一种用于检测HoBi样瘟病毒核苷酸片段的引物序列的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于检测HoBi样瘟病毒（HoBi-likepestivirus）核苷酸片段的引物序列，属于动物病原微生物检测【技术领域】。引物对包括：由序列为TGGTTCGACGCATTAAGGAAT的上游引物HoBi-F和序列为TCTCTGCAGCACCCTATCAG的下游引物HoBi-R组成的引物对。该套引物序列根据GenBank上HoBi样瘟病毒5′-UTR基因序列设计，具有较高的灵敏度和特异性。
【专利说明】—种用于检测HoBi样瘟病毒核苷酸片段的引物序列
【技术领域】
[0001]本发明属于动物病原微生物检测【技术领域】。具体涉及一种用于检测HoBi样瘟病毒核苷酸片段的引物序列。
【背景技术】
[0002]HoBi 样痕病毒(HoB1-like pestivirus)与牛病毒性腹?写病毒 I 型(bovine viraldiarrhea virus, BVDV-1)和 2 型(BVDV-2),边界病病毒(Border disease virus, BDV),猪痕病毒(Classical swine fever virus, CSFV)和野生反会动物痕病毒(Pestivirus ofgiraffe)同属于黄病毒科，瘟病毒属，为一类具有囊膜的单股正链RNA病毒。其基因组约12.5kb，具有一个大的阅读框，编码一个多聚蛋白，在病毒或宿主细胞的酶切作用下，加工为12个结构蛋白和非结构蛋白。[0003]2004 年，Schirrmeier 等从来源于巴西的胎牛血清(Foetal calf serum, FCS)中分尚到一种非典型痕病毒属病毒D32/00_ ‘Hobi’株,从遗传特性分析发现这株新的病毒与BVDV-1和BVDV-2亲缘关系较近，但是并不在一个分支上，可能是黄病毒科瘟病毒属的一个新的病毒种，命名为HoBi样瘟病毒，现有报道也将其称之为BVDV-3。意大利、泰国和巴西等国都从病牛中分离到HoBi样瘟病毒，此外，美国，德国和瑞士数次从商品化FCS中检测到HoBi样瘟病毒，这些血清的来源包括美国、澳大利亚、加拿大、墨西哥和巴西。自然感染宿主目前见于报道的仅限于牛，主要症状包括腹泻、流产和呼吸道疾病。
[0004]到目前为止，人们对牛HoBi样瘟病毒在世界各地的存在于流行情况所知甚少。我国于2012年发现了 HoBi样瘟病毒JS12/01株，根据进化树显示与巴西来源型毒株在一个分支上(Mao L, et al.Genome sequence of a novel hob1-like pestivirus in china.JVirol.2012)。而且，JS12/01毒株与二株意大利分尚的HoBi样病毒毒株Italy-83/lO-ncp、Italy-83/lO-cp和Italy-l/10_lJS12/01毒株亲缘关系极近，而这三株毒株都是从临床感染发病牛体内分离到的。因此，HoBi样瘟病毒是否也可能在国内引起动物致病，正在成为执占。
[0005]基于以上研究， 申请人:根据国内和国外研究者登录在GenBank中HoBi样瘟病毒的基因序列(毒株名称(登录号)，JS12/01 (JX469119)，Th/04_KhonKae (FJ040215)、Italy-1/10-1 (HQ231763)、Italy-83/lO-ncp (JQ612704)、Italy-83/lO-cp (JQ612705)、D32/00_HoBi (AY489116S)、Australia_l (HQ403054)、IZSPLV_To (HM151361)、Italy-280/11-A (JN703311)、SVA/cont-08 (FJ232692))，设计了用于检测 HoBi 样瘟病毒核苷酸片段的引物。
【发明内容】
[0006]技术问题
[0007]本发明的目的是提供一种用于检测HoBi样瘟病毒核苷酸片段的引物序列。
[0008]技术方案[0009]本发明采用以下技术方案:
[0010]一种用于检测HoBi样瘟病毒核苷酸片段的引物，其特征在于，所述的引物为:上游引物 HoB1-F:TGGTTCGACGCATTAAGGAAT ；
[0011]下游引物HoB1-R:TCTCTGCAGCACCCTATCAG。
[0012]所述引物对序列用于检测HoBi样瘟病毒核苷酸片段的方法，包括:
[0013]I)待测模板的制备:取200 μ I血清；或取IOOmg组织样品，加入1mlPBS缓冲液进行充分研磨，_20°C反复冻融3次，8000rpm离心10分钟，取上清液200 μ I。加入1mlTRizol，混合均匀后静置15分钟，按ImlTRizol加入200 μ I氯仿，静置5分钟，12000rpm离心15分钟，取上层水相，加等量体积异丙醇，轻轻混匀，-20°C静置2小时，12000rpm离心15分钟，弃去上清，加入1ml无水乙醇于_20°C放置I小时，12000rpm离心10分钟,弃去上清,沉淀于干燥箱干燥后用20 μ I无RNase水溶解,即为检测用RNA模板；
[0014]2) HoBi样瘟病毒实时荧光PCR反应的扩增条件:
[0015]
【权利要求】
1.一种用于检测HoBi样瘟病毒核苷酸片段的引物序列，其特征在于，所述的引物为:
上游引物 HoB1-F: TGGTTCGACGCATTAAGGAAT 下游引物 HoB1-R:TCTCTGCAGCACCCTATCAG。
2.含有权利要求1所述用于检测HoBi样瘟病毒核苷酸片段引物序列的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其用于检测HoBi样瘟病毒核苷酸片段的方法包括: 1)待测模板的制备:取200μ l血清；或取100 mg组织样品，加入1 ml PBS缓冲液进行充分研磨，_20°C反复冻融3次,8000 rpm尚心10分钟，取上清液200 μ l, 加入1 ml TRizol，混合均匀后静置15分钟，按1ml TRizol加入200 μ l氯仿，静置5分钟，12000 rpm离心15分钟，取上层水相，加等量体积异丙醇，轻轻混匀，_20°C静置2小时，12000 rpm离心15分钟，弃去上清，加入1ml无水乙醇于_20°C放置I小时，12000 rpm离心10分钟,弃去上清,沉淀于干燥箱干燥后用20 μ l无RNase水溶解，即为检测用RNA模板； 2)HoBi样瘟病毒实时荧光PCR反应的扩增条件: 组分用量/终浓度 2X Buffer IX
One-step RT/RI Enzyme Mix 0.4 μ L 引物0.4ymol/L each
Dye 50 X 0.4 μ L 模板 2 μ L 无RNase水补足至25 μ L 将加好样品的PCR管放置荧光PCR仪中进行扩增，反应程序如下:45°C，5分钟，反转录；94°C，30秒预变性；94°C，5秒，60°C 30秒，40个循环；试验结果实时监测； 3)HoBi样瘟病毒实时荧光PCR的检测结果判定:经检测，若待检样品中含有HoBi样瘟病毒则显示阳性扩增曲线；若待检样品中不含有HoBi样瘟病毒则无扩增信号。
【文档编号】C12Q1/68GK103924006SQ201410161529
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月21日 优先权日:2014年4月21日
【发明者】毛立, 李文良, 江杰元, 杨蕾蕾, 李彬, 张纹纹, 刘霞, 邓加武, 王钟毓 申请人:江苏省农业科学院