一种拟枝孢镰刀菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种拟枝孢镰刀菌及其应用，所述拟枝孢镰刀菌命名为拟枝孢镰刀菌（Fusarium?sporotrichioides）XJ-7，已于2013年5月26日保藏于位于中国武汉市珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC?NO：M2013231。所述应用是指该拟枝孢镰刀菌在降解增塑剂中的应用。本发明的拟枝孢镰刀菌能用于降解邻苯二甲酸二辛酯，能在以邻苯二甲酸二辛酯为唯一碳源和能源的培养基中生长。
【专利说明】—种拟枝孢镰刀菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物种质资源应用领域，具体涉及一种拟枝孢镰刀菌及其应用。
【背景技术】
[0002]塑料广泛应用到人类生活的许多领域，给人们的生活带来方便的同时，也产生了大量的环境污染。塑料生产时，为了增加其弹性和柔韧性，扩大塑料产品的应用范围，会将大量的增塑剂添加到在其骨架结构成分如聚乙烯或聚氯乙烯中。
[0003]邻苯二甲酸二辛酯(DOP，dioctyl phthalate)是最常用的塑料薄膜增塑剂之一。DOP综合性能良好，混合性能好，增塑效率高,挥发性较低，低温柔软性较好，耐热性和耐候性良好，是工业上最为广泛使用的通用型增塑剂，与工业上使用的绝大多数合成树脂和橡胶均有良好的相容性。DOP主要用于聚氯乙烯脂的加工，还可用于环氧树脂、醋酸树脂、ABS树脂及橡胶等高聚物的加工，广泛用于造漆、染料、分散剂等，在制造人造革、农用薄膜、包装材料、电缆等许多领域广泛应用。
[0004]由于塑料难以降解，随着塑料的大量使用，废塑料残体大量存在于环境中，带来越来越严重的环境污染问题。塑料中增塑剂如邻苯二甲酸二辛酯，是通过分子间作用力与塑料骨架成分结合的，然而这种分子间作用力并不稳定，增塑剂容易通过淋溶、挥发、沉降等过程进入自然环境，可以累积在土壤、沉积物中，也可以通过土壤、水体和大气等环境介质发生迁移、转化，扩大污染。
[0005]邻苯二甲酸酯类物质具有生殖、发育毒性，是环境激素类物质。我国将DOP列为优先监测污染物，而美国国家环保局(USEPA)已将DOP列为优先控制有毒污染物。通过生物富集，DOP对动物具有致癌、致突变、致畸和生殖毒性等作用；对人体具有慢性毒性、引起雌激素效应以及肥胖症，甚至致癌。因此，为了减少和防止DOP对环境的污染，需要采取一定手段对DOP进行有效处理。
[0006]在环境污染的众多治理方法中，生物治理越来越受到重视，其优点主要有:处理成本低廉，转化效率高，二次污染少，条件易于控制。真菌作为可以用于环境污染处理的资源微生物，分布广泛，种类多样，适应性好，在生长过程中可以将分泌大量非特异性胞外酶，分解周围的有机物为自身需要的物质和能量。人们可以根据污染物的特点，筛选有用的真菌菌株，分解特定的环境污染物。
[0007]在键刀菌属中，有报道(SabevHAl, Handley PS, Robson GD..Fungal colonizationof soil-buried plasticized polyvinyl chloride (pPVC) and the impact of incorporatedbiocides.Microbiology.2006; 152 (Pt6): 1731-1739.)爺腐皮键刀菌(Fusarium soIani)具有分解邻苯二甲酸二辛酯的作用，拟枝孢镰刀菌对增塑剂邻苯二甲酸二辛酯的降解作用尚未见报道。
【发明内容】
[0008] 本发明提供了一种拟枝孢镰刀菌，该拟枝孢镰刀菌对邻苯二甲酸二辛酯具有较强的降解作用。
[0009]一种拟枝孢镰刀菌，分类命名为拟枝孢镰刀菌(Fusariumsporotrichioides),株号为XJ-7，已于2013年5月26日保藏于位于中国武汉市珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2013231。
[0010]本发明的拟枝孢镰刀菌分离自在麦田中使用过的破旧地膜，其ITS序列如SEQ IDN0.1所示，主要生物学特征为:在PDA平板上菌落生长迅速，220C生长5天后菌落直径可达6cm ;气生菌丝发达，呈白色至浅黄色，在培养基中有浅红色色素产生，菌丝宽2-4 μ m ;分生孢子梗单生或轮生，不分支 或分支；产孢细胞瓶梗状，8-30 X 2-4 μ m ;分生孢子大小变化大，有隔膜，隔膜数0-5个；小孢子腊肠状至纺锤形5-9 X 4-7 μ m ;大孢子镰刀形，1-5个隔膜，17-28X3.5-5 μ m ;菌丝中或菌丝顶端细胞常出现细胞壁加厚，细胞缩短，形成厚垣孢子。
[0011]并且，该拟枝孢镰刀菌还能以邻苯二甲酸二辛酯为唯一碳源和能源生长。基于该生长特性，本发明还提供了一种所述拟枝孢镰刀菌的生长培养基，包括碳源，所述碳源为邻
苯二甲酸二辛酯。
[0012]作为优选，所述邻苯二甲酸二丁辛酯的浓度为0.2~0.4%，更优选为0.2%。作为进一步优选，所述生长培养基的配方为=K2HPO4.3H209g、KH2P043g、MgSO4.7H200.lg、(NH4)2SO4IgJl^ 15g、邻苯二甲酸二丁辛酯 2g、水 lOOOmL。
[0013]基于该菌的生长特性，本发明还提供了所述拟枝孢镰刀菌在降解增塑剂中的应用，具体包括:将拟枝孢镰刀菌的菌悬液或孢子悬液投加到被增塑剂污染的土壤或水体中。作为优选，所述增塑剂为邻苯二甲酸二辛酯。
[0014]本发明还提供了一种含有所述拟枝孢镰刀菌的菌剂，该菌剂可以采用菌丝或孢子制成，优选为采用孢子制成，菌剂中拟枝孢镰刀菌孢子的浓度为1.0 X IO6~IO8个/mL。
[0015]当需要对邻苯二甲酸二辛酯进行降解处理时，将该菌剂直接投加或经适当倍数稀释后投加到被污染土壤或水体中即可。
[0016]与现有技术相比，本发明的有益效果为:
[0017]本发明的拟枝孢镰刀菌能用于降解邻苯二甲酸二辛酯，该拟枝孢镰刀菌能在以邻苯二甲酸二辛酯为唯一碳源和能源的培养基中生长。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1A为XJ-7菌株的分生孢子形态图；
[0019]图1B为XJ-7菌株的分生孢子梗和分生孢子形态图；
[0020]图1C为XJ-7菌株的另一分生孢子形态图；
[0021]图1D为XJ-7菌株的另一分生孢子梗和分生孢子形态图；
[0022]图1E为XJ-7菌株的又一分生孢子形态图；
[0023]图1F为XJ-7菌株的又一分生孢子梗和分生孢子形态图；
[0024]图1G为XJ-7菌株着生分生孢子的分生孢子梗形态图；
[0025]图1H为XJ-7菌株在菌丝顶端形成的厚垣孢子形态图；
[0026]图1I为XJ-7菌株在菌丝顶端形成的又一厚垣孢子形态图；
[0027]图1J为XJ-7菌株在菌丝中段形成的厚垣孢子形态图；[0028]图1A ~IJ 中，标尺=IOym;
[0029]图2Α为XJ-7菌株在PDA培养基上生长7天的菌落形态图(正面)；
[0030]图2Β为XJ-7菌株在PDA培养基上生长7天的菌落形态图(反面)；
[0031]图3Α为XJ-7菌株在含DOP的基本培养基上生长14天的菌落形态图；
[0032]图3Β为XJ-7菌株在不含DOP的基本培养基上生长14天的菌落形态图。
【具体实施方式】
[0033]实施例1菌株分离
[0034]1、培养基配制
[0035](I)马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar, PDA):在马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g中加蒸馏水定容至1000mL ;然后进行常规的高温灭菌(1.1个大气压，121°C下灭菌 20min)。
[0036](2) 2%水琼脂(WA)培养基:琼脂粉20g、水1000mL,进行常规的高温灭菌(1.1个大气压，121°C下灭菌20min)。
[0037](3)基本培养基=K2HPO4.3Η209δ,ΚΗ2Ρ043δ,MgSO4.7Η200.lg、(NH4)2S04lg、琼月旨 15g、 水lOOOmL，进行常规的高温灭菌(1.1个大气压，121°C下灭菌20min)。
[0038]2、菌株分离
[0039]XJ-7菌株的采集地点是我国新疆维吾尔自治区昌吉回族自治州昌吉市(东经80。12’13.68’’，北纬120。7’11.28’’)小麦田中使用过的地膜，其分离步骤为:
[0040](I)采集麦田中使用过的破旧地膜，带回实验室中，用自来水漂洗干净，再用无菌水漂洗3次；
[0041](2)处理后的地膜用无菌刀片切成3X3cm2的小块,置于含50 μ g/mL氨节青霉素和50 μ g/mL链霉素的2%水琼脂(WA)平皿上，25°C暗培养3天；
[0042](3)然后将平板置于无菌操作台上，置于解剖镜下检查，将在地膜上长出的菌丝用挑针接种到直径为6cm的PDA培养基平板上，继续培养7天；
[0043](4)取5ml无菌水加到步骤(3)的培养皿中，用灭菌的涂布棒轻轻涂布以洗下孢子，吸取ImL孢子液到1.5mL离心管中，取100 μ L孢子液滴在血球计数板上,显微镜下计数；
[0044](5)根据计数结果，取100 μ L孢子液加到一个新的1.5mL离心管中，加适量无菌水配成浓度为2000个孢子/mL的孢子液；将IOOmL的2%水琼脂(WA)培养基融化后，室温冷却至5(TC,再加入氯霉素储备液(34mg/mL)和链霉素储备液(10mg/mL)各100 μ L,混匀后倒平板；在已经倒好的含氯霉素和链霉素水琼脂平板上均匀涂布50 μ L浓度为2000个孢子/mL的孢子液,培养2天；
[0045](6)在倒置显微镜下，在步骤(5)获得的平板上找到单个孢子萌发形成的小菌落，用挑针转移到新的PDA平板上，25°C培养5天，得到单孢分离的纯培养物；通过这种方法分离得到了 230株真菌纯培养物；
[0046](7)将分离得到的真菌纯培养物分别接种在含有0.2%D0P的基本培养基上培养7天，发现菌株XJ-7生长出菌丝；将菌株XJ-7保存在PDA培养基上。
[0047]3、菌株鉴定[0048](I)形态鉴定
[0049]XJ-7经过单孢分离纯化后，接种到PDA培养基上，22°C培养7天。用挑针挑取少量菌体，制成玻片，在显微镜下观察，测量，拍照。分生孢子和分生孢子梗形态如图1所示，菌落生长状态如图2所示。
[0050]其形态特征为:在PDA平板上菌落生长迅速，22°C生长5天后菌落直径可达6cm ；气生菌丝发达，呈白色至浅黄色，在培养基中有浅红色色素产生，菌丝宽2-4 μ m ;分生孢子梗单生或轮生，不分支或分支；产孢细胞瓶梗状，8-30 X 2-4 μ m;分生孢子大小变化大，有隔膜，隔膜数0-5个；小孢子腊肠状至纺锤形，5-9X4-7 μ m ;大孢子镰刀形，1-5个隔膜，17-28 X 3.5-5 μ m ;菌丝中或菌丝顶端细胞常出现细胞壁加厚，细胞缩短，形成厚垣孢子。
[0051](2)分子鉴定
[0052](2.1) DNA 提取
[0053]I)在PDA平板上22°C培养XJ-7菌株7天后，用牙签刮取平板上的菌丝，放入已灭菌的含有300 μ L提取缓冲液1.5mL离心管中；
[0054]提取缓冲液的配方为:1MKCl，IOOmM Tris-HCl, IOmM EDTA, ρΗ=8.0 ；
[0055]2)将挑取的菌丝用电磨机研碎，然后再加入300 μ L提取缓冲液，剧烈震荡2min ；
[0056]3) 1000Orpm 离心 IOmin ；
[0057]4)吸取上清液，转移至另一新的离心管中，弃沉淀；
[0058]5)在上清液中加入等体积的异丙醇(分析纯)，轻轻颠倒混匀数次后，12000rpm离心IOmin,沉淀核酸；
[0059]6)轻轻倒去上清液，将含有沉淀的离心管倒置在吸水纸上排干水分；
[0060]7)再加入300 μ L70%乙醇，轻轻颠倒混匀数次后，12000rpm离心2min ；
[0061]8)轻轻倒去上清液，重复步骤(7) 一次；
[0062]9)将离心管倒置在吸水纸上排干水分，置于37°C下15min，使乙醇充分挥发；
[0063]10)用50 μ L ddH20重悬沉淀，得到XJ-7基因组DNA，浓度达到30ng/ μ L。
[0064](2.2)真菌ITS rDNA基因的PCR扩增
[0065]PCR扩增在50 μ L反应体系中进行，体系中含有:上下游引物各2 μ M，dNTPs200 μ M, MgCl2L 5mM, 10 XPCR buffer5 μ L,模版 DNA2 μ L, Taq 酶 2U。
[0066]上游引物ITSl 序列为:5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，
[0067]下游引物ITS4 序列为:5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。
[0068]PCR扩增反应在朗基MG96G型PCR仪上进行。反应条件:94°C预变性2min，然后35个循环包括:94°C变性30sec，55°C退火40sec，72°C延伸lmin。最后72°C后延伸lOmin。
[0069](2.3) PCR产物的回收纯化
[0070]PCR反应结束后，PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，采用爱思进生物技术公司的DNA凝胶纯化试剂盒，按照试剂盒说明书的步骤进行，步骤如下:
[0071] I)将50 μ L PCR产物全部加到1%的琼脂糖凝胶的点样孔中，按5V/CM的电泳条件电泳30min ；
[0072]2)电泳结束后，在紫外灯下用刀片切取含目的DNA片段的凝胶，置于2mL离心管中,称重；
[0073]3)按照Img凝胶加入3mL的DE-A缓冲液的标准，加入DE-A缓冲液到收集凝胶的2mL离心管中，75°C保温lOmin，期间振荡数次，至完全融化；
[0074]4)加入0.5倍DE-A体积的DE-B缓冲液，混合均匀；
[0075]5)将DNA制备管放入2mL离心管中，将混合液转移到DNA制备管中，12000rpm离心lmin,弃上清；
[0076]6)将DNA制备管放回2mL离心管中，加500 μ L缓冲液Wl, 12000rpm离心30s ；
[0077]7)将DNA制备管放回2mL离心管中，加700 μ L缓冲液W2, 12000rpm离心30s ；
[0078]8 )重复步骤(7 ) 一次；
[0079]9)将DNA制备管放回2mL离心管中，12000rpm离心2min。以排干膜上洗涤液；
[0080]10)将DNA制备管放回2mL离心管中，加50 μ L的ddH20, 1000Orpm离心lmin,洗脱DNA置-20°C下保存。
[0081](2.4)基因的测序和序列分析
[0082]经电泳检测后的已经纯化回收的目的DNA片段送至上海生工用ABIPRISMA377型自动测序仪进行测序。测序结果经过严格核对后，得到如SEQ ID N0.1所示的长度为498bp的DNA片段序列。
[0083]在NCBI网站上，将测得的核苷酸序列用BLAST在GenBank数据库中查找和比对同源或相似的核苷酸序列 。根据同源序列的数据库注释，再结合菌株的形态结构来判断所研究菌株的种属。经过BLAST比对，该序列与登录号为KC254054和FJ614629的序列覆盖率100%，相似度达到99%。这两个序列都是来自枝孢镰刀菌菌(即Fusariumsporotrichioides)的ITS rDNA。这些结果表明分子鉴定与形态鉴定结果相符。
[0084]至此推断XJ-7菌株为拟枝孢镰刀菌，对该菌株进行了如下保藏:保藏名称为:拟枝孢镰刀菌菌株XJ-7 (Fusarium sporotrichioides),保藏单位:中国典型培养物保藏中心，保藏地址:中国武汉武汉大学；保藏日期:2013年5月26，保藏号:CCTCC No:M2013231。
[0085]实施例2XJ-7对DOP的降解利用
[0086]在实施例1的基本培养基中加入终浓度0.2%的邻苯二甲酸二丁辛酯，获得本实施例的生长培养基。
[0087]在PDA培养基上接种菌株XJ_7，25°C培养7天，从菌落边缘挑取约3X 3cm2的菌块，置于含有上述生长培养基的平板中央(直径9cm)，以不加DOP的基本培养基为对照，置于25°C培养10天，观察菌株XJ-7的生长情况，观察结果见图3。
[0088]由图3可见，培养10天后，在含有DOP的固体培养基上，菌株XJ-7的气生菌丝明显生长，且菌落中央的菌丝明显比菌落边缘的浓密；而在不含DOP的基本培养基上，没有菌株XJ-7生长。表明XJ-7可以降解DOPJf DOP作为唯一碳源和能源加以分解利用，为自身菌丝生长和产孢提供碳素营养。
【权利要求】
1.一种拟枝孢镰刀菌，其特征在于，命名为拟枝孢镰刀菌(Fusariumsporotrichioides) XJ-7，保藏编号为 CCTCC NO:M2013231。
2.一种如权利要求1所述拟枝孢镰刀菌的生长培养基，包括碳源，其特征在于，所述碳源为邻苯二甲酸二丁辛酯。
3.如权利要求2所述的生长培养基，其特征在于，所述邻苯二甲酸二辛酯的浓度为0.2 ~0.4%。
4.如权利要求2所述的生长培养基，其特征在于，所述邻苯二甲酸二辛酯的浓度为0.2%。
5.一种含有如权利要求1所述拟枝孢镰刀菌的菌剂。
6.如权利要求5所述的菌剂，其特征在于，菌剂中拟枝孢镰刀菌孢子的浓度为1.0X IO6 ~IO8 个/mL。
7.如权利要求1所述拟枝孢镰刀菌在降解增塑剂中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，包括:将拟枝孢镰刀菌的菌悬液或孢子悬液投加到被增塑剂污染的土壤或水体中。
9.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述增塑剂为邻苯二甲酸二辛酯。
【文档编号】C12N1/14GK104004659SQ201410130131
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年4月2日 优先权日:2014年4月2日
【发明者】王洪凯, 林福呈 申请人:浙江大学