基因导入芯片及基因导入方法
【专利摘要】本发明公开了一种基因导入芯片以及基因导入方法，基因导入芯片包括：压电基底、周期性设置在压电基底外周的多个叉指换能器以及设置在压电基底中部的微腔道；微腔道包括单分散微泡制备区以及细胞培养区域，单分散微泡制备区用于利用流动聚焦原理制备单分散微泡，单分散微泡包括脂质体膜以及包覆在脂质体膜内的气体，需要导入的外源基因与单分散微泡混合或者嵌设在单分散微泡的脂质体膜层上。周期性设置的多个叉指换能器可以同时施加独立的射频信号，从而在微腔道内形成一个二维平面驻波场，利用驻波声场势阱效应将单分散微泡捕获在驻波势阱位置，通过调节输入信号的相位，改变驻波声场中势阱位置，对单分散微泡进行移动。
【专利说明】基因导入芯片及基因导入方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞生物学领域，特别是涉及一种基因导入芯片及基因导入方法。
【背景技术】
[0002]长期以来，人类一直对诸如恶性肿瘤、遗传性疾病(如血友病、囊性纤维病、家族性高胆固醇血症等)及感染性疾病(如艾滋病、类风湿等)倾注了大量的精力,然而并未取得理想的结果。上述疾病的发生均与人体内基因的变异或表达异常密切相关，因此最理想的根治手段应是在基因水平上予以纠正。基因治疗理论的提出与不断深入研究，使人类在彻底攻克这类疾病的研究上进入了一个崭新的发展阶段，并取得了长足的进步。基因治疗是指通过生物学、物理学、化学方法，将正常基因或有治疗作用的基因导入人体靶细胞，纠正基因缺陷或功能上的错乱，从而达到治疗疾病的目的。如何高效、安全的将外源物质从细胞外输送至细胞内部是基因治疗的关键。
[0003]目前，基因导入方法主要包括病毒性导入、电穿孔及声致穿孔等方法。病毒性基因导入:由于病毒能够主动进入细胞并可将基因信息直接传递给细胞核，病毒导入法具有较高的转运效率，但病毒潜在的免疫原性(immunogenic)和细胞毒性作用(cytotoxiceffects)限制了其在临床中的应用。
[0004]电穿孔方法:通过高强度电场的作用，使细胞膜形成瞬态的微孔，这种方法的转运效率相对较低，高强度电场引起的热效应容易引起细胞膜组织断裂导致细胞死亡。
[0005]声致穿孔:将大量细胞与微泡同时加入溶液中，并将微泡与细胞摇匀，使微泡均匀散落在细胞之间，利用超声对混合溶液进行辐照，微泡在超声的作用下将会产生空化效应，产生一系列复杂的物理现象，如膨胀，内爆，微声流，微射流，冲击波等，这些极端物理条件将会在细胞表面上形成微孔，导致使细胞膜通透性发生改变，即声致穿孔。研究表明，当在细胞溶液中加入超声造影微泡(粒径为1-10 μ m的包膜微气泡)，由于微泡在超声作用下会产生径向振动发生稳态或瞬态空化效应，可显著提高细胞膜的开孔效率。稳态空化是指当低能量超声的频率接近微泡的共振频率时，微泡膜产生径向振动，微泡体积发生周期性振荡；瞬态空化是指微泡在较大声压激励下，微泡不断聚集声波能量，微泡会产生振荡、膨胀、收缩以及内爆等一系列动力学过程。Wu等指出当微泡在细胞附近发生瞬态空化时，微泡非对称破碎形成的微激流(microjetting),声微流(microstreaming)以及冲击波(shock waves)是导致声致穿孔的重要物理机制(如图1所示)，微激流对应的剪切应力大小直接决定细胞膜完整性及细胞活性【J.Wu and ff.L.Nyborg, "Ultrasound，cavitation bubbles and their interaction with cells, 〃Adv.Drug DeliveryRev.，vol.60，pp.1103-1116，2008】。Zhou等进一步发现，当微泡与细胞之间距离过大时，微射流对应的剪切应力不足以破坏细胞膜结构的完整性，细胞开孔效率低下【D.M.Hallow, A.D.MahajanjT.E.McCutchenj and Μ.R.Prausnitzj"Measurement and correlation ofacoustic cavitation with cellular bioeffects, "Ultrasound Med.Biol.，vol.32，pp.1111-11222006.】。Ohl则发现当微泡与细胞距离过小时，细胞开孔效率虽可得到显著提高，但过大的剪切应力可使贴壁细胞脱离基底，在细胞膜表面形成致死性损伤【C.D.0hliM.Aroraj R.1kinkj N.De Jong, M.Versluisj M.Delius，and D.Lohsej ^Sonoporation fromjetting cavitation bubbles, "Biophys.J.，vol.91，pp.4285-4295，2006】。
[0006]为提高细胞转染效率，业内提出多种新方法来调控微泡与细胞之间的距离。Fan等在微泡表面偶联上特异性抗体，使靶向微泡通过化学键与特异性细胞结合，黏附于细胞膜表面，然而这种单纯依靠化学键结合的方法难以动态调控微泡与细胞之间的距离【Z.Fan, H.Liu, M.Mayer, and C.X.Deng, ^SpatiotemporalIy controlledsingle cell sonoporation, 〃Proc.Nat.Acad.Sc1.U.S.A., vol.109, pp.16486-16491，0ctober9，20122012】。Sankin等利用光学诱导击穿机制，在激光焦点处产生气泡并使其空化，通过改变激光焦点位置，调节微泡与细胞之间的距离【G.N.Sankin, F.Yuan, and P.Zhong, "Pulsating Tandem Microbubble for Localized and DirectionalSingle-Cell Membrane Poration, "Phys.Rev.Lett., vol.105, p.078101, 2010】。Prentice等利用光镊实现了对微泡的空间操控，但由于光镊聚焦范围和聚焦强度需要平衡，很难实现微泡大范围连续操控【P.Prentice, A.Cuschieri, K.Dholakia, M.Prausnitz, andP.Campbe11，"Membrane disruption by opticalIy controlled microbubblecavitation, "Nat.Phys., vol.1, pp.107-110，2005.】。
[0007]传统的声致穿孔方法均是研究微泡与细胞的群体效应，精确性较低。
【发明内容】
[0008]基于此，有必要提供一种精确性较高的基因导入芯片以及基因导入方法。
[0009]一种基因导入芯片，包括:压电基底、周期性设置在所述压电基底外周的多个叉指换能器以及设置在所述 压电基底中部的微腔道；
[0010]所述微腔道包括单分散微泡制备区以及细胞培养区域，所述单分散微泡制备区用于利用流动聚焦原理制备单分散微泡，所述单分散微泡包括脂质体膜以及包覆在所述脂质体膜内的气体，需要导入的外源基因可与所述单分散微泡混合或者偶联在所述单分散微泡的脂质体膜层上，所述细胞培养区域用于培养需要进行基因导入的细胞；
[0011]周期性设置的多个所述叉指换能器可以同时施加独立的射频信号，从而在所述微腔道内形成一个二维平面驻波场，利用驻波声场势阱效应将所述单分散微泡捕获在驻波势阱位置，通过调节输入信号的相位，改变驻波声场中势阱位置，达到对所述单分散微泡进行移动的目的；
[0012]通过改变所述射频信号输入的幅值、脉冲持续时间和脉冲重复频率提高输入能量，激励所述单分散微泡产生剧烈的膨胀、收缩直至破碎。
[0013]在一个实施例中，所述叉指换能器为四个，四个所述叉指换能器成十字形排列，所述微腔道位于四个所述叉指换能器中间。
[0014]在一个实施例中，所述压电基底为128° YX双面抛光的铌酸锂基底；
[0015]所述微腔道为PDMS微腔道，所述PDMS微腔道含有多个独立并行的腔室，每个所述腔室的直径为10 μ m~100 μ m。
[0016]在一个实施例中,所述气体为氮气、氦气、氖气、氩气、氪气、氙气或全氟化物。
[0017]在一个实施例中，所述全氟化物为全氟丙烷或全氟丁烷。[0018]在一个实施例中，所述单分散微泡制备区包括两个入口、流道和喷嘴，气体和含有外源基因的脂质体溶液分别从两个所述入口进入所述流道，经所述喷嘴聚焦后形成稳定的锥形，锥形顶端的气体因不稳定在所述喷嘴处汇合并形成具有壳层结构的单分散微泡。
[0019]在一个实施例中，所述单分散微泡的移动距离与输入射频信号的相对相位具有良
好的线性关系，可表达为:
[0020]
【权利要求】
1.一种基因导入芯片，其特征在于，包括:压电基底、周期性设置在所述压电基底外周的多个叉指换能器以及设置在所述压电基底中部的微腔道； 所述微腔道包括单分散微泡制备区以及细胞培养区域，所述单分散微泡制备区用于利用流动聚焦原理制备单分散微泡，所述单分散微泡包括脂质体膜以及包覆在所述脂质体膜内的气体，需要导入的外源基因可与所述单分散微泡混合或者偶联在所述单分散微泡的脂质体膜层上，所述细胞培养区域用于培养需要进行基因导入的细胞； 周期性设置的多个所述叉指换能器可以同时施加独立的射频信号，从而在所述微腔道内形成一个二维平面驻波场，利用驻波声场势阱效应将所述单分散微泡捕获在驻波势阱位置，通过调节输入信号的相位，改变驻波声场中势阱位置，达到对所述单分散微泡进行移动的目的； 通过改变所述射频信号输入的幅值、脉冲持续时间和脉冲重复频率提高输入能量，激励所述单分散微泡产生剧烈的膨胀、收缩直至破碎。
2.根据权利要求1所述的基因导入芯片，其特征在于，所述叉指换能器为四个，四个所述叉指换能器成十字形排列，所述微腔道位于四个所述叉指换能器中间。
3.根据权利要求1所述的基因导入芯片，其特征在于，所述压电基底为128°YX双面抛光的银酸裡基底； 所述微腔道为PDMS微腔道，所述PDMS微腔道含有多个独立并行的腔室，每个所述腔室的直径为10 μ m~100 μ m。
4.根据权利要求1所述的基因导入芯片，其特征在于，所述气体为氮气、氦气、氖气、氩气、氪气、氣气或全氟化物。
5.根据权利要求4所述的基因导入芯片，其特征在于，所述全氟化物为全氟丙烷或全氟丁烷。
6.根据权利要求1所述的基因导入芯片，其特征在于，所述单分散微泡制备区包括两个入口、流道和喷嘴，气体和含有外源基因的脂质体溶液分别从两个所述入口进入所述流道，经所述喷嘴聚焦后形成稳定的锥形，锥形顶端的气体因不稳定在所述喷嘴处汇合并形成具有壳层结构的单分散微泡。
7.根据权利要求1所述的基因导入芯片，其特征在于，所述单分散微泡的移动距离与输入射频信号的相对相位具有良好的线性关系，可表达为:
8.根据权利要求1所述的基因导入芯片，其特征在于，所述单分散微泡在声波作用下，将会产生径向运动，若激励声场频率与强度恒定，且声波波长远大于所述单分散微泡的半径，利用理想气泡振动的非线性常微分方程可得到所述单分散微泡的半径随时间变化曲线，推测所述单分散微泡的最大膨胀半径；当所述单分散微泡的最大膨胀半径小于所述单分散微泡与细胞之间初始距离时，所述单分散微泡破碎形成的微射流将不断的弯曲、拉伸细胞膜，最终导致细胞膜表面产生可逆的微孔；所述单分散微泡的作用范围满足如下关系式:
9.一种基因导入方法，其特征在于，包括如下步骤: 提供基因导入芯片，所述基因导入芯片包括压电基底、周期性设置在所述压电基底外周的多个叉指换能器以及设置在所述压电基底中部的微腔道，所述微腔道包括单分散微泡制备区以及细胞培养区域，将需要进行基因导入的细胞培养在所述细胞培养区域； 所述单分散微泡制备区利用流动聚焦原理制备单分散微泡，所述单分散微泡包括脂质体膜以及包覆在所述脂质体膜内的气体，需要导入的外源基因可与所述单分散微泡简单混合或者偶联在所述单分散微泡的脂质体膜层上； 周期性设置的多个所述叉指换能器同时施加独立的射频信号，从而在所述微腔道内形成一个二维平面驻波场，利用驻波声场势阱效应将所述单分散微泡捕获在驻波势阱位置，通过调节输入信号的相位，改变驻波声场中势阱位置，将所述单分散微泡移动到所述细胞培养区域；以及 通过改变输入射频信号的幅值、脉冲持续时间和脉冲重复频率提高输入能量，激励所述单分散微泡产生剧烈的膨胀、收缩直至破碎，从而在所述需要进行基因导入的细胞的细胞膜表面形成可逆的微孔，所述需要导入的外源基因随之被导入到所述需要进行基因导入的细胞内。
10.根据权利要求9所述的基因导入方法，其特征在于，所述叉指换能器为四个，四个所述叉指换能器成十字形排列，所述微腔道位于四个所述叉指换能器中间。
11.根据权利要求9所述的基因导入方法，其特征在于，所述压电基底为128°YX双面抛光的银酸裡基底； 所述微腔道为PDMS微腔道，所述PDMS微腔道含有多个独立并行的腔室，每个所述腔室的直径为10 μ m~100 μ m。
12.根据权利要求9所述的基因导入方法，其特征在于，所述气体为氮气、氦气、氖气、IS气、氪气、氣气或全氟化物。
13.根据权利要求12所述的基因导入方法，其特征在于，所述全氟化物为全氟丙烷或全氟丁烷。
14.根据权利要求9所述的基因导入方法，其特征在于，所述单分散微泡制备区包括两个入口、流道和喷嘴，气体和含有外源基因的脂质体溶液分别从两个所述入口进入所述流道，经所述喷嘴聚焦后形成稳定的锥形，锥形顶端的气体因不稳定在所述喷嘴处汇合并形成具有壳层结构的单分散微泡。
15.根据权利要求9所述的基因导入方法，其特征在于，将所述单分散微泡移动到所述细胞培养区域的操作中，所述单分散微泡的移动距离与输入射频信号的相对相位具有良好的线性关系，可表达为:
16.根据权利要求9所述的基因导入方法，其特征在于，所述需要导入的外源基因被导入到所述需要进行基因导入的细胞内的操作中，所述单分散微泡在声波作用下，将会产生径向运动，若激励声场频率与强度恒定，且声波波长远大于所述单分散微泡的半径，利用理想气泡振动的非线性常微分方程可得到所述单分散微泡的半径随时间变化曲线，推测所述单分散微泡的最大膨胀半径；当所述单分散微泡的最大膨胀半径小于所述单分散微泡与细胞之间初始距离时，所述单分散微泡破碎形成的微射流将不断的弯曲、拉伸细胞膜，最终导致细胞膜表面产生可逆的微孔；所述单分散微泡的作用范围满足如下关系式:
【文档编号】C12N15/09GK103981090SQ201410197086
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月9日 优先权日:2014年5月9日
【发明者】郑海荣, 孟龙, 蔡飞燕, 牛丽丽, 李飞, 肖杨 申请人:深圳先进技术研究院