一种利用丛枝菌根真菌强化龙葵吸收土壤中镉的方法
【专利摘要】本发明提供了一种丛枝菌根真菌（AMF）在提高龙葵生长和吸收土壤中重金属的能力中的应用和一种利用丛枝菌根真菌强化龙葵吸收土壤中镉的方法。本发明以镉（Cd）超累积植物龙葵为实验植物，以AMF为接种剂，将Cd超累积植物龙葵和具有提高植物生长的AMF结合在一起，AMF能够提高龙葵生长和吸收土壤Cd的能力，从而提高龙葵对Cd污染土壤的修复效率。与传统的化学与农业措施相比，本发明强化措施具有治理效果好、无二次污染、运行成本低等特点，具有很好的理论和应用推广价值。
【专利说明】一种利用丛枝菌根真菌强化龙葵吸收土壤中镉的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于土壤污染修复【技术领域】。更具体地，涉及一种利用丛枝菌根真菌强化龙葵吸收土壤中镉的方法。
【背景技术】
[0002]镉是一种移动性、积累性很强的高毒性重金属，对植物体没有明确的生理功能，也是危害人体健康的常见污染物之一。当土壤等环境受到镉污染后，镉可在生物体内富集，通过食物链进入人体引起慢性中毒。镉被人体吸收后，在体内形成镉硫蛋白，选择性地蓄积在肝、肾中。其中，肾脏可吸收进入体内近1/3的镉，是镉中毒的“靶器官”。其它脏器如脾、胰、甲状腺和毛发等也有一定量的蓄积。由于镉损伤肾小管，患病者出现糖尿、蛋白尿和氨基酸尿。特别是使骨骼的代谢受阻，造成骨质疏松、萎缩、变形等一系列症状。
[0003]目前，我国农田土壤镉污染面积已超过2.0X 105hm2，每年镉含量超标的农产品达1.46X 109kg。因此，对土壤中镉含量的检测和修复治理研究已十分必要，受到了研究者的重视。
[0004]自魏树和等2005年发现镉(Cd)能够在植物龙葵(5b7a/w? nigrum)中超累积后，利用龙葵修复Cd污染土壤的理论和应用研究已成为热点。为了提高龙葵的修复效率，人们提出了多种强化龙葵吸收土壤Cd的措施。例如，通过添加化学鳌合剂ETDA、EGTA和DPTA等，增加土壤Cd的生物有效性，从而提高龙葵吸收土壤Cd的效率(魏树和等，2011)。但这些化学试剂的应用可能会有一些潜在的环境危害，主要问题包括螯合剂对植物的毒性效应，加速重金属溶解导致重金属从表层向地下水渗透，对深层土壤或地下水源造成污染，毒害土壤中微生物和动物，对土壤生态系统稳定性和功能造成负面影响。
[0005]近年来，重金属污染土壤的植物一微生物联合修复作为一种强化植物修复的技术逐渐成为国内外研究的热点。这种修复方法利用土壤一微生物一植物的共存关系，充分发挥植物与微生物修复技术的各自优势，互补不足，进而提高土壤中污染物的修复效率。与传统的化学与农业措施相比，微生物强化措施具有治理效果好、无二次污染、运行成本低等特点。如有研究表明接种细菌能够促进龙葵的生长和Cd吸收能力(Chen等，2010)。
[0006]另 外，由于在各类与植物共生的微生物中，菌根真菌是唯一能直接联系土壤与植物根系的一类土壤微生物，在植物矿质营养与逆境生理中起着非常重要的作用，受到了研究者们的重视。研究显示，土壤中的丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,简称AMF)能够与高等植物营养根系形成丛枝菌根(abuscular mycorrhiza, AM),促进宿主对土壤中矿质元素P、N、K、Cu等的吸收，提高宿主根系对根部侵染病菌的抵抗能力和增强植物对干旱、高温、高盐和重金属的抗性，在植物生长发育中起着重要作用。Marques等(2007)研究表明，接种丛枝菌根真菌后，龙葵体内Zn浓度虽然略有增加，但龙葵的生长和生物量没有受到影响，因此接种AMF的龙葵的Zn吸收量与未接种比较没有明显的提高，即通过植物接种AMF的方式并不一定能够实现对所有重金属的强化吸收；同时，强化的步骤、方法和具体条件之间相互制约相互影响，对最终强化效果的影响是复杂且至关重要的。至今还没有关于AMF能否强化龙葵吸收土壤Cd能力的研究和应用报道。
【发明内容】
[0007]本发明要解决的技术问题是克服现有龙葵吸收土壤Cd能力强化技术的不足，提供一种利用丛枝菌根真菌强化龙葵吸收土壤中镉的方法。
[0008]本发明的目的是提供一种丛枝菌根真菌在提高龙葵生长和吸收土壤中镉的能力中的应用。
[0009]本发明另一目的是一种利用丛枝菌根真菌强化龙葵吸收土壤中镉的方法。
[0010]本发明上述目的通过以下技术方案实现:
本发明提供了一种丛枝菌根真菌(AMF)在提高龙葵生长和吸收土壤中重金属的能力中的应用。
[0011]优选地,所述丛枝菌根真菌为地表球囊霉rersi/br-- BGC⑶01C)。所述
重金属为镉。
[0012]本发明还提供了一种利用上述丛枝菌根真菌强化龙葵吸收土壤中镉的方法，步骤如下:
51.制备丛枝菌根真菌菌剂； 52.龙葵种子发芽，得龙葵幼苗；
53.按照质量比为3~5%的接种量将丛枝菌根真菌菌剂与土壤混合均匀，移栽龙葵幼
苗；
54.将S3处理过的龙葵幼苗移栽到镉污染土壤中。
[0013]其中，步骤SI所述制备丛枝菌根真菌菌剂的具体步骤如下:
511.按照质量比为I~3%的接种量将丛枝菌根真菌接种剂与灭菌的沙土混合均匀，然后将混合基质装至无菌盆的2/3~4/5 ;
512.播种玉米种子后，再覆盖一层0.5cm的灭菌沙土培养基，温室培养；
513.盆栽培养4~5个月后，剪去玉米植株地上部分的全部茎叶，将盆置于室内干燥I~2周，收获盆中所有培养物；
514.将盆中培养物倒在无菌纸上，用消毒的工具将其剁碎后，转移入无菌袋中，封袋冷藏。
[0014]优选地，Sll或S12所述的沙土培养基是沙与土的质量比为1:1。
[0015]优选地，S13所述的室内的温度保持在18~30°C，湿度保持在70~85%。
[0016]优选地，S13所述的所有培养物包括植物根系、菌丝、孢子和培养基。
[0017]优选地，S14是将3层无菌纸覆盖在70%酒精擦拭消毒的桌面上，将盆中培养物倒在无菌纸上，用火焰消毒的工具将其剁碎后，卷起两层纸将剁碎了的培养物转移入无菌袋中，封袋，再在外面套一个相同的塑料袋，冷藏。
[0018]另外，步骤S2所述的龙葵种子需先用10%的NaClO进行表面消毒10~15min后，去离子水洗净，再放入超纯水中浸泡4~6 h ;所述发芽的条件是将浸泡后的种子放入垫有滤纸的无菌培养皿中，置于28°C室温内培养。
[0019]步骤S3是选取长势一致的5~7天苗龄的龙葵幼苗，移栽到接种有质量比为3~5%的丛枝菌根真菌菌剂的土壤中，培养70~80天。[0020]本发明以AMF为接种剂，将植物龙葵和具有提高植物生长的AMF结合在一起，提高龙葵生长和对土壤重金属的吸收能力，从而提高重金属污染土壤的修复效率，尤其是对土壤Cd的吸收能力。发明人经过大量的探索和重复验证发现，接种AMF后的龙葵对Cd的吸收能力明显增强，对Cd的吸收效果特别好。与龙葵本身相比较，AMF-龙葵共生体对Cd吸收量的增幅可达230%，克服了龙葵本身对土壤Cd吸收的限制，同时克服了传统的化学应用措施可能存在的一些潜在的环境危害，主要问题包括螯合剂对植物的毒性效应，快速重金属溶解导致重金属从表层向地下水渗透，毒害土壤中微生物和动物，对土壤生态系统稳定性和功能造成负面影响。
[0021]在AMF-龙葵共生体中，大量延伸到土壤中的根外菌丝扩大了根系的吸收面积，改善龙葵的矿质营养状况，尤其是P素营养，从而促进龙葵生长，增加生物量尤其是地上部生物量。
[0022]同时，AMF提高了龙葵的还原型谷胱甘肽(Glutathione, GSH)、抗坏血酸(Ascorbate, AsA)等非酶抗氧化保护物质和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,S0D)、过氧化物酶(Peroxidase，P0D)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)和谷胱甘肽还原酶(GR)等抗氧化保护酶的抗氧化作用，从而降低了 Cd对龙葵的毒害。
[0023]另外，AMF提高了土壤中有效态Cd浓度，提高龙葵吸收Cd的能力，从而增加了龙葵体内Cd浓度。
[0024]本发明具有以下有益效果:
本发明提供了一种利用丛枝菌根真菌强化龙葵吸收土壤中镉的方法。以镉(Cd)超累积植物龙葵为实验植物，以AMF为接种剂，将Cd超累积植物龙葵和具有提高植物生长和Cd耐性的AMF结合在一起，通过AMF提高龙葵生长和吸收土壤Cd的能力，从而提高龙葵对Cd污染土壤的修复效率。
[0025]本发明所述修复方法利用土壤-微生物-植物的共存关系，充分发挥植物与微生物修复技术各自优势，弥补不足，进而提高土壤中污染物的修复效率。在AMF-龙葵共生体中，大量延伸到土壤中的根外菌丝扩大了根系的吸收面积，改善龙葵的矿质营养状况，尤其是P素营养，从而促进龙葵生长，增加生物量尤其是地上部生物量。同时，AMF提高了龙葵的还原型谷胱甘肽(Glutathione, GSH)、抗坏血酸(Ascorbate, AsA)等非酶抗氧化保护物质和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, S0D)、过氧化物酶(Peroxidase, POD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)和谷胱甘肽还原酶(GR)等抗氧化保护酶的抗氧化作用，从而降低了 Cd对龙葵的毒害。另外，AMF提高了土壤中有效态Cd浓度，提高龙葵吸收Cd的能力，从而增加了龙葵体内Cd浓度。
[0026]与传统的化学与农业措施相比，本发明强化龙葵吸收土壤中镉的措施具有治理效果好、无二次污染、运行成本低等特点，具有很好的理论和应用推广价值。
【具体实施方式】
[0027]以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本【技术领域】常规试剂、方法和设备。
[0028]除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
[0029]丛枝菌根真菌(AMF):地表球囊霉(67 OfiMAs versi forme BGC⑶01C)由北京市农林科学院植物营养与资源研究所提供。
[0030]接种时，AMF菌剂与土壤配比为质量比。
[0031]实施例1制备丛枝菌根真菌菌剂
丛枝菌根真菌versi forme由北京市农林科学院植物营养与资源研究所提供。利用玉米(為<3 may作为宿主植物进行盆栽扩繁后，将含有宿主植物根段、真菌菌丝、菌根真菌孢子和盆栽土壤的混合物作为接种菌剂。
[0032]具体制备过程如下:
S1.按照质量比为3%的接种量将丛枝菌根真菌接种剂与灭菌的沙土混合均匀，然后将混合基质装至无菌盆的2/3 ；
所述沙土的沙:土 =1:1 ;所述丛枝菌根真菌接种剂由北京市农林科学院植物营养与资源研究所提供。
[0033]S2.播种玉米种子10?15粒/盆，再覆盖一层0.5cm的灭菌沙土培养基，温室培养;
53.盆栽培养4?5个月后，剪去玉米植株地上部分的全部茎叶，将盆置于室内干燥I?2周，收获盆中所有培养物(包括植物根系、菌丝、孢子和培养基)；
所述的室内的温度保持在18?30°C，湿度保持在70?85% ；
54.将盆中培养物倒在无菌纸上，用消毒的工具将其剁碎后即得到丛枝菌根真菌(AMF)菌剂,转移入无菌袋中,封袋冷藏。
[0034]S4.将3层无菌纸覆盖在70%酒精擦拭消毒的桌面上，将盆中培养物倒在无菌纸上，用火焰消毒的短柄斧将其剁碎后，用两张纸卷起剁碎了的培养物，纸筒的一端插入预先准备的能封口的干净塑料袋中，当所有的培养物都转移入袋中后，轻轻取出纸，封上袋，再在外面套一个相同的塑料袋，然后放置在4°C冰箱中保藏。
[0035]操作过程中的任何时候都不要让手接触到一点盆栽培养物，保证制备过程不受任何杂菌的污染。
[0036]实施例2丛枝菌根真菌强化龙葵吸收土壤中镉的研究
1、实验材料
(I)供试植物龙葵
供试植物龙葵播种前用10%的NaClO对种子进行表面消毒IOmin,去离子水洗净，将洗净的龙葵种子放入超纯水中浸泡4?6h，等种子充分膨胀后放入垫有滤纸的无菌培养皿中，置于28°C室温内，待种子发芽后，选取长势一致的幼苗备用。
[0037](2 )供试土壤，采自华南师范大学生物园，将土壤经自然风干后磨碎，过1_筛后，连续高温高压蒸汽灭菌2h( 121°C )，分别加入不同浓度的CdCl2,使Cd浓度达到25mg/kg和50mg/kgo为了让土壤中CM分布均勻且稳定,加去离子水浸润一周后风干两周,循环两次。
[0038]2、实验设计
(I)试验盆为容量800g 土的塑料花盆(上口直径115mm、下口直径95mm、高150mm)。
[0039]三个土壤重金属Cd浓度分别为:0mg/kg、25mg/kg、50mg/kg。
[0040](2)试验分为接种实验组和不接种对照组两种处理。
[0041]按3%的接种量(质量比)将实施例1制备的AMF菌剂与土壤均匀混合后装盆，对照组混入等量的灭菌(121 °C，2h )的AMF菌剂。[0042]每盆移栽6株生长状况良好并且生长状况一致的龙葵幼苗，每个处理重复三次。将盆栽随机摆放在温室中进行培养，光照14h，温度为22°C~28°C，每两天浇一次无菌水。一周后将每盆龙葵筛减至3株。培养十周后收获植物。
[0043]3、丛枝菌根真菌浸染率的测定 测定方法如下:
51.用蒸馏水将龙葵根洗净，剪成约ICm长的小段，放入15%的KOH溶液中，90°C恒温水浴30min，用蒸馏水轻轻漂洗根样；
52.用10%的H2O2漂白30min，用蒸馏水冲洗；
53.再将根浸入1%的HCl溶液中静置3min，用蒸馏水洗去HCl溶液后，加入0.05%的Trypanblue (TB)染液，90°C水浴下染色 30min ；
54.染色后，用酸性甘油(乳酸:甘油=1:1)洗去根的浮色，随机挑取50条根段于显微镜下观察侵染情况。
[0044]参照Trouvelot等(1986)的方法计算AMF侵染强度。结果如表1所示。
[0045]4、龙葵生物量的测定
将植物收获后，用去离子水冲洗干净，分开植物地上和地下部分，置于80°C烘箱中72h至恒重,称干重。
[0046]测定结果如表1所示。
[0047]5、植物体磷含量的测定
将龙葵植株根、茎、叶各部分用清水洗干净，然后放入烘箱内75°C烘干48h，直至恒重。分别称取烘干的根、茎、叶各部分，用硫酸-过氧化氢进行消化，冷却稀释后，采用钥锑抗分光光度法测定其磷(P)含量。
[0048]测定结果如表1所示。
[0049]6、土壤酸性磷酸酶含量的测定
参照沈桂琴的方法(沈桂琴.土壤中磷酸酶活性的测定方法.中国农科院土肥所)。
[0050]测定结果如表1所示。
[0051]表1 AMF对龙葵生物量、P含量及土壤磷酸酶的影响
【权利要求】
1.一种丛枝菌根真菌在提高龙葵生长和吸收土壤中重金属的能力中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述丛枝菌根真菌为地表球囊霉versiforme BGC GDO 1C)。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重金属为镉。
4.一种利用丛枝菌根真菌强化龙葵吸收土壤中镉的方法，其特征在于，步骤如下: 51.制备丛枝菌根真菌菌剂； 52.龙葵种子发芽，得龙葵幼苗； 53.按照质量比为3?5%的接种量将丛枝菌根真菌菌剂与土壤混合均匀，移栽龙葵幼苗； 54.将S3处理过的龙葵幼苗移栽到镉污染土壤中。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤SI所述制备丛枝菌根真菌菌剂的具体步骤如下: 511.按照质量比为I?3%的接种量将丛枝菌根真菌接种剂与灭菌的沙土混合均匀，然后将混合基质装至无菌盆的2/3?4/5 ; 512.播种玉米种子后，再覆盖一层0.5cm的灭菌沙土培养基，温室培养； 513.盆栽培养4?5个月后，剪去玉米植株地上部分的全部茎叶，将盆置于室内干燥I?2周，收获盆中所有培养物； 514.将盆中培养物倒在无菌纸上，用消毒的工具将其剁碎后，转移入无菌袋中，封袋冷藏。
6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤S2所述的龙葵种子需先用10%的NaClO进行表面消毒10?15min后，去离子水洗净，再放入超纯水中浸泡4?6 h ;所述发芽的条件是将浸泡后的种子放入垫有滤纸的无菌培养皿中，置于28°C室温内培养。
7.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤S3是选取长势一致的5?7天苗龄的龙葵幼苗，移栽到接种有质量比为3?5%的丛枝菌根真菌菌剂的土壤中，培养70?80天。
8.根据权利要求5所述方法，其特征在于，Sll或S12所述的沙土培养基是沙与土的质量比为1:1。
9.根据权利要求5所述方法，其特征在于，S13所述的室内的温度保持在18?30°C，湿度保持在70?85%，S13所述的所有培养物包括植物根系、菌丝、孢子和培养基。
10.根据权利要求5所述方法，其特征在于，S14是将3层无菌纸覆盖在70%酒精擦拭消毒的桌面上，将盆中培养物倒在无菌纸上，用火焰消毒的工具将其剁碎后，卷起两层纸将剁碎了的培养物转移入无菌袋中，封袋，再在外面套一个相同的塑料袋，冷藏。
【文档编号】C12R1/645GK103990647SQ201410197384
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年5月12日 优先权日:2014年5月12日
【发明者】靖元孝, 刘桧, 谭石云, 袁鸣, 江秋云 申请人:华南师范大学