一种辅助诊断冠心病的检测试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种辅助诊断冠心病的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包含用于检测APOE基因rs7259620单核苷酸多态性的APOE基因引物和用于检测APOA5基因rs662799单核苷酸多态性的APOA5基因引物；其通过将检测试剂盒的APOE基因引物和APOA5基因对样品DNA进行PCR扩增，并对PCR扩增产物用荧光定量PCR仪分析熔解曲线，再将熔解曲线与标准熔解曲线进行比较，对比PCR扩增产物的Tm值，获得相应的基因分型结果。本检测试剂盒可以预测受试者的冠心病，检测方法简单，检测效率高，针对性强，从而能够促进冠心病的早期预防和为用药治疗提供参考。
【专利说明】一种辅助诊断冠心病的检测试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及冠心病的辅助诊断【技术领域】，特别涉及一种辅助诊断冠心病的检测试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002]冠心病亦称为缺血性心脏病(coronary heart disease, CHD),涉及供应心肌血液的动脉发生粥样硬化，即冠状动脉粥样硬化导致血管腔狭窄或斑块形成甚至破裂、完全堵塞，限制或完全中断了心肌的血液供应，引起临床上心绞痛、心肌梗死等一系列严重的心肌缺血病症。冠心病是现今威胁人类健康最严重的疾病之一，人类健康的主要杀手。随着经济快速发展，世界范围的疾病谱发生了明显的变化，心血管疾病逐渐成为了主要疾病。在2008年大概有1730万人死于心血管病，占全球死亡人数的30%。其中，死于冠心病的约有730万，占了总数的近42%。有流行病学研究显示，到2020年，每年将有2500万人死于心血管疾病，且心血管疾病预计将超过传染性疾病成为全球死亡和残疾的主要原因。虽然据世界卫生组织MONICA资料统计，我国发病率较西方国家低，但我国冠心病发病率呈逐渐上升趋势。冠心病的发生是许多因素参与的复杂过程，是环境因素和遗传因素共同作用的结果。众所周知，冠心病的发病与吸烟，饮酒，肥胖，高血压，糖尿病，血脂异常等有关。但遗传因素起了独特的作用，特别是家族遗传因素是冠心病的一个重要独立危险因素。基因检测可对冠心病防治做出巨大贡献，发展疾病诊断和治疗新手段，具有很大前景。
[0003]研究发现，血脂异常与冠心病的发生有很大的关系，据统计冠心病患者血清中低密度脂蛋白(LDL-C)，甘油三酯(TG)，总胆固醇(TC)明显高于非冠心病患者，而高密度脂蛋白(HDL-C)明显低于非冠心病患者。而且国内外已发现SNPrs7259620和rs662799与TC, TG, LDL-C, HDL-C等存在相关性。而血脂异常还与其他很多疾病有关，如代谢综合征，脑卒中，中风，肾衰，阿尔兹海默症等。故我们可能可以通过检测SNPrs7259620和rs662799与其他相关疾病的相关性，辅助判断，做到提早预防及用药参考等。
[0004]单核苷酸多态性(SNP)是指基因组DNA中某一特定核苷酸位置上发生转换、颠换、插入或缺失等变化，是第三代分子标记。据估计，大约有10亿个SNP分子标记将被用于基因功能及与疾病的相关性的关联研究。国内外已经有部分有关于rs7259620和rs662799与冠心病相关性的研究。APOE即载脂蛋白E，具有多态性，多态性决定个体血脂水平与动脉粥样硬化发生发展密切相关，是动脉粥样硬化早期及发展过程中个体差异的主要原因，增加冠心病风险。对于rs662799，国外研究发现AP0A5启动子区域多态性为冠心病发生的独立危险因素，与其发生存 在强相关性。但目前，国内外还没有公开任何用于检测APOE基因rs7259620和AP0A5基因rs662799单核苷酸多态性(SNP)与冠心病相关程度的试剂盒的相关研究报道。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，提供检测方便、检测准确率高的一种辅助诊断冠心病的检测试剂盒；通过基因引物对样品DNA进行PCR扩增，并建立熔解曲线与标准熔解曲线相比较得出结论，其检测方法简单、高效。
[0006]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:
一种辅助诊断冠心病的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包含用于检测APOE基因rs7259620单核苷酸多态性的APOE基因引物和用于检测AP0A5基因rs662799单核苷酸多态性的AP0A5基因引物；
所述的APOE基因引物为包括以下序列的核苷酸片段:
APOE 基因特异性上游引物一:5’ -gcgggcagggcggcTCACTGTGTGGTTTTGCCATTCg-3’ ； APOE 基因特异性上游引物二:5’ -gcgggcTCACTGTGTGGTTTTGCCATTCa-3’ ；
APOE 基因反向测序引物:5’ -AACCCGTGGTTCAGCAGCAAGA-3’ ；
所述的AP0A5基因引物为包括以下序列的核苷酸片段:
AP0A5 基因特异性上游引物一:5’ -gcgggcagggcggcCCAGGAACTGGAGCGAAAGTg-3’ ； AP0A5 基因特异性上游引物二:5’ -gcgggcCCAGGAACTGGAGCGAAAGTa-3’ ；
AP0A5 基因反向测序引物:5’ -CCCTGCGAGTGGAGTTAGCTT-3’。
[0007]为优化上述技术方案，采取的具体措施还包括:
所述的APOE基因引物为:
APOE 基因特异性上游引物一:5’ -gcgggcagggcggcTCACTGTGTGGTTTTGCCATTCg-3’ ； APOE 基因特异性上游引物二:5’ -gcgggcTCACTGTGTGGTTTTGCCATTCa-3’ ；
APOE 基因反向测序引物:5’ -AACCCGTGGTTCAGCAGCAAGA-3’。
[0008]所述的AP0A5基因引物为:
AP0A5 基因特异性上游引物一:5’ -gcgggcagggcggcCCAGGAACTGGAGCGAAAGTg-3’ ； AP0A5 基因特异性上游引物二:5’ -gcgggcCCAGGAACTGGAGCGAAAGTa-3’ ；
AP0A5 基因反向测序引物:5’ -CCCTGCGAGTGGAGTTAGCTT-3’。
[0009]一种辅助诊断冠心病的检测试剂盒的检测方法:包括以下步骤:
步骤一:对标准样品进行PCR扩增建立标准熔解曲线；
步骤二:用检测试剂盒的APOE基因引物和AP0A5基因对样品DNA进行PCR扩增；步骤三:将步骤二中的PCR扩增产物用荧光定量PCR仪分析熔解曲线，并与步骤一中建立的标准熔解曲线进行比较，对比PCR扩增产物的Tm值，获得相应的基因分型结果。
[0010]所述的步骤二中的APOE基因引物的PCR扩增程序为:95°C初始变性阶段30s ;接着循环进行95°C变性30s，56°C复性30s，72°C延伸30s，共40个循环；最后72°C延伸5min。
[0011]所述的步骤三中APOE基因引物的PCR扩增产物熔解曲线的分析方法为:将APOE基因引物的PCR扩增产物置于荧光定量PCR仪中，95°C变性15s，60°C复性30s，再以0.1re /s的速度上升到95°C，期间连续采集荧光信号，40°C维持；根据荧光强度进行聚类分析获得熔解曲线数据。
[0012]所述的步骤三中APOE基因引物的PCR扩增产物熔解曲线中，熔解温度77±0.5°C的为AA型，熔解温度82±0.5°C的为GG型，熔解温度77±0.5°C和82±0.5°C的为AG型。
[0013]所述的步骤二中的AP0A5基因引物的PCR扩增程序为:所述PCR扩增的扩增程序为:95°C初始变性阶段30s ;接着循环进行95°C变性30s，59°C复性30s，72°C延伸30s，共40个循环；最后72°C延伸5min。[0014]所述的步骤三中AP0A5基因引物的PCR扩增产物熔解曲线的分析方法为:将AP0A5基因引物的PCR扩增产物置于荧光定量PCR仪中，95°C变性15s，60°C复性30s，再以0.1re /s的速度上升到95°C，期间连续采集荧光信号，40°C维持；根据荧光强度进行聚类分析获得熔解曲线数据。
[0015]所述的步骤三中AP0A5基因引物的PCR扩增产物熔解曲线中，熔解温度81±0.5°C的为AA型，熔解温度86±0.5°C的为GG型，熔解温度81 ±0.5°C和86±0.5°C的为AG型。
[0016]与现有技术相比，本发明一种辅助诊断冠心病的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包含用于检测APOE基因rs7259620单核苷酸多态性的APOE基因引物和用于检测AP0A5基因rs662799单核苷酸多态性的AP0A5基因引物，由于APOE基因rs7259620和AP0A5基因rs662799单核苷酸多态性(SNP)与冠心病具有强相关性；
因此通过检测APOE基因rs7259620和AP0A5基因rs662799位点G等位基因，可以预测受试者的冠心病，检测效率高，针对性强，从而能够促进冠心病的早期预防和为用药治疗提供参考。
[0017]本检测方法米用SYBR Green I 的 Melting Temperature shift (Tm_shift)法来检测病例组和对照组基因型。Tm-shift是一种新的基因分型方法，主要通过在两条特异性引物5'端加入不同长度的GC序列，PCR扩增后根据熔解曲线中产物Tm值的差异来完成分型。SYBR Green I是一种在Real-time PCR中使用广泛且成熟的双链DNA(dsDNA)染料。其非特异性地嵌合于双链DNA双螺旋结构中的小沟内，一般不与单链DNA结合，结合状态的荧光强度较之游离状态的荧光增加数千倍。在激发光的作用下发出荧光信号。荧光强度随温度变化，当两条DNA分子复性结合时荧光最强，随温度上升荧光强度降低并出现一较恒定的坡度。当DNA片段在加热过程中达到熔解温度，即达到Tm值时，双链分开，SYBRGreen I从DNA上释放出来，导致荧光信号减弱。经过软件分析可得到熔解曲线图，其波峰所在的温度代表双链DNA分子的Tm值。Tm值的大小取决于DNA分子的长度及其序列中G/C含量。熔解曲线完成后，根据特异性引物的设计，即可获得相应的基因分型结果。判读分型结果时，将HH纯合子与LL纯合子峰值最小差距3°C作为分型判断的依据。为了保证实验的准确度，选取基因型已知的3种不同基因型的样本，在每一块96孔板中放入标准品作为阳性对照，以区分3种基因型的熔解峰。
[0018]Tm-shift法方法简单易行，耗时仅2小时左右，每次可同时检测96个标本，操作简便，是一种既能满足中低通量研究需要又能高性价比完成基因分型的方法。由于实验全程闭管操作，避免了 PCR扩增产物的污染，减少了假阳性结果，准确性高。某一型的引物只与相同型的模板结合才发生PCR扩增反应，从而保证了检测的特异性。
[0019]Tm-shift法的优点在于操作简便，准确度高，重复性好，成本低廉，是在扩增结束后，对PCR扩增产物进行熔解曲线分析的终点分析方法，无需一直进行实时荧光检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为APOE基因rs7259620 Tm-shift法检测基因型的熔解温度曲线；
图2为AP0A5基因rs662799 Tm-shift法检测基因型的熔解温度曲线。
【具体实施方式】[0021]以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0022]一种辅助诊断冠心病的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包含用于检测APOE基因rs7259620单核苷酸多态性的APOE基因引物和用于检测AP0A5基因rs662799单核苷酸多态性的AP0A5基因引物；
所述的APOE基因引物为包括以下序列的核苷酸片段:
APOE 基因特异性上游引物一:5’ -gcgggcagggcggcTCACTGTGTGGTTTTGCCATTCg-3’ ； APOE 基因特异性上游引物二:5’ -gcgggcTCACTGTGTGGTTTTGCCATTCa-3’ ；
APOE 基因反向测序引物:5’ -AACCCGTGGTTCAGCAGCAAGA-3’ ；
所述的AP0A5基因引物为包括以下序列的核苷酸片段:
AP0A5 基因特异性上游引物一:5’ -gcgggcagggcggcCCAGGAACTGGAGCGAAAGTg-3’ ； AP0A5 基因特异性上游引物二:5’ -gcgggcCCAGGAACTGGAGCGAAAGTa-3’ ；
AP0A5 基因反向测序引物:5’ -CCCTGCGAGTGGAGTTAGCTT-3’。
[0023]所述的APOE基因引物为:
APOE 基因特异性上游引物一:5’ -gcgggcagggcggcTCACTGTGTGGTTTTGCCATTCg-3’ ； APOE 基因特异性上游引物二:5’ -gcgggcTCACTGTGTGGTTTTGCCATTCa-3’ ；
APOE 基因反向测序引物:5’ -AACCCGTGGTTCAGCAGCAAGA-3’。
[0024]所述的AP0A5基因引物为:
AP0A5 基因特异性上游引物一:5’ -gcgggcagggcggcCCAGGAACTGGAGCGAAAGTg-3’ ； AP0A5 基因特异性上游引物二:5’ -gcgggcCCAGGAACTGGAGCGAAAGTa-3’ ；
AP0A5 基因反向测序引物:5’ -CCCTGCGAGTGGAGTTAGCTT-3’。
[0025]一种辅助诊断冠心病的检测试剂盒的检测方法:包括以下步骤:
步骤一:对标准样品进行PCR扩增建立标准熔解曲线；
步骤二:用检测试剂盒的APOE基因引物和AP0A5基因对样品DNA进行PCR扩增；步骤三:将步骤二中的PCR扩增产物用荧光定量PCR仪分析熔解曲线，并与步骤一中建立的标准熔解曲线进行比较，对比PCR扩增产物的Tm值，获得相应的基因分型结果。
[0026]所述的步骤二中的APOE基因引物的PCR扩增程序为:95°C初始变性阶段30s ;接着循环进行95°C变性30s，56°C复性30s，72°C延伸30s，共40个循环；最后72°C延伸5min。
[0027]所述的步骤三中APOE基因引物的PCR扩增产物熔解曲线的分析方法为:将APOE基因引物的PCR扩增产物置于荧光定量PCR仪中，95°C变性15s，60°C复性30s，再以0.1re /s的速度上升到95°C，期间连续采集荧光信号，40°C维持；根据荧光强度进行聚类分析获得熔解曲线数据。
[0028]所述的步骤三中APOE基因引物的PCR扩增产物熔解曲线中，熔解温度77±0.5°C的为AA型，熔解温度82±0.5°C的为GG型，熔解温度77±0.5°C和82±0.5°C的为AG型。
[0029]所述的步骤二中的AP0A5基因引物的PCR扩增程序为:所述PCR扩增的扩增程序为:95°C初始变性阶段30s ;接着循环进行95°C变性30s，59°C复性30s，72°C延伸30s，共40个循环；最后72°C延伸5min。
[0030]所述的步骤三中AP0A5基因引物的PCR扩增产物熔解曲线的分析方法为:将AP0A5基因引物的PCR扩增产物置于荧光定量PCR仪中，95°C变性15s，60°C复性30s，再以
0.1re /s的速度上升到95°C，期间连续采集荧光信号，40°C维持；根据荧光强度进行聚类分析获得熔解曲线数据。
[0031]所述的步骤三中AP0A5基因引物的PCR扩增产物熔解曲线中，熔解温度81±0.5°C的为AA型，熔解温度86±0.5°C的为GG型，熔解温度81 ±0.5°C和86±0.5°C的为AG型。
[0032]APOE基因rs7259620和AP0A5基因rs662799单核苷酸多态性(SNP)与冠心病具有强相关性的实验证明:
研究对象的收集:从宁波李惠利医院、宁波鄞州人民医院、浙江杭州第二医院住院病人中收集冠心病患者，共1521例，其中783名男性，738名女性，平均年龄在62岁上下；同时在这些住院病人中收集每条冠状动脉血管狭窄小于50%的病人作为对照组，共738例，其中421名男性，327名女性，平均年龄在58岁上下。所有的参与者都没有心肌梗塞、先天性心脏疾病、肝脏或者肾脏疾病。
[0033]1.血清DNA的提取 应用Lab-Aid 820全自动核酸提取仪(中国厦门致善生物科技有限公司，500ul体系)提取样本的全血基因组DNA，再通过核酸蛋白测定仪检测所得DNA的浓度。
[0034]2.引物设计:根据NCBI dbSNP网站下载的目标SNP rs7259620、rsl800686及rs662799附近序列，设计特异性引物，并在特异性上游引物5'端分别加入富含GC的序
列-14 bp 的长序列(5' - GCGGGCAGGGCGGC-3')和 6bp 的短序列(5' - GCGGGC-3')，
并且在3'末端加入到碱基与SNP的等位基因变异体配对，人为地扩大了 PCR产物Tm值的差距，使产物的Tm值更易区分。
[0035]APOE基因rs7259620引物序列如下:
Tm-shift APOE基因特异性上游引物一，如SEQ ID N0.1，用于检测g等位基因:
5’ - gcgggcagggcggcTCACTGTGTGGTTTTGCCATTCg -3’ ；
Tm-shift APOE基因特异性上游引物二，如SEQ ID N0.2，用于检测a等位基因:
5’ - gcgggcTCACTGTGTGGTTTTGCCATTCa -3’ ；
Tm-shift APOE基因反向测序引物，如SEQ ID N0.3:
5， - AACCCGTGGTTCAGCAGCAAGA -3，。
[0036]AP0A5基因rs662799引物序列如下:
Tm-shift AP0A5基因特异性上游引物一，如SEQ ID N0.7，用于检测g等位基因:
5’ - gcgggcagggcggcCCAGGAACTGGAGCGAAAGTg -3’ ；
Tm-shift AP0A5基因特异性上游引物二，如SEQ ID N0.8，用于检测a等位基因:
5’ - gcgggcCCAGGAACTGGAGCGAAAGTa -3’ ；
Tm-shift AP0A5基因反向测序引物，如SEQ ID N0.9:
5， - CCCTGCGAGTGGAGTTAGCTT -3，。
[0037]3.PCR扩增和熔解曲线分析
(I)建立APOE基因rs7259620 PCR反应体系:总反应体系为12 μ L，两条特异性上游引物和一条反向引物各0.25 μ L (体系中引物含量分别为0.lymol/L)，2yL的基因组DNA(20ng), LightCycler? 480 SYBR Green I Master (包含 FastStart Taq DNA 聚合酶，反应缓冲液，dNTP混合物，SYBR Green I染料，MgCl2) 6 μ L，加高纯水补足至12 μ L。
[0038]建立ΑΡ0Α5基因rs662799 PCR反应体系:总反应体系为12 μ L，两条特异性上游引物和一条反向引物各0.25 μ L (体系中引物含量分别为0.lymol/L)，2yL的基因组DNA(20ng), LightCycler? 480 SYBR Green I Master (包含 FastStart Taq DNA 聚合酶，反应缓冲液，dNTP混合物，SYBR Green I染料，MgCl2) 6 μ L，加高纯水补足至12 μ L。
[0039](2)进行PCR扩增，APOE基因rs7259620扩增程序:95°C初始变性阶段30s ;接着95°C变性30s，56。。复性30s，72。。延伸30s，共40个循环；最后72°C延伸5min，4°C保存。
[0040]AP0A5基因rs662799扩增程序:95°C初始变性阶段30s ;接着95°C变性30s，59°C复性30s，72°C延伸30s，共40个循环；最后72°C延伸5min，4°C保存。
[0041](3)熔解曲线分析:将PCR产物放入Roche Light Cycler 480荧光定量PCR仪中。APOE基因rs7259620和AP0A5基因rs662799熔解曲线程序:95°C变性15s，60°C复性30s，再以0.1l0C /s的速度上升到95°C，期间连续采集荧光信号，40°C维持。熔解曲线数据由Roche提供的机载软件自动根据荧光强度进行聚类分析获得。熔解曲线完成后，对比Tm值，即可获得相应的基因分型结果。为了确保分型的准确性，我们在每一块96孔板中放入标准品作为阳性对照，以区分3种基因型的熔解峰。在我们的实验中，标准品对照的重复性达到了 100%。
[0042]4.数据分析
本次研究采用Arlequin软件(v3.5), CLUMP22软件，在线软件(http://faculty,vassar.edu/lowry/odds2x2.html), R软件对数据进行整理分析。
[0043]为验证上述方法的准确性，随机抽取80个样本进行测序鉴定，结果显示，上述Tm-shift检测结果与测序结果一致。
[0044]实验结果:
1.基因分型结果:
本发明根据Tm值判断基因型，
APOE 基因 rs7259620:LL 纯合子，即 AA:Tm 为 77±0.5 °C ；HH 纯合子，即 GG:Tm 为82±0.50C ;LH 杂合子即 AG，Tm 为 77±0.5°C和 82±0.5°C。
[0045]应用Tm-shift法检测基因型，1521例患者中，GG占了 49.90%(759/1521) ；AG占7 41.42% (630/1521) ；AA 占了 8.68% (132/1521)。
[0046]AP0A5 基因 rs662799:LL 纯合子，即 AA:Tm 为 81 ±0.5°C ；HH 纯合子，即 GG:Tm 为86±0.50C ;LH 杂合子即 AG，Tm 为 81 ±0.5°C和 86±0.5°C。
[0047]应用Tm-shift法检测基因型，1521例患者中，GG占了 9.20%(140/1521) ；AG占了39.71% (604/1521) ；AA 占了 51.08% (777/1521)。
[0048]2.APOE基因rs7259620和AP0A5基因rs662799与冠心病的相关性(P < 0.05即
存在相关性)
APOE基因rs7259620与冠心病的相关性(P < 0.05即存在相关性)
通过对比患者和对照组，我们发现:如表1所示，病例组的APOE基因rs7259620的危险基因G基因明显高于对照组，且其遗传方式为显性遗传。
[0049]表1 rs7259620基因型和等位基因分布结果
【权利要求】
1.一种辅助诊断冠心病的检测试剂盒，其特征是:所述的检测试剂盒包含用于检测APOE基因rs7259620单核苷酸多态性的APOE基因引物和用于检测AP0A5基因rs662799单核苷酸多态性的AP0A5基因引物； 所述的APOE基因引物为包括以下序列的核苷酸片段: APOE 基因特异性上游引物一:5’ -gcgggcagggcggcTCACTGTGTGGTTTTGCCATTCg-3’ ； APOE 基因特异性上游引物二:5’ -gcgggcTCACTGTGTGGTTTTGCCATTCa-3’ ； APOE 基因反向测序引物:5’ -AACCCGTGGTTCAGCAGCAAGA-3’ ； 所述的AP0A5基因引物为包括以下序列的核苷酸片段: AP0A5 基因特异性上游引物一:5’ -gcgggcagggcggcCCAGGAACTGGAGCGAAAGTg-3’ ； AP0A5 基因特异性上游引物二:5’ -gcgggcCCAGGAACTGGAGCGAAAGTa-3’ ； AP0A5 基因反向测序引物:5’ -CCCTGCGAGTGGAGTTAGCTT-3’。
2.根据权利要求1所述的一种辅助诊断冠心病的检测试剂盒，其特征是:所述的APOE基因引物为: APOE 基因特异性上游引物一:5’ -gcgggcagggcggcTCACTGTGTGGTTTTGCCATTCg-3’ ； APOE 基因特异性上游引物二:5’ -gcgggcTCACTGTGTGGTTTTGCCATTCa-3’ ； APOE 基因反向测序引物:5’ -AACCCGTGGTTCAGCAGCAAGA-3’。
3.根据权利要求1所述的一种辅助诊断冠心病的检测试剂盒，其特征是:所述的AP0A5基因引物为: AP0A5 基因特异性上游引物一:5’ -gcgggcagggcggcCCAGGAACTGGAGCGAAAGTg-3’ ； AP0A5 基因特异性上游引物二:5’ -gcgggcCCAGGAACTGGAGCGAAAGTa-3’ ； AP0A5 基因反向测序引物:5’ -CCCTGCGAGTGGAGTTAGCTT-3’。
4.根据权利要求1所述的一种辅助诊断冠心病的检测试剂盒的检测方法:其特征是:包括以下步骤: 步骤一:对标准样品进行PCR扩增建立标准熔解曲线； 步骤二:用检测试剂盒的APOE基因引物和AP0A5基因对样品DNA进行PCR扩增；步骤三:将步骤二中的PCR扩增产物用荧光定量PCR仪分析熔解曲线，并与步骤一中建立的标准熔解曲线进行比较，对比PCR扩增产物的Tm值，获得相应的基因分型结果。
5.根据权利要求4所述的一种辅助诊断冠心病的检测试剂盒的检测方法:其特征是:所述的步骤二中的APOE基因引物的PCR扩增程序为:95°C初始变性阶段30s ;接着循环进行95°C变性30s，56。。复性30s，72。。延伸30s，共40个循环；最后72°C延伸5min。
6.根据权利要求5所述的一种辅助诊断冠心病的检测试剂盒的检测方法:其特征是:所述的步骤三中APOE基因引物的PCR扩增产物熔解曲线的分析方法为:将APOE基因引物的PCR扩增产物置于荧光定量PCR仪中，95°C变性15s，60°C复性30s，再以0.11°C /s的速度上升到95°C，期间连续采集荧光信号，40°C维持；根据荧光强度进行聚类分析获得熔解曲线数据。
7.根据权利要求6所述的一种辅助诊断冠心病的检测试剂盒的检测方法:其特征是:所述的步骤三中APOE基因引物的PCR扩增产物熔解曲线中，熔解温度77±0.5°C的为AA型，熔解温度82±0.5°C的为GG型，熔解温度77±0.5°C和82±0.5°C的为AG型。
8.根据权利要求4所述的一种辅助诊断冠心病的检测试剂盒的检测方法:其特征是:所述的步骤二中的AP0A5基因引物的PCR扩增程序为:所述PCR扩增的扩增程序为:95°C初始变性阶段30s ;接着循环进行95°C变性30s，59°C复性30s，72°C延伸30s，共40个循环；最后72°C延伸5min。
9.根据权利要求8所述的一种辅助诊断冠心病的检测试剂盒的检测方法:其特征是:所述的步骤三中APOA5基因引物的PCR扩增产物熔解曲线的分析方法为:将APOA5基因引物的PCR扩增产物置于荧光定量PCR仪中，95°C变性15s，60°C复性30s，再以0.11°C /s的速度上升到95°C，期间连续采集荧光信号，40°C维持；根据荧光强度进行聚类分析获得熔解曲线数据。
10.根据权利要求9所述的一种辅助诊断冠心病的检测试剂盒的检测方法:其特征是:所述的步骤三中APOA5基因引物的PCR扩增产物熔解曲线中，熔解温度81±0.5°C的为AA型，熔解温度 86±0.5°C的为GG型，熔解温度81 ±0.5°C和86±0.5°C的为AG型。
【文档编号】C12Q1/68GK103898233SQ201410159391
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月18日 优先权日:2014年4月18日
【发明者】叶华丹, 段世伟, 周安楠, 洪青晓, 李奕润 申请人:宁波大学