益效果
[0033]1、本发明首次以北极海洋细菌(Polaribacter sp.) SMl 127为菌株发酵生产胞外多糖，建立该菌株合成分泌的胞外多糖的优化发酵生产工艺，通过本发明的生产工艺获得的北极海洋细菌SM1127发酵液中，胞外多糖含量为17.84±0.22g/L。本发明的北极海洋细菌属于极杆菌属(Polaribacter),已报道的对极杆菌属的细菌的研究很少,其中产胞外多糖的细菌更少，目前还未有报道研究极杆菌属细菌的产胞外多糖量，因此本发明的北极海洋细菌在极杆菌属中产糖量最高，而且远高于其它属的海洋细菌及现有发酵方法获得的多糖产量；
[0034]2、通过本方法制得的胞外多糖具有与其它多糖不同的结构，分析其糖基组成和糖苷键连接方式，可得多糖由N-乙酰己糖胺(28%)、甘露糖(23.4%)、葡萄糖醛酸(21.4%)和半乳糖(17.4%)组成，还含有部分海藻糖(7.4%)，少量的葡萄糖(1.6%)和鼠李糖(0.8%);其糖苷键连接方式呈现多样化，且各连接方式所占比例分布较为平均，包括4-连接的葡萄糖醛酸残基(13.2%)，2-连接的半乳糖残基(13.0%)，末端半乳糖残基(11.5%)，4-连接的葡萄糖残基(10.2%)等等，且分子量大小为220kDa，属于一种新颖的胞外多糖；[0035]3、通过本方法制得的胞外多糖具有良好的粘弹性、剪切稀化性和触变性等流变学性质，并具有良好的温度稳定性、PH稳定性和盐稳定性，在化妆品、石油开采等工业领域具有良好的应用潜力；
[0036]4、通过本方法制得的胞外多糖在小鼠急性经口毒性实验中表现为无毒，在兔子皮肤刺激性实验中表现为无刺激性，属于安全性产品，可安全用于化妆品、药品、食品等领域；
[0037]5、通过本方法制得的胞外多糖，具有良好的吸湿、保湿效果，在相对湿度为43%和81%的条件下，吸湿率分别为10.0 ± 0.5%和22.1 ± 0.6% ;在干硅胶环境中放置72h后，胞外多糖保湿率为75.79±2.5%。已报道的多糖中，保湿性比较高的有假单胞菌属的(Pseudomonas f luorescens)PGM37产的胞外多糖、裂裙多糖(PSG)和绿色巴夫藻(Pavlovaviridis)多糖。其中，(Pseudomonas fluorescens) PGM37产的胞外多糖和绿色巴夫藻(Pavlova viridis)多糖的保湿性低于透明质酸，裂褶多糖保湿性低于甘油，而本方法制得的胞外多糖在相同的检测方法和条件下保湿性高于透明质酸和甘油，是目前发现的保湿效果最好的多糖。而且，具有吸湿、保湿性的北极海洋细菌胞外多糖的研究还未见报道，本发明制备的多糖纯品可作为吸湿、保湿剂应用于化妆品中，在化妆品领域具有良好的应用前
旦
牙、；
[0038]6、通过本方法制得的胞外多糖具有良好的清除自由基的能力，在浓度为10.0mg/HiL的条件下，对有机自由基1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH.)、羟自由基和超氧阴离子自由基的清除率分别达到55.40±3%、52.1 + 2.1%和28.2±3%。具有抗氧化活性的北极海洋细菌胞外多糖的研究还未 见报道，本发明制备的多糖纯品在医药、化妆品等领域具有广泛的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0039]图1、发酵时间与北极海洋细菌胞外多糖产量的曲线图；
[0040]图2、北极海洋细菌胞外多糖的阴离子交换层析洗脱曲线图；
[0041]图3、北极海洋细菌胞外多糖的凝胶过滤层析洗脱曲线图；
[0042]图4、北极海洋细菌胞外多糖的GC/MS糖基组成图；
[0043]图5、北极海洋细菌胞外多糖的GC/MS糖苷键连接方式图；
[0044]图6、不同浓度的北极海洋细菌胞外多糖溶液的粘度变化曲线图；
[0045]图7、不同浓度的北极海洋细菌胞外多糖溶液在不同的剪切速率下的粘度变化曲线图；
[0046]图8、不同浓度的北极海洋细菌胞外多糖溶液在不同的温度下的粘度变化曲线图；
[0047]图9、北极海洋细菌胞外多糖溶液在不同的pH下的粘度变化曲线图；
[0048]图10、北极海洋细菌胞外多糖溶液在不同的盐及盐浓度下的粘度变化曲线图；
[0049]图11、北极海洋细菌胞外多糖溶液的触变性曲线图；
[0050]图12、北极海洋细菌胞外多糖的急性经口毒性实验中KM小鼠的体重变化曲线图；
[0051]图13、北极海洋细菌胞外多糖的急性经口毒性实验中KM小鼠的组织切片图；
[0052]其中:图Al和图A2为心脏组织的切片图(200 X )，图BI和图B2为肾脏组织的切片图(200X )，图Cl和图C2为肝脏组织的切片图(200X )、图Dl和图D2为脾脏组织的切片图(400X )，图Al，BI，Cl，Dl为对照组，图A2，B2，C2，D2为实验组；
[0053]图14、北极海洋细菌胞外多糖、透明质酸、壳聚糖、海藻酸钠和甘油的吸湿率曲线图；
[0054]其中:图A为在相对湿度43%条件下的吸湿率曲线图，图B为在相对湿度81%条件下的吸湿率曲线图；
[0055]图15、北极海洋细菌胞外多糖、透明质酸、壳聚糖、海藻酸钠和甘油保湿率的曲线图。
[0056]图16、北极海洋细菌胞外多糖、透明质酸和维生素C对有机自由基DPPH.的清除作用的曲线图；
[0057]图17、北极海洋细菌胞外多糖、透明质酸和维生素C对羟自由基的清除作用的曲线图；[0058]图18、北极海洋细菌胞外多糖、透明质酸和维生素C对超氧阴离子自由基的清除作用的曲线图。
【具体实施方式】
[0059]下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
[0060]实施例中所述人工海水由购自美国Sigma公司的海盐按照产品使用说明书配制成盐浓度为3wt%的人工海水；
[0061]复合蛋白酶购自上海金穗生物科技有限公司；
[0062]实施例中所述固体培养基组分如下，均为重量份:
[0063]蛋白胨1份，酵母粉0.5份、1.5份琼脂，人工海水100份，pH为7.5~8.0 ;
[0064]液体种子培养基组分如下，均为重量份:
[0065]蛋白胨1份，酵母粉0.5份，人工海水100份，pH为7.5~8.0 ;
[0066]发酵培养基组分如下，均为重量份:
[0067]蛋白胨0.943份，酵母粉0.5份，工业葡萄糖3.65份，人工海水100份，pH为7.5 ;
[0068]实施例1
[0069]一株北极海洋细菌(Polaribacter sp.) SM1127菌株，该菌株于2013年9月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国武汉市武昌珞珈山武汉大学，菌种保藏号:CCTCC M2013437。
[0070]提取该北极海洋细菌的16S rRNA基因进行菌种鉴定。将其基因序列在NCBI数据库中比对后发现，与北极海洋细菌相似性较高的菌株有Polaribacter sejongensisK0PRI21160T (相似度:99.13%)，Polaribacter butkevichii KMM3938T (相似度:98.67%)和Polaribacter irgensii23_PT (相似度:97.43%)。因此，北极海洋细菌属于极杆菌属(Polaribacter)。
[0071]实施例2
[0072]实施例1所述北极海洋细菌(Polaribacter sejongensis sp.) SMl 127菌株在制备北极海洋细菌胞外多糖中的应用，步骤如下:[0073](I)将北极海洋细菌(Polaribacter sejongensis sp.)SM1127菌株划线接种于固体培养基中，在20°C条件下活化培养2天，然后接种于IOOmL液体种子培养基中，在20°C、200rpm的条件下震荡培养I天，然后按2% (v/v)的接种量接种于5L发酵培养基中，在
11.3°C、溶解氧饱和度30~100%的条件下，连续培养8天，培养过程中控制pH为7.5，并在培养的第3天、第4天和第5天分别补加由工业葡萄糖和人工海水配制的浓度为625g/L的工业葡萄糖溶液200mL、200mL和IOOmL,制得发酵液；
[0074](2)向步骤(1)制得发酵液中加入2倍体积的无水乙醇，在4°C条件下醇沉30min，8000rpm离心10min，取沉淀，无水乙醇洗涤、-53°C真空冻干72h ;冻干的多糖溶于水中，配成浓度为0.02g/mL的溶液；加入复合蛋白酶使溶液中复合蛋白酶的浓度为12U/mL，在50°C>120rpm的条件下，酶解5h ;再加入2倍体积的无水乙醇，在4?条件下醇沉30min,8000rpm离心10min，取沉淀，无水乙醇洗涤、_53°C真空冻干72h，制得北极海洋细菌胞外多糖粗品；
[0075](3)将步骤(2)制备的北极细菌胞外多糖粗品用蒸馏水溶解，配成浓度为lmg/mL的溶液，上清液加入DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱(柱型16mmX250mm),蒸馏水冲洗，O~0.7M NaCl溶液梯度洗脱，流速36mL/h ;用自动分部收集器收集液体，每管3mL，苯酚一硫酸法测定每管溶液的总糖含量，收集含有多糖的洗脱液，透析，-53°C真空冻干;
[0076]然后溶解于蒸懼水中，配成浓度为20mg/mL的溶液,用Sepharose4B凝胶柱(柱型16mmX950mm)层析，以蒸懼水洗脱，流速15mL/h,洗脱液以每管5mL收集,苯酹-硫酸法检测每管溶液的总糖含量，收集有糖的溶液，透析，_53°C真空冻干；重复Sephar0Se4B凝胶柱层析的操作一次，制得北极海洋细菌胞外多糖。
[0077]结果如图2所示，经过阴离子交换后，得到2个洗脱峰，对第二个峰的多糖进行收集，经过两次凝胶过滤层析，得到图3所示的对称单峰，对此峰的多糖进行收集，得到北极海洋细菌胞外多糖的纯品。
[0078]实施例3
[0079]实施例1所述北极海洋细菌(Polaribacter sp.) SMl 127菌株在制备北极海洋细菌胞外多糖中的应用，步骤如下:
[0080](I)将北极海洋细菌(Polaribacter sp.) SM1127菌株划线接种于固体培养基中，在15°C条件下活化培养3天，然后接种于IOOmL液体种子培养基中，在15°C、200rpm的条件下震荡培养2天，然后按3% (v/v)的接种量接种于5L发酵培养基中，在15°C、溶解氧饱和度60~80%的条件下，连续培养6天，培养过程中控制pH为8.0，并在培养的第3天、第4天和第5天分别补加由工业葡萄糖和人工海水配制的浓度为625g/L的工业葡萄糖溶液200mL、200mL和IOOmL,制得发酵液；
[0081] (2)向步骤(1)制得发酵液中加入3倍体积的无水乙醇，在6°C条件下醇沉40min，8000rpm离心10min，取沉淀，无水乙醇洗涤、-60°C真空冻干72h ;冻干的多糖溶于水中，配成浓度为0.03g/mL的溶液；加入复合蛋白酶使溶液中复合蛋白酶的浓度为15U/mL，在45°C、150rpm的条件下，酶解6h ;再加入3倍体积的无水乙醇,在6°C条件下醇沉40min,8000rpm离心10min，取沉淀，无水乙醇洗涤、_60°C真空冻干72h，制得北极海洋细菌胞外多糖粗品；[0082](3)将步骤(2)制备的北极细菌胞外多糖粗品用蒸馏水溶解，配成浓度为2mg/mL的溶液，上清液加入DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱(柱型16mmX250mm),蒸馏水冲洗，O~0.7M NaCl溶液梯度洗脱，流速36mL/h ;用自动分部收集器收集液体，每管3mL，苯酚一硫酸法测定每管溶液的总糖含量，收集含有多糖的洗脱液，透析，-60°C真空冻干;
[0083]然后溶解于蒸懼水中，配成浓度为20mg/mL的溶液,用Sepharose4B凝胶柱(柱型16mmX950mm)层析，以蒸懼水洗脱，流速15mL/h,洗脱液以每管5mL收集,苯酹-硫酸法检测每管溶液的总糖含量，收集有糖的溶液，透析，_60°C真空冻干；重复Sephar0Se4B凝胶柱层析的操作一次，制得北极海洋细菌胞外多糖。
[0084]实施例4
[0085]北极海洋细菌胞外多糖的糖基组成和糖苷键链接方式分析，具体方法如下:
[0086]取实施例1或实施例2制得的北极海洋细菌胞外多糖500 μ g与20 μ g的肌糖混合，溶于400yL的2M三氟乙酸中，120°C水解Ih后，冻干；加入含有IM HCl的甲醇溶液中，80°C处理16h ;然后在甲醇中用吡啶和乙酸酐重新对多糖样品进行N-乙酰化；然后用Tr1-sil (购自美国Pierce公司)在80°C处理0.5h，再用气相色谱-质谱联用仪(GC/MS)分析其糖基组成，其中气相色谱(7890A，购自美国Agilent公司)连接到质量选择检测器(5975C，购自美国Agilent公司)，分离毛细管用EC-1石英毛细管(30mX0.25mm，购自美国Supelco 公司)；
[0087]取实施例2或实施例3制得的北极海洋细菌胞外多糖2mg加入200 μ L 二甲基亚砜中，并用通入氮气流混合7h，然后加入CH3I混合，过夜；然后通过一个C18的层析柱，冻干；然后在四氢呋喃溶液中用重锂分解，中和电荷，脱水；在干的二甲亚砜中用NaOH和CH3I做甲基化处理，2M三氟乙酸121°C处理2h水解，用NaBD4还原并用乙酸酐/三氟乙酸乙酰化。生成的部分甲基化的糖醛醋酸盐用气相色谱-质谱联用仪(GC/MS)分析其糖苷键连接方式，其中气相色谱(7890A,购自美国Hewlett Packard公司)连接到质量选择检测器(5975C，购自美国Hewlett Packard公司)，分离毛细管用2380石英毛细管(30mX0.25mm,购自美国Supelco公司)；
[0088]取实施例2或实施例3制得的北极海洋细菌胞外多糖100 μ g溶于蒸馏水中，同分子量分别为1189kDa，759kDa，511kDa，167kDa的标准葡聚糖进行TSK Gel G5000PW的尺寸排阻色谱层析(柱型7.5mmX300mm,购自日本Tosoh Biosciences公司)，以ρΗ5.5的50mM醋酸铵溶液洗脱，以ELS检测器(购自美国Agilent公司)检测洗脱液成分，根据多糖样品的出峰时间来分析其分子量大小。
[0089]经GC/MS分析后，根据多糖的糖基组成图谱(图4)和糖苷键连接方式图谱(图5)，得到多糖的糖基组成(表1)和糖苷键连接方式(表2)；
[0090]表1
[0091]
【权利要求】
1.一株北极海洋细菌(Polaribacter sp.) SM1127菌株，该菌株于2013年9月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国武汉市武昌珞珈山武汉大学，菌种保藏号:CCTCCM2013437。
2.权利要求1所述北极海洋细菌(Polaribactersp.)SMl 127菌株在制备北极海洋细菌胞外多糖中的应用。
3.如权利要求2所述的应 用，其特征在于，步骤如下: (1)将活化后的北极海洋细菌(Polaribactersp.)SM1127菌株接种于液体种子培养基中，在15~20°C条件下震荡培养I~2天，然后按2~3% (体积百分比)的接种量接种于发酵培养基中，在10~15°C、溶解氧饱和度高于30%、培养过程中pH控制在7.5~8.0的条件下，培养6~9天，在培养期间补加工业葡萄糖溶液，制得发酵液； (2)向步骤(1)制得的发酵液中加入1.5~3倍体积的无水乙醇，经醇沉，分离取沉淀，无水乙醇洗涤，经干燥后，溶于水中配制浓度为0.02~0.03g/mL的溶液；然后，加入复合蛋白酶使溶液中复合蛋白酶的浓度为10~15U/mL，在45~50°C、120~150rpm的条件下，酶解5~6h ;再加入1.5~3倍体积的无水乙醇醇沉，分离取沉淀，无水乙醇洗涤，经干燥，制得北极海洋细菌胞外多糖粗品； (3)将步骤(2)制得的北极海洋细菌胞外多糖粗品溶于蒸馏水中，制得浓度为0.5~2mg/mL的溶液，然后经离子交换层析、凝胶过滤层析纯化，干燥，制得北极海洋细菌胞外多糖。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中活化后的北极海洋细菌(Polaribacter sp.)SM1127 菌株是将北极海洋细菌(Polaribacter sp.)SM1127 菌株在温度为15~20°C条件下，在固体培养基活化培养2~3天后制得的。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述固体培养基组分如下，均为重量份: 蛋白胨0.8~1.0份，酵母粉0.5~0.75份、琼脂1.0~1.5份，人工海水100份，pH为 7.5 ~8.0。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中的液体种子培养基组分如下，均为重量份: 蛋白胨0.8~1.0份，酵母粉0.5~0.75份，人工海水100份，pH为7.5~8.0 ; 根据本发明优选的，所述步骤(1)中的发酵培养基组分如下，均为重量份: 蛋白胨0.943份，酵母粉0.5份，工业葡萄糖3.65份，人工海水100份，pH为7.5 ; 根据本发明优选的，所述步骤(1)中的工业葡萄糖溶液为由人工海水和工业葡萄糖配制的浓度625g/L的溶液。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中的补加工业葡萄糖溶液的次数为三次，补加时间为培养的第3天、第4天和第5天，补加的体积分别为发酵培养基体积的 4%、4% 和 2% ο
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)和步骤(3)中的醇沉，温度为3~6°C，时间为20~40min ； 根据本发明优选的，所述步骤(2)和步骤(3)中的干燥为真空冻干，温度为-50 ~-60 °C ； 根据本发明优选的，所述步骤(3)中的离子交换层析次数为一次，层析柱规格:16mmX 250mm,凝胶类型:DEAE-Sepharose Fast Flow, 0 ~0.7M NaCl 溶液梯度洗脱，流速 36mL/h ； 根据本发明优选的，所述步骤(3)中凝胶过滤层析次数为二次，层析柱规格:16_X950mm,凝胶类型:Sepharose4B,以蒸懼水洗脱,流速15mL/h。
9.由权利要求3制备的北极海洋细菌胞外多糖，其特征在于，分子量为220kDa，其组分如下，均为摩尔百分比: N-乙酰己糖胺28%、甘露糖23.4%、葡萄糖醛酸21.4%、半乳糖17.4%、海藻糖7.4%、葡萄糖1.6%、鼠李糖0.8%。
10.如权利要求9所述的北极海洋细菌胞外多糖，其特征在于，糖苷键连接方式如下，均为摩尔百分比: 4-连接的葡萄糖醛酸残基13.2%、2_连接的半乳糖残基13.0%、末端半乳糖残基11.5%、4_连接的葡萄糖残基.10.2 %、末端海藻糖残基9.2%、2，3-连接的甘露糖残基.8.5%,4-连接的海藻糖残基7.9%、3-连接的半乳糖残基7.9%、4-连接的N-乙酰己糖胺残基6.5%、末端甘露糖残基5.6%、末端N-乙酰己糖胺残基2.9%>3-连接的甘露糖残基.1.8%、末端葡萄糖残基1.0%A, 6-连接的甘露糖残基0.6%、2_连接的。
【文档编号】C12R1/01GK103937707SQ201410108720
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年3月21日 优先权日:2014年3月21日
【发明者】张玉忠, 孙美玲, 陈秀兰, 石梅, 张熙颖, 宋晓妍, 解彬彬, 苏海楠, 秦启龙, 周百成 申请人:山东大学