一种处理植物生物量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种处理植物生物量的方法，该方法包括：通过将植物或其部分与液体混合，形成液固比小于或等于15的混合物，并提供条件使所述混合物的温度保持在小于或等于100℃，从而对植物或其部分进行预处理；以及提供一种或多种酶，以进行木质纤维素材料的酶促水解；其中，所述植物为转基因植物，选自：通过使用质粒由农杆菌介导的转化制得的转基因植物，所述质粒含有与SEQ?ID?NOS:206、207、209-230和232-279之一的序列具有至少90%的同一性的核苷酸序列；含有细胞壁降解酶的转基因植物；和含有核酸的转基因植物。本发明的方法能够有效地提高植物生物量。
【专利说明】一种处理植物生物量的方法
[0001]相关申请
[0002]本申请为申请日为2010年11月5日、申请号为201080060542.8、名称为“表达细胞壁降解酶的植物以及表达载体”的中国发明专利申请的分案申请。
[0003]本申请要求以2009年11月6日提交的美国临时申请N0.61/280，635和2010年6月28日提交的美国临时申请N0.61/398，589作为优先权基础，这两个临时申请的全部内容通过援引的方式纳入本文。本申请还是2009年11月6日提交的美国申请N0.12/590,444的部分继续申请,该申请的全部内容通过援引的方式纳入本文。
[0004]本申请的序列表与本申请一起以电子方式提交，名称为“序列表”，创建于2010年11月5日，其大小为2,215,456字节，序列表的全部内容通过援引的方式纳入本文。
【技术领域】
[0005]本发明公开内容涉及表达细胞壁降解酶的植物、载体、核酸、蛋白质、相关方法及其应用。
【背景技术】
[0006]水解酶具有重要的工业和农业应用，但是它们依赖于表达宿主的的表达和生产可能会产生不良的表型效应。具体而言，当在植物中表达时，细胞壁降解酶，例如纤维素酶、木聚糖酶、木质酶、酯酶、过氧化物酶以及其它水解酶，的表达常常对生长、生理以及农艺性质产生不利影响。由于其中的一些酶的水解活性，它们在微生物宿主中的表达可能较弱。
【发明内容】
[0007]—方面，本发明涉及转基因植物，所述转基因植物包括一种核酸，所述核酸编码与选自SEQ ID NOS:44-115的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
[0008]一方面，本发明涉及转基因植物，所述转基因植物包括在中严格度条件下能够与第二核酸杂交的第一核酸，所述第二核酸由选自SEQ ID N0S: 116-187的核苷酸序列或其互补序列构成。
[0009]一方面，本发明涉及包括第一核酸的载体，所述第一核酸在低、中或高严格度之一的条件下能够与由SEQ ID N0S: 116-187的一个序列组成的第二核酸杂交。
[0010]一方面，本发明涉及包括核酸的载体，所述核酸具有与选自SEQ ID N0S: 188-283的参照序列具有至少90%同一性的序列。
[0011]一方面，本发明涉及处理植物生物量的方法。所述方法包括通过将植物或其部分与液体混合形成液固比小于或等于15的混合物，从而对植物或其部分进行预处理。所述预处理还包括提供条件以在小于或等于100°C的温度下保持混合物。所述方法还包括提供一种或多种酶用来修饰植物或其部分的至少一种组分。 [0012]一方面，本发明涉及处理植物生物量的方法，该方法包括:通过将植物或其部分与液体混合，形成液固比小于或等于15的混合物，并提供条件使所述混合物的温度保持在小于或等于100°c，从而对植物或其部分进行预处理；以及提供一种或多种酶，以进行木质纤维素材料的酶促水解；其中，所述植物为转基因植物，所述转基因植物选自由以下组成的组:通过使用质粒由农杆菌介导的转化制得的转基因植物，所述质粒含有与SEQ IDNOS:206,207,209-230和232-279之一的序列具有至少90%的同一性的核苷酸序列由权利要求15-19和22-29中任意一项所述的方法制备得到的转基因植物；含有细胞壁降解酶的转基因植物，所述细胞壁降解酶具有与选自SEQ ID NOS:44-115的序列具有至少90%的同一性的氨基酸序列；和，含有核酸的转基因植物，所述核酸具有与选自SEQ ID N0S: 116-187的序列具有至少90%的同一性的序列。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]本专利或申请文件包括至少一个彩色附图。根据要求和支付必要的费用，官方将会提供本专利的副本或带有彩色附图的专利申请出版物。
[0014]结合附图将会更好地理解下述对本发明的优选实施方式的具体说明。为了阐明本发明，在附图中显示了目前优选的实施方式。然而，应该理解的是本发明并不局限于所显示的精确的设置和手段。附图如下所示:
[0015]图1为pSBll的载体图谱。
[0016]图2A为AG1000的载体图谱。
[0017]图2B为pAGlOOl的载体图谱。
[0018]图2C为pAG1002的载体图谱。
[0019]图3A为pAG1003的载体图谱。
[0020]图3B为pAG2000的载体图谱。
[0021]图3C为pAG2004的载体图谱。
[0022]图4为pAG2014的载体图谱。
[0023]图5 为 pBSK:0sUbi3P:Xma1:AvrI1:NosT 的载体图谱。
[0024]图6 为 pBSK:0sUbi3P:Xma1: AvrI1:NosT: LI 的载体图谱。
[0025]图7显示登录号为P40942、P77853以及030700的三种木聚糖酶的比活性。
[0026]图8显示不同转基因植物样品表达木聚糖酶P77853的活性。
[0027]图9显示030700、P77853以及P40942的热稳定性试验。
[0028]图10为宏观尺度过程的工艺流程图。
[0029]图11为微观尺度过程的工艺流程图。
[0030]图12显示来自预处理的玉米秸杆(2015.05和2004.8.4)的酶促水解的葡萄糖和
木糖的产率(生物量重量百分比)。
[0031]图13显示来自预处理的玉米秸杆(2004.8.4、2063.13和2063.17)的酶促水解的
葡萄糖和木糖的产率(生物量重量百分比)。
[0032]图14显示来自预处理的玉米秸杆(2015.05和2004.8.4)的酶促水解的葡萄糖和木糖的产率(生物量重量百分比)。
[0033]图15显示来自预处理的玉米秸杆(2064.17和2004.8.4)的酶促水解的葡萄糖和木糖的产率(生物量重量百分比)。
[0034]图16显示来自预处理的玉米秸杆(2042.02,2042.03,2042.06和2004.8.4)的酶促水解的葡 萄糖的产率(生物量重量百分比)。
[0035]图17A显示用pAG3000制备的转基因植物。
[0036]图17B显示用pAG3001制备的转基因植物。
[0037]图18A显示用pAG2004制备的转基因植物。
[0038]图18B显示来自pAG2004制备的转基因植物的穗轴。
[0039]图18C显示来自pAG2004制备的转基因植物的穗轴。
[0040]图19A显示用pAG2005制备的转基因植物。
[0041]图19B显示用pAG2005制备的转基因植物。
[0042]图20显示用pAG2004转化的转基因植物事件#15的还原糖的测量。
[0043]图21A显示用pAG2016制备的转基因植物。
[0044]图21B显示来自pAG2016制备的转基因植物的穗轴。
[0045]图22显示转基因植物的还原糖的测量。
[0046]图23显示来自干的、衰老的玉米秸杆样品的酶活性的测量。
[0047]图24显示用pAG2015pAG2014或pAG2004制备的转基因植物的叶组织样品的酶活性的测量。
[0048]图25A显示用pAG2014制备的转基因植物。
[0049]图25B显示用pAG2014制备的转基因植物。
[0050]图25C显示来自pAG2014制备的转基因植物的穗轴。
[0051]图26A显示用pAG2015制备的转基因植物。
[0052]图26B显示用pAG2015制备的转基因植物。
[0053]图26C显示来自pAG2015制备的转基因植物的穗轴。
[0054]图26D显示来自pAG2015制备的转基因植物的穗轴。
[0055]图27A显示用pAG2020制备的转基因植物。
[0056]图27B显示用pAG2020制备的转基因植物。
[0057]图27C显示来自pAG2020制备的转基因植物的穗轴。
[0058]图28A显示用pAG2025制备的转基因植物。
[0059]图28B显示用pAG2025制备的转基因植物。
[0060]图28C显示用pAG2025制备的转基因植物。
[0061]图29A显示用pAG2017制备的转基因植物。
[0062]图29B显示用pAG2017制备的转基因植物。
[0063]图29C显示来自pAG2017制备的转基因植物的穗轴。
[0064]图29D显示来自pAG2017制备的转基因植物的穗轴。
[0065]图30A显示用pAG2019制备的转基因植物。
[0066]图30B显示用pAG2019制备的转基因植物与野生型植物的比较。
[0067]图31显示用pAG2019或pAG2027制备的转基因植物与野生型植物的比较。左边的三株植物是用PAG2019制备的。右边的三株植物是用pAG2027制备的。
[0068]图32A显示左边的用pAG2018制备的两株转基因植物以及右边的两株表达非水解酶的植物。
[0069]图32B显示用pAG2018制备的转基因植物。[0070]图32C显示用pAG2018制备的转基因植物。
[0071]图33A显示用pAG2026制备的转基因植物。
[0072]图33B显示用pAG2026制备的转基因植物。
[0073]图33C显示用pAG2026制备的转基因植物。
[0074]图34A显示用pAG2021制备的转基因植物。
[0075]图34B显示用pAG2021制备的转基因植物。
[0076]图34C显示来自pAG2021制备的转基因植物的穗轴。
[0077]图34D显示来自pAG2021制备的转基因植物的穗轴。
[0078]图35A显示用pAG2022制备的转基因植物。
[0079]图35B显示用pAG2022制备的转基因植物。
[0080]图35C显示来自pAG2022制备的转基因植物的穗轴。
[0081]图36A显示用pAG2023制备的转基因植物。
[0082]图36B显示用pAG2023制备的转基因植物。
[0083]图36C显示用pAG2023制备的转基因植物。
[0084]图37A显示用pAG2024制备的转基因植物。
[0085]图37B显示用pAG2024制备的转基因植物。
[0086]图37C显示用pAG2024制备的转基因植物。
[0087]图38显示来自一些pAG2021事件的活性数据，以及来自pAG2004事件(木聚糖酶活性的阴性对照)和PAG20014事件(木聚糖酶活性的阳性对照)的测量。
【具体实施方式】
[0088]下述说明书中使用了特定的术语，但这仅是为了方便而并非为了限制。词语“右”、“左”、“顶部”以及“底部”指定了附图中的或所引用的具体实施例中的方向。
[0089]除非特别说明，否则权利要求书和说明书的相应部分中使用的词语“一”和“一个”被定义为包括一个或多个所引用的项目。短语“至少一个”后面的一系列两个或多个项目，如“A、B或C”，指的是A、B、或C中的任何单独的个体，以及它们任意的组合。
[0090]尽管酶类对于表达宿主具有潜在的不良效应，但是在植物、微生物以及其它生物体中生产酶类在制备燃料、纤维、化学品、糖类、纺织品、纸浆、纸以及动物饲料中能够产生巨大的经济效益。不管是农艺效应或是表型效应，有时候在植物中生产酶类具有经济效益。而且，可使用保护植物免受酶活性影响的各种策略来克服一些表型效应。本文所述的【具体实施方式】包括但不限于这些策略。
[0091] 植物表达酶的策略可能会依赖于作物的种类。一种特定的酶在一种作物中表达时可能具有很小的或没有价值或效益，但在另一种作物中表达时却具有显著的价值或效益。也就是说，工程植物的性质可能不仅取决于特定的酶，还取决于表达该酶的特定植物。例如，植物中木聚糖酶的表达能够促进植物细胞壁半纤维素和植物纤维水解为可发酵的糖类(用于生产燃料和化学品)或可消化的糖类(用于生产动物饲料和肉类)。然而，当在玉米中表达时，特异性木聚糖酶也会降低谷物产量并可能导致不育，从而阻止了玉米作为酶表达的宿主的用途。尽管在玉米中木聚糖酶对谷物产量和繁殖会有负面影响，这可能降低工程植物与非工程植物相比的净经济价值，但是同一种木聚糖酶在别的作物如柳枝稷、芒草、甘蔗或高粱中的表达实际上可能是有益的，这是因为这些作物的不育会阻止木聚糖酶基因的异型杂交，而可以用组织培养或无性繁殖来产生商业用量的植物繁殖体。虽然在玉米中繁殖、谷物产量或干物质生物量的降低可能阻止或降低特定的木聚糖酶的表达的价值，否则特定的木聚糖酶的表达在化学加工和动物饲料工业中将是有价值的，但是同样的酶在柳枝稷、芒草、高粱或甘蔗中的表达可能不仅提供由酶本身产生的经济价值，而且从监管和安全角度来说也可以具有益处。
[0092]同样地，当在不同组织中表达，或在不同作物的同一组织中表达时，作物组织中表达的酶的价值可能不同。取决于作物的种类和酶表达所赋予的新性质，特定的作物组织(如谷物、种子、树叶、茎杆、根、花、花粉等)可能具有不同的价值，从而产生了不同的效益。当在玉米中组成型表达时，特异性木聚糖酶和纤维素酶具有显著的农艺效应和表型效应。这些酶单独或结合地组成型表达经常导致矮化植物、不育植物或低产量和农艺性能的植物。然而，特异性木聚糖酶和纤维素酶的种子特异性表达可能降低或消除任何不良农艺效应或产量的降低，却仍然能够提供高水平的酶。这在玉米中是有益的。在柳枝稷、芒草、饲料或甜高粱或甘蔗中生产相同的酶可能导致木聚糖酶或纤维素酶的种子特异性表达具有不同的属性，其中，与玉米相比较时，基于每英亩的谷物产量可能相当低。【具体实施方式】包括在任何种类转基因植物中的CWDE种子特异性地表达。根据应用，如生产动物饲料、生产肉或乳制品、生产禽肉、生产纸或生产发酵性糖，其中，含有酶的谷物可以与其它收获原料(经预处理的或未经预处理的)混合，这是在玉米或其它谷物和种子中提供有效剂量的酶的非常有效的方式。
[0093]植物表 达酶的净经济价值可能不同，这取决于酶被设计为定位和积累在哪里，以及酶的靶标位置在哪。例如，当特异性木聚糖酶和纤维素酶被靶向至植物细胞壁时，它们可能具有显著的表型效应和农艺效应，但当将它们保持在细胞内或靶向至液泡时，效应就很小或没有效应。将细胞内包含的酶的来源应用到需要把酶和底物混合的情况，可能会创造经济效益。相反，相同的酶可能在混合应用中，如在动物饲料或处理经预处理的生物量中提供价值，这些酶在自处理应用中可能提供很小的价值或不提供价值，其中，对于植物细胞壁的靶向性优选地形成可发酵的糖类或易消化的糖类，但由于表型或农艺效应会产生问题。
[0094]如上所述，外源酶能够在特定的植物、植物器官、植物组织、植物细胞或植物亚细胞区域或区室中表达。本发明的实施方式包括在植物、植物区域、植物器官、植物组织或植物亚细胞区域或区室中表达外源酶。实施方式还包括具有外源酶的植物，其中，所述外源酶存在于整个植物中或定位于植物区域、植物器官、植物组织或植物亚细胞区域或区室中。可以提供适于或具有外源CWDE在细胞质中积累的转基因植物。可以设计外源酶在植物的什么位置表达以及在何种植物中表达，设计要考虑的因素包括但并不局限于以上所述的表型、安全、经济或监管问题。
[0095]本发明的实施方式中提供了植物中表达蛋白质的载体。所述蛋白质可以是酶，所述酶可以是但不局限于细胞壁降解酶。提供了一些被设计为表达特异性细胞壁降解酶的植物。所述植物可能具有工业和/或农业应用。提供了制备表达载体和植物的方法和材料。还提供了在工业和农业应用中使用植物的工艺。
[0096]提供了载体,该载体在植物中(in planta)用于表达细胞壁降解酶(或CWDE)或是内含子修饰的CWDE变体。在一个实施方式中，所述载体适用于双子叶植物的转化。在一个实施方式中，所述载体适用于单子叶植物的转化。CWDEs可以选自但不限于木聚糖酶、纤维素酶、纤维二糖水解酶、葡糖苷酶、木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶(arabinofuranosidase)以及阿魏酸酯酶，其中，载体或植物中的CWDE来自所述CWDEs。在一个实施方式中，CffDE编码序列被嵌入的内含子序列中断。嵌入的内含子序列可能使相应的CWDE的功能失活。在一个实施方式中，载体设计允许嵌入至少三至四个基因表达盒和/或基因沉默盒。每个所述盒可以包括CWDE或内含子修饰的CWDE。
[0097]在一个实施方式中，在本发明的载体或其构建过程中所使用的遗传元件能够提供至少一种下述特性:植物转化后筛选转基因事件的能力，在细胞中影响基因表达的最佳水平的能力或影响所需亚细胞酶靶向的能力。载体可以包括筛选标记，所述筛选标记可以是但不限于大肠杆菌磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因。除了或代替PMI标记的其它可被包括的筛选标记(如但不限于EPSPS、BAR、npt-11、GUS等)是本领域所熟知的。所述载体还可以包括一个或多个启动子。所述启动子可以是组成型的或是整体型的、组织特异性的、种子特异性的、叶子特异性的、器官特异性的、亚细胞区域或区室特异性的或发育阶段特异性的启动子。优选的启动子包括带有第一内含子(登录号为AY954394，SEQ ID NO:1)的水稻泛素3基因启动子(0sUbi3P)或水稻肌动蛋白I基因启动子(登录号为S44221，SEQ ID NO:2)。也可以使用其它组成型启动子，例如但不限于玉米泛素启动子(SEQ ID N0:3)，并且用于代替0sUbi3P或水稻肌动蛋白I启动子。泛素3基因启动子和水稻肌动蛋白I基因启动子是组成型和整体型启动子，能够用于在转基因植物中提供基因表达。在载体中还可以提供来自带有自身信号序列的水稻GluB-4基因(登录号为AY427571，SEQ ID NO:4)的谷蛋白启动子。所述谷蛋白启动子是种子特异性启动子。在载体中可以提供其它种子特异性启动子(例如但不限于玉米醇溶蛋白Zc2启动子，SEQ ID N0:5)。为了将酶送递到它们相应的底物或位置为了实现高水平的酶积累(如液泡)，在载体中可提供各种靶向信号序列。可在CffDE或编码CWDE的载体中提供的靶向信号序列包括但不限于:PRla(SEQ ID NO:6，由SEQID NO:7的核酸序列编码)，BAASS(SEQ ID NO:8，由SEQ ID NO:9的核酸序列编码)，以及大麦半胱氨酸蛋白酶(aleurain) (SEQ ID N0:10，由SEQ ID NOill的核酸编码)。其它可以被包括的靶向序列包括但不限于:内质网(ER)驻留序列SEKDEL(SEQ ID NO: 12，由SEQID NO: 13 的核酸编码)，以及消减(abridged)序列 KDEL(SEQ ID NO: 10，由 SEQ ID NO: 16的核酸编码)。也可以提供不带有靶向序列的酶。可以提供酶以使得它们在细胞质内积累。可以提供转录终止子。本发明的基因表达盒实施例中使用了来自农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)胭脂碱合成酶基因的有效的转录终止子序列。
[0098]在一个实施方式中，提供一种转基因植物，所述转基因植物包括编码CWDE的核酸或编码被至少一个信号序列或内含子修饰的CWDE的核酸。所述编码CWDE的核酸序列可以编码任何CWDE氨基酸序列。编码被至少一个信号序列或内含子修饰的CWDE的核酸序列可以编码任何CWDE氨基酸序列以及至少任何一个信号序列或任何一个内含子。核酸可以编码与选自 SEQ ID N0S:44- 115 的序列具有至少 70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一性的蛋白质。核酸可以编码与选自SEQ ID N0S:44-45、49-54、57_59、85-86,94-96,104-109 和 113-115 的序列具有至少 70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、
96、97、98、99或100%同一性的蛋白质。核酸可以编码与选自SEQ ID N0S:47和55的序列具有至少 70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 同一性的蛋白质。核酸可以编码与选自SEQ ID N0S:46、48和56的序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一性的蛋白质。核酸可以编码与选自SEQ ID NOS:60-67,70 和 75 的序列具有至少 70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 同一性的蛋白质。核酸可以编码与选自SEQ ID N0S:68-69、71-74、76-77和112的序列具有至少 70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 同一性的蛋白质。核酸可以编码与选自 SEQ ID N0S:78-84 的序列具有至少 70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、
97、98、 99或100%同一性的蛋白质。核酸可以编码与选自SEQ ID N0S:97_103的序列具有至少 70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 同一性的蛋白质。核酸可以编码与选自 SEQ ID NOS:87-93 110-111 的序列具有至少 70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一性的蛋白质。核酸可以编码与选自SEQ ID NOS:44,45,49 和 54 的序列具有至少 70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%同一性的蛋白质。核酸可以编码与选自SEQ ID N0S:45、87、104-106和113的序列具有至少 70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 同一性的蛋白质。核酸可以编码与选自 SEQ ID N0S:50-53、57-59、94-96、104-109 和 113-115 的序列具有至少 70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 同一性的蛋白质。核酸可以编码与选自 SEQ ID N0S:54-56 和 60-65 的序列具有至少 70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一性的蛋白质。编码与所引用的参照序列具有小于100%同一性的蛋白质的上述任何核酸可以编码这样一种蛋白质，所述蛋白质和与所引用的参照序列具有100%同一性的蛋白质具有相同或基本相同的活性。可用本领域熟知的测定方法对任何特定的蛋白质的活性进行评估。可以使用在本发明的实施例或实施例的一部分中所述的方法对活性进行评估。所谓基本相同的活性也是本领域所熟知的。在一个实施方式中，基本相同的活性是指所述蛋白质的活性和与所引用的参照序列具有100%同一性的蛋白质相t匕，其活性差异在20%以内。在一个实施方式中，基本相同的活性是指所述蛋白质的活性和与所引用的参照序列具有100%同一性的蛋白质相比，其活性差异在15%以内。在一个实施方式中，基本相同的活性是指所述蛋白质的活性和与所引用的参照序列具有100%同一性的蛋白质相比，其活性差异在10%以内。在一个实施方式中，基本相同的活性是指所述蛋白质的活性和与所引用的参照序列具有100%同一性的蛋白质相比，其活性差异在5%以内。在一个实施方式中，基本相同的活性是指所述蛋白质的活性和与所引用的参照序列具有100%同一性的蛋白质相比，其活性差异在1%以内。本发明的实施方式中可以单独，或作为其他核酸的一部分，或作为载体的一部分或如上所述作为转基因植物的一部分提供上述核酸。可以用史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman algorithm)测量同一性(SmithTF, Waterman MS (1981)Identification of Common Molecular Subsequences,’’Journalof Molecular Biologyl47:195-197，该文献的全部内容通过援引的方式纳入本文，如同将其全文抄录在此一样)。在一个实施方式中，转基因植物可以源自玉米、柳枝稷、芒草、甘蔗或高粱的其中一种。转基因植物可以通过农杆菌介导的转化使用具有如上所述的核酸序列的质粒来制备。所述质粒具有与选自SEQ ID N0S: 188-283的序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一性的序列。所述质粒基本上由与选自SEQ ID N0S: 188-283 的序列具有至少 70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一性的序列组成。所述质粒由与选自SEQ ID N0S: 188-283的序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 同一性的序列组成。
[0099]在一个实施方式中，提供一种转基因植物，所述转基因植物包括与编码CWDE或编码被至少一个信号序列或内含子修饰的CWDE的参照核酸相杂交的核酸。编码CWDE的参照核酸序列可以编码任何CWDE氨基酸序列。编码被至少一个信号序列或内含子修饰的CffDE的参照核酸序列可以编码任何CWDE氨基酸序列以及至少任何一个信号序列或任何一个内含子。包括在转基因植物内的核酸可以被称为第一核酸。所述第一核酸能够在低严格度条件下与由选自SEQ ID N0S: 116-187的核苷酸序列或其互补序列所组成的第二核酸杂交。所述第一核酸能够在中严格度条件下与由选自SEQ ID N0S: 116-187的核苷酸序列或其互补序列所组成的第二核酸杂交。所述第一核酸能够在高严格度条件下与由选自SEQ ID N0S: 116-187的核苷酸序列或其互补序列所组成的第二核酸杂交。所述第一核酸能够在低、中或高严格度条件下与由选自SEQ ID N0S:116-117、121-126、129-131、157-158、166-168、176-181和185-187的核苷酸序列或其互补序列所组成的第二核酸杂交。第一核酸能够在低、中或高严格度条件下与由选自SEQ ID N0S: 119和127的核苷酸序列或其互补序列所组成的第二核酸杂交。第一核酸能够在低、中或高严格度条件下与由选自SEQID N0S: 118、120和128的核苷酸序列或其互补序列所组成的第二核酸杂交。第一核酸能够在低、中或高严格度条件下与由选自SEQ ID N0S: 132-139、142和147的核苷酸序列或其互补序列所组成的第二核酸杂交。第一核酸能够在低、中或高严格度条件下与由选自SEQID N0S: 140-141、143-146、148-149和184的核苷酸序列或其互补序列所组成的第二核酸杂交。第一核酸能够在低、中或高严格度条件下与由选自SEQ ID N0S: 150-156的核苷酸序列或其互补序列所组成的第二核酸杂交。第一核酸能够在低、中或高严格度条件下与由选自SEQ ID N0S: 169-175的核苷酸序列或其互补序列所组成的第二核酸杂交。第一核酸能够在低、中或高严 格度条件下与由选自SEQ ID N0S: 159-165和182-183的核苷酸序列或其互补序列所组成的第二核酸杂交。第一核酸能够在低、中或高严格度条件下与由选自SEQ ID N0S:116、117、121和126的核苷酸序列或其互补序列所组成的第二核酸杂交。第一核酸能够在低、中或高严格度条件下与由选自SEQ ID N0S:117、159、176-178和185的核苷酸序列或其互补序列所组成的第二核酸杂交。第一核酸能够在低、中或高严格度条件下与由选自 SEQ ID N0S:122-125、129-131、166-168、176-181 和 185-187 的核苷酸序列或其互补序列所组成的第二核酸杂交。第一核酸能够在低、中或高严格度条件下与由选自SEQID N0S: 126-128和132-137的核苷酸序列或其互补序列所组成的第二核酸杂交。用于最佳杂交试验的杂交试验和方法的实例在下列书中有记载:由冷泉港实验室的T.Maniatis, E.F.Fritsch,和 J.Sambrook 撰写的《分子克隆》，1982 出版；由 F.M.Ausubel, R.Brent, R.E.Kingston, D.D.Moore, J.G.Seidman, J.A.Smith, K.Struhl 撰写的《分子生物学中的当前协议(Current Protocols in Molecular Biology)》，卷 I, John ffiley&Sons, 2000,所述文献通过援引的方式纳入本文，如同将其全文抄录在此一样。通过示例而不是限制的方式，中严格度条件下的杂交程序如下:在含有6X SSC(Amresco, Inc.，Solon, 0H)、0.5%SDS (Amersco, Inc., Solon, OH)、5X Denhardt 溶液(Amersco, Inc., Solon, OH)、以及100 μ g/mL 变性的鲑鱼精 DNA(Invitrogen Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA)的溶液中，于68°C预处理含有DNA的过滤器(filters) 2-4小时。使用的每平方厘米的膜使用大约0.2mL的预处理的溶液。在相同的溶液中进行杂交并具有以下修饰:使用0.01MEDTA (Amersco, Inc., Solon, OH) > 100 μ g/mL 娃鱼精 DNA、以及 5_20X106cpm32P-标记或突光标记探针。在杂交混合物中于68°C培养过滤器16-20小时，然后在含有2X SSC和0.1%SDS的溶液中在室温下(25°C ±5°C)轻微搅拌清洗过滤器15分钟。用含有0.1X SSC和0.5%SDS的溶液代替清洗液，轻微搅拌下于68°C再培养2小时。涂抹干燥过滤器，暴露于成像器中或通过放射自显影成像(development)。如果需要的话，可以第三次清洗过滤器并再次暴露成像。通过示例而不是限制的方式，低严格度涉及使用低温进行杂交的杂交条件，例如在370C _60°C之间的温度。通过示例而不是限制的方式，高严格度涉及如上所述的杂交条件，但是不同的是使用高温，例如杂交温度高于68°C。与所引用的参照序列具有小于100%同一性的如上所述的任何核酸可以编码这样一种蛋白质，所述蛋白质和由与所引用的参照序列具有100%同一性的核酸序列编码的蛋白质具有相同或基本相同的活性。可用本领域熟知的测定方法对任何特定的蛋白质的活性进行评估。可以使用在本发明的实施例或实施例的一部分中所述的方法对活性进行评估。所谓基本相同的活性也是本领域所熟知的。在一个实施方式中，基本相同的活性是指所述蛋白质的活性和由与所引用的参照序列具有100%同一性的核酸序列编码的蛋白质相比，其活性差异在20%以内。在一个实施方式中，基本相同的活性是指所述蛋白质的活性和由与所引用的参照序列具有100%同一性的核酸序列编码的蛋白质相比，其活性差异在15%以内。在一个实施方式中，基本相同的活性是指所述蛋白质的活性和由与所引用的参照序列具有100%同一性的核酸序列编码的蛋白质相比，其活性差异在10%以内。在一个实施方式中，基本相同的活性是指所述蛋白质的活性和由与所引用的参照序列具有100%同一性的核酸序列编码的蛋白质相比，其活性差异在5%以内。在一个实施方式中，基本相同的活性是指所述蛋白质的活性和由与所引用的参照序列具有100%同一性的核酸序列编码的蛋白质相比，其活性差异在1%以内。转基因植物可以源自玉米、柳枝稷、芒草、甘蔗或高粱的其中一种。转基因植物可以通过农杆菌介导的转化使用包括任何上述的核酸的质粒制备。
[0100]在一个实施方式中，提供了一种载体，所述载体包括编码CWDE或编码被至少一个信号序列或内含子修饰的CWDE的核酸。编码CWDE的核酸序列可以编码任何CWDE氨基酸序列。编码被至少一个信号序列或内含子修饰的CWDE的核酸序列可以编码任何CWDE氨基酸序列以及至少任何一个信号序列或任何一个内含子。核酸可以编码与选自SEQ IDN0S:44-115 的序列具有至少 70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 同一性的蛋白质。核酸序列可以在低严格度条件下与由SEQ ID N0S: 116-187或其互补序列之一的序列组成的参照核酸杂交。核酸序列可以在中严格度条件下与由SEQ ID N0S: 116-187或其互补序列之一的序列组成的参照核酸杂交。核酸序列可以在高严格度条件下与由SEQID N0S: 116-187或其互补序列之一的序列组成的参照核酸杂交。载体可以包括与选自SEQID N0S: 188-283 的序列具有 70、72、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 同一性的序列。载体基本上可以由与选自SEQ ID N0S:188-283的序列具有70、72、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一性的序列组成。载体可以由与选自SEQ IDN0S: 188-283 的序列具有 70、72、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 同一性的序列组成。
[0101] 在一个实施方式中，可以将编码SEQ ID NOS:44-115的任何氨基酸序列的至少一部分的分离的核酸、多核苷酸或寡核苷酸用作杂交探针或引物。在一个实施方式中，可以将所述分离的核酸、多核苷酸或寡核苷酸的互补序列用作杂交探针或引物。在一个实施方式中，可以将包括一个序列的分离的核酸用作杂交探针或引物，所述序列能够在低、中或高严格度条件下与具有SEQ ID NOS: 116-187和188-283的或其互补的任何一个序列的核酸的至少一部分杂交。这些分离的核酸、多核苷酸或寡核苷酸具有但不限于10-100、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-35、10-30、10-25、10-20 或 10-15 个核苷酸的长度，或20 - 30个核苷酸的长度，或25个核苷酸的长度。本文所述的核苷酸序列的长度范围包括在所述范围内的核苷酸序列的每个长度，也包括所述范围的终点。所述核苷酸的长度可以从参照序列内的任何单一位置开始，只要该位置之后的核苷酸长度还能够满足所述长度。在一个实施方式中，在编码选自SEQ ID N0S:44-115其中之一的蛋白质的核酸或其互补序列中，杂交探针或引物与一种核酸具有85-100%、90-100%、91-100%、92-100%、93-100%、 94-100%、95-100%、96-100%、97-100%、98-100%、99-100%或 100% 的互补性，所述核酸具有与所述探针或引物相同的长度并具有选自与所述探针或引物的长度相应的核苷酸的长度的序列。在一个实施方式中，在具有SEQ ID N0S:116-283的其中之一的序列的核酸中，杂交探针或引物与一种核酸具有 85-100%、90-100%、91-100%、92-100%、93-100%、94-100%、
95-100%,96-100%,97-100%,98-100%,99-100%或100%的互补性，所述核酸具有与所述探针或引物相同的长度并具有选自与所述探针或引物的长度相应的核苷酸的长度的序列。在一个实施方式中，杂交探针或引物沿着它的长度与相应长度的编码SEQ ID N0S:44-115的之一的序列的核酸或所述核酸的互补序列杂交。在一个实施方式中，杂交探针或引物沿着它的长度与相应长度的具有SEQ ID N0S: 116-187的之一的序列的核酸或其互补序列杂交。在一个实施方式中，杂交可能在低严格度条件下发生。在一个实施方式中，杂交可能在中严格度条件下发生。在一个实施方式中，杂交可能在高严格度条件下发生。
[0102]本发明实施方式中的分离的核酸、多核苷酸或寡核苷酸可以包括天然核苷酸、天然核苷酸类似物或合成的核苷酸类似物。本发明实施方式中的核酸、多核苷酸或寡核苷酸可以是包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或肽核酸(PNA)的任何种类的核酸。本发明列举的核酸序列被列为DNA序列，但本发明的实施方式还考虑到了其它核酸，包括其中以U替代T的RNA序列。
[0103]尽管在本发明的实施方式中可以使用未标记的杂交探针或引物，但是杂交探针或引物也可以带有可检测的标记，并能够用于检测、测序或合成核酸。示例性标记包括但不限于:放射性核素、光吸收性化学基团、染料以及荧光基团。标记可以是荧光基团，如6-羧基荧光素(FAM)、6_羧基-4，7，2，，7，-四氯荧光素(TET)、罗丹明、JOE (2，7-二甲氧基-4，5-二氯-6-羧基荧光素)、HEX (六氯-6-羧基荧光素)或VIC。
[0104]在一个实施方式中，提供了处理植物生物量的方法。所述方法可以包括通过将植物或其部分与液体混合形成液固比小于或等于15的混合物，来预处理植物或其部分。所述预处理可以包括提供条件以保持混合物在小于或等于100°C的温度下。所述方法可以包括提供一种或多种酶的步骤。植物生物量可以是或源自任何植物或其部分。植物生物量可以是或源自本发明所描述、说明或要求保护的任何转基因植物或其部分。所述方法可以包括不是本发明所描述、说明或要求保护的任何转基因植物或其部分，并且与本发明所描述、说明或要求保护的任何转基因植物或其部分相结合。混合物中的液固比的比值可以小于或等于 25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2 或 I。液固比可以是8或更小。液固比可以是8。预处理的步骤可以包括保持温度小于或等于100°C至少4小时。预处理的步骤可以包括保持温度40°C-90°C。制备混合物所使用的液体可以是任何液体。在一个实施方式中，所述液体是水。在一个实施方式中，所述液体包括水、亚硫酸氢铵以及碳酸铵。亚硫酸氢铵可以是任何适合的浓度。在一个实施方式中，亚硫酸氢铵的浓度值为植物或其部分的8%-38%重量百分比(包括端点的浓度值)。碳酸铵可以是任何适合的pH。在一个实施方式中，碳酸铵的pH在7.6-8.5范围内，包括端点的pH值。碳酸铵的浓度可以是任何适合的浓度。在一个实施方式中，碳酸铵的浓度值为植物或其部分的4%-19%重量百分比(包括端点的浓度值)。所述提供一种或多种酶的步骤可以包括提供任何适合处理植物生物量的酶。在一个实施方式中，所述一种或多种酶包括至少一种能够水解木质素纤维物质的酶。在一个实施方式中，一种或多种酶包括内切葡聚糖酶、β_葡糖苷酶、纤维二糖水解酶或木聚糖酶中的至少一种。在一个实施方式中，一种或多种酶包括木聚糖酶、纤维素酶、纤维二糖水解酶、葡糖苷酶、木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶(arabinofuronosidase)或阿魏酸酯酶中的至少一种。在一个实施方式中，所述方法包括提供一种或多种酶的步骤，其中所述一种或多种酶不是木聚糖酶，然后将添加木聚糖酶作为另外的步骤。
[0105]本发明的任何单一的实施方式可以用本发明任何一个或多个其它实施方式中的一个或多个要素进行补充。
[0106]实施例——提供下述非限制性的实施例以说明具体的实施方式。整个实施方式都可以用下面任何一个或多个实施例中的一个或多个细节进行补充。
[0107]实施例1-pSBll
[0108]参见图1，本发明的一个实施方式中的载体可以以pSBll中间质粒(pBR322的一种衍生物)为基础。 pSBll从日本烟草公司(Japan Tobacco)获得。pSBll质粒适合克隆并容易在大肠杆菌中维持。通过使用PSBll与pSBl “超二元”受体载体(非致瘤Ti质粒)中都存在的cos和ori位点进行的同源重组，从而将两个载体相偶联，能够维持在LB4404农杆菌菌株内。集成产品代表了能够用于随后的植物转化的杂交载体。PSBl包括毒力基因如virB、virC和virG，这些基因对于T-DNA的处理和送递至植物细胞是必需的。pSBll具有多重克隆位点，所述克隆位点包括用于克隆带有目标基因序列的表达盒的独特的限制性酶识别位点。
[0109]实施例2-pAG1000
[0110]参见图2A，通过对pSBll进行修饰以便使其能够接受几个基因表达盒，从而形成pAGlOOO。首先，从pN0V2819质粒(Syngenta Biotechnology)中克隆出原始表达盒，并以HindII1-KpnI片段的形式克隆至pSBll中以形成pAGlOOO，所述原始表达盒包括阳性筛选标记基因manA，所述基因编码由夜香木黄曲叶病毒启动子(CMPS)驱动的磷酸甘露糖异构酶(PMI)。
[0111]实施例3-pAG1001，pAG1002 和 pAG1003
[0112]通过将pAGlOOO进一步修饰，移除EcoRI位点(核苷酸位置#7)从而形成PAG1001 (图2B)，然后移除KpnI位点(核苷酸位置#1)从而形成pAG1002 (图2C)。这些修饰使得EcoRI和KpnI位点可以用于后续克隆带有所关注基因(GOI)的表达盒。参见图3A，下述的新多重克隆位点(MCS)序列,包括 Pac1、Xho1、SnaB1、Nco1、Kpn1、Xma1、AvrI1、EcoRI位点，是通过PCR合成为249bp的Pme1-HindIII片段，并被克隆至pAG1002的Pme1-HindIII位点中，从而提供PAG1003载体。
[0113]>MCS
[0114]GTTTAAACTGAAGGCGGGAAACGACAACCTGATCATGAGCGGAGAATTAAGGGAGTCACGTTATGACCCCCGCCGATGACGCGGGACAAGCCGTTTTACGTTTGGAACTGACAGAACCGCAACGTTGAAGGAGCCACTCAGCTTAATTAAGTCTAACTCGAGTTACTGGTACGTACCAAATCCATGGAATCAAGGTACCATCAATCCCGGGTATTCATCCTAGGTATCCAAGAATTCATACTAAAGCTT(SEQ ID NO:17)
[0115]实施例4_pAG2000
[0116]参见图3B，可以通过用水稻泛素3启动子(SEQ ID NO:1)代替pAG1003中的病毒CMPS启动子来提供高表达水平，水稻泛素3启动子(SEQ ID NO:1)是一个被广泛研究并被证明在单子叶植物中对基因表达有效的启动子。0sUbi3P已经从pRESQlOl质粒中被克隆。pRESQlOl记载于E.Sivamani> J.D.Starmer和R.Qu的“用于改进的转基因表达的水稻泛素3启动子基因表达盒的序列分析”，植物科学，177 (6) =549-556, 2009，该文献通过援引的方式纳入本文， 如同将其全文抄录在此一样。为了进行克隆，对0sUbi3P进行了如下的修饰:1)通过PCR方法将EcoRI位点引入5’端；2)移除XmaI位点，将BamHI位点加入到3’端。0sUbi3P的部分序列被组装为pBluescript中的Apa1-BamHI片段，然后克隆为HindII1-BamHI的整个启动子区域，所述区域包括与pAG1003经HindII1-SpeI消化后产生的PMI相融合的第一泛素内含子。这后一次克隆产生了 PAG2000载体。
[0117]实施例5-PAG2004 和 pAG2005
[0118]将pAG2000载体进行进一步修饰，以便形成克隆载体，所述克隆载体适于接受GOI表达盒，而且能提供用于植物转化的PMI筛选标记的增强表达。PMI表达的优化过程包括用新的9nt序列替代pAG2000中连接0sUbi3内含子与起始PMI基因密码子的原始连接序列(如下SEQ ID N0:18所示)。下述SEQ ID NO:18中，用下划线标注的是原始连接序列，用粗体标注的是起始密码子。下述SEQ ID N0:19中，用方框标注的是新的9nt序列。据E.Sivamani和R.Qu (2006)报道，用方框标注的序列作为有效序列能够有效地在pRESQ48中提供高水平的瞬间GUS表达，该文献通过援引的方式纳入本文，如同将其全文抄录在此一样。这个9nt序列代表了水稻泛素3基因的三个起始密码子，其中起始密码子ATG已经被修饰为ATC以便消除附加的翻译起始位点。为了实现这一修饰，PAG2000中的BglI1-XcmI片段(核苷酸位置9726-105)被PCR合成的片段代替，所述PCR合成的片段包括所需的9nt连接序列，并在连续反应中使用引物P64/P68、P64/P66和P64/P67形成。
[0119]PAG2000 的 BglI1-XcmI 片段(核苷酸位置 9726-105)
[0120]AgatctgttgtcctgtagttacttatgtcagttttgttattatctgaagatatttttggttgttgcttgttgatgtggtgtgagctgtgagcagcgctcttatgattaatgatgctgtccaattgtagtgtagtatgatgtgattgatatgttcatctattttgagctgacagtaccgatatcgtaggatctggtgccaacttattctccagctgcttttttttacctatgttaattccaatcctttcttgcctcttccagGGATCCCCGATCATGCAAAAACTCATTAACTCAGTGCAAAACTATGCCTGGGGCAGCAAAACGGCGTTGACTGAACTTTATGGTATGGAAAATCCGTCCAGCCAGCCGATGG(SEQID NO:18)
[0121]用于pAG2004构建的PCR合成的BglI1-XcmI片段
[0122]Agatctgttgtcctgtagttacttatgtcagttttgttattatctgaagatatttttggttgttgcttgttgatgtggtgtgagctgtgagcagcgctcttatgattaatgatgctgtccaattgtagtgtagtatgatgtgattgatatgttcatctattttgagctgacagtaccgatatcgtaggatctggtgccaacttattctccagctgcttttttttacctatgttaattccaatcctttcttgcctcttccag ATCCAGATA ATGCAGAAACTCATTAACTCAGTGCAAAACTATGCCTGGGGCAGCAAAACGGCGTTGACTGAACTTTATGGTATGGAAAATCCGTCCAGCCAGCCGATGG(SEQID NO:19)
[0123]
【权利要求】
1.一种处理植物生物量的方法,该方法包括: 通过将植物或其部分与液体混合，形成液固比小于或等于15的混合物，并提供条件使所述混合物的温度保持在小于或等于100°C，从而对植物或其部分进行预处理；以及 提供一种或多种酶，以进行木质纤维素材料的酶促水解； 其中，所述植物为转基因植物，所述转基因植物选自由以下组成的组:通过使用质粒由农杆菌介导的转化制得的转基因植物，所述质粒含有与SEQ ID N0S:206、207、209-230和232-279之一的序列具有至少90%的同一性的核苷酸序列；含有细胞壁降解酶的转基因植物，所述细胞壁降解酶具有与选自SEQ ID NOS:44-115的序列具有至少90%的同一性的氨基酸序列；和，含有核酸的转基因植物，所述核酸具有与选自SEQ ID NOS: 116-187的序列具有至少90%的同一性的序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括提供转基因植物或其部分，所述转基因植物选自由以下组成的组:通过使用质粒由农杆菌介导的转化制得的转基因植物，所述质粒含有与SEQ ID NOS: 206、207、209-230和232-279之一的序列具有至少90%的同一性的核苷酸序列；含有细胞壁降解酶的转基因植物，所述细胞壁降解酶具有与选自SEQ IDNOS:44-115的序列具有至少90%的同一性的氨基酸序列；和，含有核酸的转基因植物，所述核酸具有与选自SEQ ID N0S: 116-187的序列具有至少90%的同一性的序列。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述液固比选自小于或等于14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2 或 1。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述液固比为8或更小。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述预处理的步骤包括保持温度小于或等于100°C至少4小时。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述小于或等于100°C的温度范围为40 0C -90 0C .
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述液体是水。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述液体包括水、亚硫酸氢铵和碳酸铵。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，按照wt.M.计算，以所述植物或其部分为基准，所述亚硫酸氢铵的浓度是8%-38%。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，按照wt./wt.计算，以所述植物或其部分为基准，所述碳酸铵的浓度是4%-19%，溶液的pH为7.6-8.5。
11.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述提供一种或多种酶的步骤包括提供内切葡聚糖酶、β -葡糖苷酶和纤维二糖水解酶中的至少一种。
12.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述提供一种或多种酶的步骤包括提供木聚糖酶。
13.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述转基因植物是玉米、柳枝稷、芒草、甘蔗或高粱中的一种。
14.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述转基因植物是玉米。
15.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述转基因植物是柳枝稷。
【文档编号】C12P19/02GK103966279SQ201410108640
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2010年11月5日 优先权日:2009年11月6日
【发明者】R·M·莱布, O·布格瑞, V·萨莫伊洛夫, N·埃克堡 申请人:谷万达公司