一种烟草腺毛特异性启动子zfp6及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种烟草腺毛特异性启动子ZFP6及其应用，烟草腺毛特异性启动子或其互补链具有如SEQ?ID?NO.3所示的核苷酸序列。本发明还提供了所述的烟草腺毛特异性启动子在烟草腺毛中调控目的基因表达的应用。本发明的ZFP6基因启动子在烟草叶片的腺毛中特异性表达，克服组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异、持续、高效表达所造成的浪费，增加转基因的效果，可利用本发明的启动子在烟草腺毛中表达目的基因，有助于研究腺毛形成和发育的调控机制和腺毛密度的遗传规律，基于腺毛与烟草香气的密切关系，本发明还有助于研究控制烟草腺毛及香气形成的机制，提高烟草叶片香气品质，具有重要的理论意义及潜在的应用价值。
【专利说明】一种烟草腺毛特异性启动子ZFP6及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，尤其涉及一种烟草腺毛特异性启动子ZFP6及其应用。
【背景技术】
[0002]烟草已成为21世纪全球市场上最重要的经济作物之一，它不仅是100多个国家烟农的收入来源，而且整个烟草行业涉及到不同生产部门和批发零售环节，已成为许多国家的重要经济力量；随着烟草业的发展，许多国家的地方及当地政府的税收有了大幅度提高。
[0003]烟草是高效益作物，我国烟草的种植面积和产量均居世界第一位。在所有烟叶类型中，烤烟种植最为广泛。我国是全球生产烤烟最多的国家，我国烤烟种植面积和总产量都居世界首位，其烤烟产量约占全球烤烟产量的50%左右，发展优质烟叶不管是对烟农还是卷烟工业都是十分重要的。烟草又是高税利商品，农业税利30 %左右，工业税利60 %以上，1987-2001年，烟草行业实现的税利合计连续14年高居国民经济各行业之首，为国家建设做出了巨大的贡献。因此，研究和开发综合性状良好的烟草品种，提高烟草的生产水平对于增加国家和地方财政收入，解决“三农”问题和新农村建设具有十分重要的意义。
[0004]烟草育种重点考虑的问题是烟叶香味和烟叶安全性等，提高香气品质是国内外烟草育种的核心之一。烟叶香气不足是影响烟叶质量的一个主要因素，尤其目前低烟碱、低焦油的烟草产业发展方向，使得烟叶香味不足的问题更为突出。烟草腺毛是烟叶表皮系统的重要组成部分，烟叶 腺毛胶状分泌物与烟叶香气物质产生密切相关，而腺毛密度和类型直接影响着腺毛分泌物的质和量，而分泌物的量又直接影响叶片的香气品质，腺毛密度越大，多细胞头部的腺毛所占比例越大，叶片香气品质越好(烟草叶片腺毛及其分泌物研究进展.贵州农业科学，2009，37(8):61~64)。。因此，烟叶腺毛的研究对烟草新品种的选育和优质烟草栽培技术的实施，以及提高烟草香气质和香气量的研究都具有重要的指导意义。目前国内外虽然已在烟草腺毛方面进行了大量研究，但对腺毛形成和发育的调控机制和腺毛密度的遗传规律，特别是在腺毛与烟草香气形成之间关系的研究方面还远远不够，因此，从分子水平上研究控制烟草腺毛及香气形成的机制，不仅具有重要的理论意义，同时也具有潜在的应用价值。
[0005]通过基因工程的方法在烟草中研究控制腺毛形成、发育及香气相关等的基因，是有效且最常用的手段，通常涉及到外源基因的表达，而外源基因表达的则由启动子调控，启动子通常分为组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子。组成型启动子能够在大部分或所有植物组织中高效非特异的启动外源基因表达，但大量的异源蛋白会使植物体内原有的代谢平衡紊乱，使植物的正常生长受到阻碍。
【发明内容】
[0006]本发明提供了一种烟草腺毛特异性启动子，该启动子能够在烟草叶片的腺毛中特异性表达。[0007]—种烟草腺毛特异性启动子，所述烟草腺毛特异性启动子或其互补链具有如SEQID N0.3所示的核苷酸序列。
[0008]本发明还提供了一种包含所述的烟草腺毛特异性启动子的重组质粒。
[0009] 所述重组质粒的原始质粒载体可以为pHGWFS7。
[0010]本发明还提供了一种包含所述重组质粒的重组转化子。
[0011]本发明还提供了所述的烟草腺毛特异性启动子在烟草腺毛中调控目的基因表达的应用。
[0012]所述的应用具体包括:利用所述的烟草腺毛特异性启动子构建植物表达载体，然后将目的基因连入所述植物表达载体中烟草腺毛特异性启动子的下游，得到重组植物表达载体，再将所述的重组植物表达载体转化烟草。
[0013]植物表达载体、重组植物表达载体的构建可采用常规方法，如可采用gateway系统(InvitiOgen公司)将启动子、目的基因连入相应的载体中。其中，所述的植物表达载体的原始载体可以为PHGWFS7，所述的目的基因并不仅限于GUS基因，所述的目的基因可以根据具体需要进行选择，转化烟草时，可采用常规手段，如可采用农杆菌介导转化的方法将重组植物表达载体转入烟草中，农杆菌可以为农杆菌GV3101，EHA105等。在转基因烟草中，本发明的启动子可驱动目的基因在烟草叶片的腺毛中进行表达。当然，所述的烟草可以为珊西烟，但并不仅限于珊西烟。
[0014]与现有技术相比，本发明的有益效果为:
[0015]本发明的启动子在烟草叶片的腺毛中特异性表达，克服组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异、持续、高效表达所造成的浪费，增加转基因的效果，可利用本发明的启动子在烟草腺毛中表达目的基因，有助于研究腺毛形成和发育的调控机制和腺毛密度的遗传规律，基于腺毛与烟草香气的密切关系，本发明还有助于研究控制烟草腺毛及香气形成的机制，提高烟草叶片香气品质，具有重要的理论意义及潜在的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为野生型和转基因烟草叶片⑶S染色结果；
[0017]其中，A、B为转基因烟草，C、D为野生型烟草。
【具体实施方式】
[0018]下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。
[0019]实施例1ZFP6基因启动子融合GUS报告基因载体构建和烟草遗传转化
[0020](I)取拟南芥叶片，利用CTAB法提取基因组DNA.[0021](2)根据Genbank上的拟南芥ZFP6基因转录起始位点上游序列设计特异引物，分另Ij在引物5'端加上Sal I和Not I限制性酶切位点，序列如下:
[0022]引物1:5 ' -AGTCGACTGCAACGTAAAAGGTCCTGA-3 ' ；
[0023]引物2:5 ' -AAGCGGCCGCCAAAGAGAGAGAGAGAGACAGATTT-3 '。
[0024](3 )以提取的DNA为模板进行PCR扩增.[0025]米用高保真酶PrimeSTAR? HS DNA Polymerase (TaKaRa Code:DR010A)体系:
[0026]5 X PrimeSTAR Buffer (Mg2+plus) 10 μ 1，[0027]dNTP Mixture (各 2.5mM) 4 μ I,
[0028]引物I (10 μ Μ) I μ 1，
[0029]引物2 (10 μ Μ) I μ 1，
[0030]模板DNAl μ 1，
[0031]PrimeSTAR其 HS DNA Polymerase0.5 μ 1，
[0032] 灭菌蒸馏水加至总体积50 μ I。
[0033]PCR循环条件为:98°C预变性5分钟，98°C变性10秒，55°C退火15秒，72°C延伸2分钟，扩增30个循环，最后72°C延伸10分钟，结束反应。
[0034](4)将PCR产物回收后通过酶切连接到Gateway克隆系统(本申请采用Invitrogen公司的Gateway系统)入门载体pENTRlA，转化大肠杆菌DH5 α，测序并分析，ZFP6基因启动子序列如SEQ ID N0.3所示。
[0035](5)将测序正确的含ZFP6基因启动子的pENTRlA质粒与启动子分析载体pHGWFS7进行LR交换反应。
[0036]使用Gateway LR Clonase TM Enzyme Mix(Invitrogen公司，Cat.N0.11791-019),体系如下:Entry clone (入门载体)50_150ng, Destination vector (目的载体)150ng,5XLR Clonase Reaction Buffer2 μ I,补充 ddH20 至 8 μ I,加入 2 μ I LR Clonase enzymemix,短暂润旋两次混匀，轻微离心，于25°C水浴8h,然后加入I μ I Proteinase K solution(蛋白酶K溶液)混匀，37°C放置10分钟结束反应。
[0037]取5 μ I反应产物转化大肠杆菌DH5 α，挑取PCR验证阳性克隆培养后提取质粒进行双酶切验证。
[0038](6)从_80°C冰箱中取出EHA105感受态细胞，利用电击法转化农杆菌EHA105。
[0039]感受态细胞置于冰上解冻，取2 μ I左右的目的质粒加到感受态细胞中，混匀后置于冰上30min，再将离心管内的所有混合物加到预冷的电击杯内，冰上放置。打开伯乐电转仪，程序调至Agr，吸取Iml的LB液体营养基，将电击杯凸点朝内推入电转仪，按一下plus键，听到蜂鸣声，迅速拿出电击杯，并向电击杯杯加入1ml的LB液体营养基,重悬细胞,转移至1.5ml的离心管内，放在eppendorf混合仪内28°C, 700rpm摇2.5h以上,涂布于抗性YEP平板上(Rif (利福平)50mg/L，Spec (盐酸大观霉素)100mg/L)，28°C倒置培养2个晚上以至长出单菌落。
[0040](7)挑取长出的农杆菌单克隆，到含有相应抗生素的5mL YEP液体培养基中(相为Rif50mg/L spec100mg/L),28°C 150rpm振荡培养48小时。将摇的菌按体积比1:10加入YEP液体培养基(含相应抗生素)28 0C，培养至0D600>1。
[0041](8)将摇好的菌做烟草叶片浸染:
[0042]I) MS液体培养基(PH7.0)将菌液稀释10倍(2mL菌液+18mL MS溶液)；
[0043]2)利用无菌的烟草(品种为珊西烟)组培苗。无菌的烟草叶片切去边缘和主要叶脉，切成0.5X0.5cm2大小；
[0044]3)切好的外植体在农杆菌菌液中浸泡5min ；
[0045]4)用无菌滤纸吸干外植体表面菌液，转入上铺一层滤纸的MS培养基，25°C暗培养3天；
[0046]5)三天后，将材料转到适当选择后的分化培养基(MS基本培养基+2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA)中进行光照培养，温度25°C ±2°C，光周期14hr光照/8hr光照；
[0047]6)待生长至2_3cm高时，切下小芽转入适当筛选的生根培养基中诱导生根(基本MS hpt (潮霉素)35mg/L+cef (头孢霉素)250mg/L)；
[0048]7)根长至IOcm以上(约四周)，且具有一定数量即可去掉封口膜，在组培室中锻炼2-3天，然后移栽到花盆中，在室温生长2-3周，最后移栽至田间种植。当移到土里的烟草苗生长约20d后，取烟草叶片提取DNA，通过PCR方法检测转基因植株。
[0049]实施例2转基因烟草的性状观察
[0050]烟草的表皮毛按有无分泌腺分成两大类，一是能产生分泌物的腺毛，二是不具有分泌能力的保护毛，其中腺毛又根据形态分为长柄腺毛和短柄腺毛。
[0051]将实施例1获得的转基因烟草，进行组织化学染色(GUS染色)分析，结果如图1所示，将60天龄期的烟 草叶片进行GUS染色后，本发明的启动子(A，B)在烟草叶片的腺毛中特异表达(腺毛表现为蓝色)，而对照(C，D)无显色反应，表明本发明的启动子在烟草腺毛中有活性，是烟草腺毛特异表达的启动子。
【权利要求】
1.一种烟草腺毛特异性启动子，其特征在于，所述烟草腺毛特异性启动子或其互补链具有如SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列。
2.一种包含如权利要求1所述的烟草腺毛特异性启动子的重组质粒。
3.如权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，原始质粒载体为PHGWFS7。
4.一种包含如权利要求2或3所述的重组质粒的重组转化子。
5.一种如权利要求1所述的烟草腺毛特异性启动子在烟草腺毛中调控目的基因表达的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的应用包括:利用所述的烟草腺毛特异性启动子构建植物表达载体，然后将目的基因连入所述植物表达载体中烟草腺毛特异性启动子的下游，得到重组植物表达载体，再将所述的重组植物表达载体转化烟草。
7.如权利要求6所述 的应用，其特征在于，所述的植物表达载体的原始载体为PHGWFS7。
【文档编号】C12N15/113GK103966216SQ201410158786
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年4月18日 优先权日:2014年4月18日
【发明者】甘银波, 颜安, 孟小芳, 安丽君, 周忠静, 赵永钦, 刘一华 申请人:浙江大学