一种用于扩增鸽细环病毒全基因组序列的背对背引物对及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于扩增鸽细环病毒全基因组序列的背对背引物对。本发明还公开了一种鸽细环病毒全基因组序列的扩增方法。本发明还公开了一种鸽细环病毒的检测试剂盒。本发明还公开了一种鸽细环病毒全基因组序列的扩增方法扩增得到的全基因组序列，所述全基因组序列具有两个主要的ORF，编码Rep复制蛋白的ORF1和编码Cap外壳蛋白的ORF2，ORF1对应第464–923位核苷酸序列，编码154个氨基酸，ORF2对应第788–1189位核苷酸序列，编码134个氨基酸，第1457–1462位核苷酸序列对应polyA序列区。
【专利说明】—种用于扩增鸽细环病毒全基因组序列的背对背引物对及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及病毒检测领域，具体涉及一种用于扩增鸽细环病毒全基因组序列的背对背引物对及其应用。
【背景技术】
[0002]细环病毒(Torque teno virus, TTV)是继甲、乙、丙、丁、戍及庚型肝炎病毒之后又发现的一种新型肝炎相关病毒，最初是由日本学者于1997年运用代表性差异分析(representational difference analysis, RDA)技术从输血后非甲至非戍型肝炎病人血浆中分离鉴定出的一种新病毒，并把该病毒以患者名字命名为TTV，又称输血传播病毒。该病毒在人群中感染率较高，据各国对不同人群TTV感染的流行病学调查发现，人群中TTV阳性率一般在10%以上。TTV宿主范围很广，除人类、非人灵长类和和野生动物外，猪、牛、羊、猫、狗、家禽等多种动物体内也相继发现TTV感染，且该病毒具有种属特异性。由于TTV广泛存在于健康/非健康人或动物体内，其具体的感染机制和生物学意义尚不清楚。
[0003]根据物种不同所报道的TTV基因组长度也不同。感染人和猿的TTV基因组长度在3.7kb - 3.9kb之间，感染猪和狗的TTV基因组长度分别为2.8kb和2.9kb左右，而在猫体内获得的TTV基因组长度约为2.lkb。TTV基因组分为编码区和非编码区(UTR)两个部分，其中UTR特定区域内核苷酸序列较为保守。对于TTV编码区组成的报道不尽相同，有人认为TTV含有4个开放阅读框(open reading frame, 0RF)，也有人认为其含有6个0RF，但是目前研究较多的是已经确定的2个0RF，即ORFl和0RF2，并认为ORFl可能编码病毒的衣壳蛋白(R印)，0RF2可能编码病毒的非结构蛋白(Cap)。
[0004]TTV为单股环状DNA病毒。尽管不同物种TTV基因组长度不同，并且其DNA呈现出高度变异的特点，但是物种间TTV却具有一些相似的基因结构，即:翻译开始于ssDNA，UTR拥有GC含量在90%左右的GC富集区，ORFl和0RF2均具有一小部分的重叠。TTV的4个ORF位于互补的正链上，该病毒可以通过mRNA的剪辑作用产生其他的转录本。研究认为，TTV的ORFl编码病毒复制相关蛋白(Rep蛋白)，0RF2编码最大的核衣壳蛋白(Cap蛋白)。不同物种ORFl编码的蛋白长度不等，但均存在被称作是Rep结构域的滚环复制结构域，并具有与CAV的VPl蛋白相似的N端精氨酸富集区。0RF2的编码蛋白与CAV编码蛋白具有类似的一个氨基酸结构域，并认为该结构域可能与病毒感染细胞期间病毒或细胞蛋白的调节有关。此外，研究认为，Cap蛋白可能会参与机体的先天性免疫应答和获得性免疫应答，这对TTV致病机理的研究有重要意义。
[0005]到目前为止，TTV对宿主的致病性尚不清楚，但有数据显示其和其他病毒共感染会引起一些疾病。2006年kekarainen等研究人员发现TTV和PCV2混合感染能导致仔猪断奶后多系统呼吸综合征(PMWS)的 发生。2008年另有报道TTV能促进PRRS的爆发。2009年Tuijak等对商业化疫苗、药品及实验室常用酶进行猪TTV的检测，结果在猪繁殖与呼吸综合征、猪细小病毒和猪肺炎支原体疫苗等中都检测到TTV的存在。[0006]TTV感染呈全球性分布，在人群以及家畜、家禽等动物中感染率较高。目前鸽养殖现已成为畜牧业中相对独立的新兴产业，世界食品消费市场把肉鸽列为优质肉食。国内市场对乳鸽需求量日益增大，发展鸽养殖潜力巨大，市场前景十分广阔。在我国鸽群细环病毒明显高感染率的背景下，尽快了解鸽细环病毒全基因组序列与其他病毒株的同源性、基因结构和功能以及各分离株之间的遗传变异和进化的关系，对我国鸽市场的稳定发展具有十分重要的现实意义和市场价值。
【发明内容】
[0007] 发明目的:本发明所要解决的第一个技术问题是提供了一种用于扩增鸽细环病毒全基因组序列的背对背引物对。
[0008]本发明所要解决的第二个技术问题是一种鸽细环病毒全基因组序列的扩增方法。
[0009]本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种鸽细环病毒的检测试剂盒。
[0010]技术方案:为实现上述目的，本发明提供的一种用于扩增鸽细环病毒全基因组序列的背对背引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
[0011]一种鸽细环病毒全基因组序列的扩增方法，包括以下步骤:
[0012]1)引物的设计与合成:根据GenBank已发表的人TTV基因序列，使用引物设计软件设计引物；
[0013]2)鴻细环病毒的PCR检测:鴻细环病毒基因组DNA提取,将病毒基因组DNA进行PCR检测获得阳性DNA样品；
[0014]3)以上述的阳性DNA样品为模板，将所述的背对背引物对扩增PTTV全基因组序列得到 PCR 产物:PCR 反应体系为:LA Taql μ L，10XLA PCR Buffer 15 μ L, dNTPMixture8 μ L，模版DNA4 μ L，上游引物Pl和下游引物P2各I μ L，ddH2030 μ L ；PCR反应程序为:95°C预变性5min ;94°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸lmin,40个循环；72°C再延伸8分钟；
[0015]4) PCR扩增产物分析并测序。
[0016]一种鸽细环病毒的检测试剂盒，它包含所述的引物对。
[0017]其中，上述的鸽细环病毒的检测试剂盒，包括:
[0018]1)预混剂A:由核苷酸序列如SEQ ID NO:1的上游引物P115 μ L，核苷酸序列如SEQ ID NO:2 的下游引物 Ρ215μ L，2XPCR pre_mix200 μ L，ddH20100 μ L 组成；
[0019]4)阴性对照:非鸽细环病毒的DNA600 μ L ；
[0020]3)阳性对照:鸽细环病毒基因组DNA600 μ L。
[0021]一种鸽细环病毒全基因组序列的扩增方法扩增得到的全基因组序列，所述全基因组序列具有两个主要的0RF，编码R印复制蛋白的ORFl和编码Cap外壳蛋白的0RF2，ORFl对应第464 - 923位核苷酸序列，编码154个氨基酸，0RF2对应第788 - 1189位核苷酸序列，编码134个氨基酸，第1457 - 1462位核苷酸序列对应polyA序列区。
[0022]有益效果:与现有技术相比，本发明的优点如下:本发明提供的背对背引物对能准确扩增出江苏6个地区的鸽细环病毒的全基因组序列，全基因片段大小约为1585bp，BLAST比对结果证实获得了 6个PTTV全基因序列，将其上传至GenBank数据库，取得了 6个江苏株PTTV全基因序列对应的登录号，序列名称及登录号分别为:NJGC (KF372027)、NJLH(KF477317)、NJPK (KF477318)、NJJN (KF477319)、NTHA (KF477320)和 ZJDY (KF477321)。本发明还对该全基因序列进行了同源性分析，该试剂盒具有较高的特异性和稳定性，构建了进化树，并进而研究其基因结构和功能以及各分离株之间的遗传变异和进化的关系，通过分析得出，不同地区和不同物种的TTV在亲缘关系上表现出明显的分歧。同时本发明的试剂盒检测灵敏度达5pg，是一种快速准确检测鸽细环病毒的方法。因此本试剂盒可以作为快速检测鸽细环病毒的有效工具。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1PTTV全基因序列的同源性分析；
[0024]图2全基因序列系统发育进化树分析；
[0025]图3Rep基因系统发育进化树分析；
[0026]图4Cap基因系统发育进化树分析；
[0027]图5部分阳性病料的PCR鉴定电泳图；
[0028]图6PTTV毒株全基因扩增的PCR产物电泳图。
【具体实施方式】
[0029]实施例1:试剂盒的制备。
[0030]1、病毒及病料的来源和处理
[0031]从江苏的南京浦口、江宁、六合、高淳、南通海安、镇江丹阳的6个鸽场采集到144份血清或组织样品。参见表1
[0032]表1本实验所检测的鸽血清或组织样品
【权利要求】
1.一种用于扩增鸽细环病毒全基因组序列的背对背引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
2.一种鸽细环病毒全基因组序列的扩增方法，其特征在于，包括以下步骤: O引物的设计与合成:根据GenBank已发表的人TTV基因序列，使用引物设计软件设计引物； 2)鸽细环病毒的PCR检测:鸽细环病毒基因组DNA提取，将病毒基因组DNA进行PCR检测获得阳性DNA样品； 3)以上述的阳性DNA样品为模板，将权利要求1所述的背对背引物对扩增PTTV全基因组序列得到 PCR 产物:PCR 反应体系为:LA Taql μ L, IOXLA PCR Buffer 15 μ L, dNTPMixture8 μ L，模版DNA4 μ L，上游引物Pl和下游引物P2各I μ L，ddH2030 μ L ；PCR反应程序为:95°C预变性5min ;94°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸lmin,40个循环；72°C再延伸8分钟； 4)PCR扩增产物分析并测序。
3.一种鸽细环病毒的检测试剂盒，它包含权利要求1所述的引物对。
4.根据权利要求2所述的鸽细环病毒的检测试剂盒，其特征在于包括: 1)预混剂A:由核苷酸序列如SEQ ID NO:1的上游引物P115 μ L，核苷酸序列如SEQ IDNO:2 的下游引物 Ρ215μ L，2XPCR pre-mix200 μ L, ddH20100 μ L 组成； 2)阴性对照:非鸽细环病毒的DNA片段600μ L ; 3)阳性对照:鸽细环病 毒基因组DNA片段600μ L0
5.一种鸽细环病毒全基因组序列的扩增方法扩增得到的全基因组序列，其特征在于，所述全基因组序列具有两个主要的ORF，编码Rep复制蛋白的ORFl和编码Cap外壳蛋白的0RF2，ORFl对应第464 - 923位核苷酸序列，编码154个氨基酸，0RF2对应第788 - 1189位核苷酸序列，编码134个氨 基酸，第1457 - 1462位核苷酸序列对应polyA序列区。
【文档编号】C12N15/10GK103882018SQ201410158964
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年4月18日 优先权日:2014年4月18日
【发明者】张志成, 胡志华, 茅慧华, 戴鼎震 申请人:金陵科技学院