用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群、探针群及其应用方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群，病原体包括人巨细胞病毒、腺病毒等14种呼吸道传染性疾病的病原体，所述的引物群包括上述14种病原体的引物中的任意1组或者2组以上的引物；本发明还提供与引物群中的引物一一对应配对的探针组成的探针群；并提供将上述引物群和探针群用于液态芯片快速检测方法中的应用方法。此应用方法可检测1种或者同时检测多种急性呼吸道传染性疾病病原体，且，灵敏度高、特异性好。
【专利说明】用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群、探针群及其应用方法和试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及疾病检测领域，尤其是一种用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群、探针群及其应用方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002]急性呼吸道传染性疾病一旦爆发，便以极迅速的方式进行传播，因此，防治急性呼吸道传染性疾病的关键在于早期诊断、早期隔离、早期治疗。
[0003]现有的急性呼吸道传染性疾病的检测方法主要有:(I)病原体分离培养法:此法不仅操作过程繁琐，灵敏度低，时间长，且技术上难度高，普通医务场所难以开展；(2)免疫检测法:该方法为回顾性方法，患者需感染产生抗体后方可得以检测，无法适应快速检测的需求，且由于抗体交叉反应易出现假阳性；(3)病原体为病毒时，对于病毒种类的检测，需将病毒接种到活的真核细胞中，对病毒进行细胞培养、病毒繁殖，选择的最佳细胞株，并根据该细胞株是否存在细胞病变效应(CPE)或者是否有早期抗原，进行病毒种类的鉴定，但是，费时费力；(4)近年来发展的聚合酶链反应(PCR)，可实现快速检测病原体的目的，但是，此法只可对单一病原进行检测，且非特异性结合以及假阴性、假阳性问题较明显。
[0004]2001年美国Luminex公司开发了一种液态芯片(liquid chip),创新性地将细胞大小的微球作为探针的载体，为生物分子相互作用提供一种能够充分反应的液相环境，同时将激光检测、高速数字信号处理器应用到该技术中，这种基于微球的芯片技术能够对单孔内多达100种不同的反应同时进行检测，与固相芯片或片膜芯片相比，具有多重、快速、灵敏度高(可达0.01pg)、重复性好(CV〈5%)以及检测动态范围宽(可达0.2-32000pg/ml)等优点，实现了多指标同步分析的功能。该技术已用于肿瘤标志物、过敏原筛查、自身免疫病、细胞因子等方面的研究，并已为美国FDA批准用于临床进行自身免疫病、人类白细胞抗原分型的诊断。但是，该技术尚未在临床检测病毒、细菌等方面进行应用。
【发明内容】
[0005]本发明旨在提供一种可用于检测I种或多种病原体的检测急性呼吸道传染性疾病的引物群、探针群及其应用方法和试剂盒，且，此应用方法可同时进行多种病原体的检测，且，灵敏度高、特异性好。
[0006]一种用于检测急性呼吸 道传染性疾病的引物群，由14组引物中的任意I组或者2组以上的引物组成，所述的14组引物的核苷酸序列分别为:
①人巨细胞病毒(简称=HCMV)
HCMV-F:biotin (生物素)- AAGTTTGTGCCCCAACGGTA、
HCMV-R:biotin - GCGTGCTTTTTAGCCTCTGC ；
②腺病毒(简称:AD)
AD-F:biotin - CGCAGTGGTCTTACATGCACA、AD-R:biotin - ACGCCGCGGATGTCAAAGT ；
③副流感病毒I型(简称:PIV1)
PIVl-F:biotin -CCTTGGAGCGGAGTTGTTAAG、
PIVl-R:biotin - CCGGTAATTTCTCATACCTATG ；
④副流感病毒2型(简称:PIV2)
PIV2-F:biotin - ATGGAATCAATCGCAAAAGC、
PIV2-R:biotin - GATGATAGATCCCGCTTCCA ；
⑤副流感病毒3型(简称:PIV3)
PIV3-F:biotin - CTCGAGGTTGTCAGGATATAG、
PIV3-R:biotin - CTTTGGGAGTTGAACACAGTT ；
⑥呼吸道合胞病毒(简称:RSV)
RSV -F:biotin - CAAGTTGTTGAGGTTTATGAATATGC、
RSV -R:bioti n - TTCTGCTGTCAAGTCTAGTACACTGTAGT ；
⑦金黄色葡萄球菌(简称:SA)
SA-F:biotin -ATGGAAGTTCGTGACTTATTAAGC、
SA-R:biotin - AACAGTTGTTTTAGATGTGTCATGT ；
⑧肺炎链球菌(简称:SP)
SP-F:biotin - GTGATATTTCTGTAACAGCTACC、
SP-R:biotin - GAGAATTCCCTGTCTTTTCAAA ；
⑨肺炎支原体(简称:MP)
MP-F:biotin - TGCCATCTACCCGCGCTTA、
MP-R:biotin - GTGATCTGCCCGGTTTGGTC ；
⑩肺炎衣原体(简称:CP)
CP-F:biotin - AGTTGAGCATATTCGTGAGG、
CP-R:biotin - TTTATTTCCGTGTCGTCCAG ；
(11)肺炎克雷伯菌(简称:KP)
KP-F:biotin - CTGGATCTGACCCTGCAGTA、
KP-R:biotin - CCGTCGCCGTTCTGTTTC ；
(12)鲍曼不动杆菌(简称:AB)
AB-F:biotin - TCGTGCTTCGACCGAGTAT、
AB-R:biotin - AACCAACACGCTTCACTTCC ；
(13)铜绿假单胞菌(简称:PA)
PA-F:biotin - GGCGTGGGTGTGGAAGTC、
PA-R:biotin - GTGGCGATCTTGAACTTCTT ；
(M)嗜麦芽窄食单胞菌(简称:SM) '
SM-F:biotin - CAGCCTGCGAAAAGTA、
SM-R:biotin - TTAAGCTTGCCACGAACAG。
[0007]上述的 HCMV-F、AD-F, PIVl-F, PIV2-F、PIV3-F、RSV - F、SA-F, SP-F, MP-F, CP-F,KP-F、AB-F、PA-F、SM-F中的“_F”均指相应病原体的上游引物，而HCMV-R、AD- R、PIV1_ R、PIV2- R、PIV3- R、RSV - R、SA- R、SP- R、MP_ R、CP- R、KP_ R、AB_ R、PA_ R、SM- R 中的“_R”指的是相应病原体的下游引物。本发明对病原体的保守序列的选择非常关键，本 申请人:经过了无数次的试验，选择了病原体的最佳保守序列，并对各个保守序列的引物进行筛选，获得了适用于液体芯片法检测急性呼吸道疾病的病原体特异性引物。
[0008]与上述引物群配合使用的探针群，此探针群中的探针与引物群中的引物按照序号一一对应配合，探针群的核苷酸序列为:
【权利要求】
1.一种用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群，由14组引物中的任意I组或者2组以上的引物组成，所述的14组引物的核苷酸序列分别为:
2.与权利要求1所述的一种用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群配合使用的探针群，其特征在于:所述的探针群的探针与权利要求1中的引物按照序号一一配合使用，探针的核苷酸序列为:
3.一种用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物、探针的应用方法，其应用步骤为: (O以权利要求1所述的引物群中的引物作为扩增引物、待测样品的DNA作为DNA模板，进行PCR扩增，获得扩增产物； (2)以权利要求2所述的探针群中的每一种探针分别与不同颜色标记的微球进行偶联，形成探针-微球偶联体，不同探针所对应的探针-微球偶连体的颜色各不相同，将所有的探针-微球偶连体混合，制成探针-微球偶联体混合液； (3)将扩增产物、探针-微球偶联体混合液、Tris-Cl缓冲液(简称:TE)、藻红蛋白(简称:SA-PE)混合，进行杂交，获得杂交产物，采用液态悬浮芯片系统检测杂交产物的荧光值； (4)结果判定:产生某种病原菌相应颜色的微球， 荧光值≥200时，为阳性； 荧光值< 150为阴性； 荧光值在150~200之间时，样品需重复试验，若荧光值> 150的样品判定为阳性，若荧光值< 150的样品判定为为阴性。
4.根据权利要求3所述的一种用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群、探针群的应用方法，其特征在于:步骤(1)采用多组PCR扩增体系，每组PCR扩增体系中含有f 6组引物。
5.根据权利要求4所述的一种用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群、探针群的应用方法，其特征在于，步骤(1):将权利要求1所述的引物群中的金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、肺炎支原体、肺炎衣原体所对应的引物作为扩增引物、以待测样品的DNA作为DNA模板，进行PCR扩增体系A，收集扩增产物A，同时，将权利要求1所述的引物群中的呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒2型、巨细胞病毒、人副流感病毒I型、人副流感病毒3型所对应的引物作为扩增引物、以待测样品的DNA作为DNA模板，进行PCR扩增体系B，收集扩增产物B ;步骤(3)为将扩增产物A、扩增产物B、探针-微球偶联体混合液、Tris-Cl缓冲液(简称:TE)、藻红蛋白(简称:SA-PE)混合，进行杂交，获得杂交产物，采用液态悬浮芯片系统检测杂交产物的荧光值；其他步骤不变。
6.根据权利要求5所述的一种用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群、探针群的应用方法，其特征在于:步骤(1)采用PCR扩增体系A、B、C三组PCR扩增体系，PCR扩增体系A优选为:
7.根据权利要求3所述的一种用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群、探针群的应用方法，其特征在于:本发明的步骤(3)中的杂交过程中，杂交体系为: 试剂体积终浓度 扩增产物AI μ I/ 扩增产物BI μ I/ 扩增产物CI μ I/ 探针-微球偶联体混合液1.4 μ I 1.25 X 107beads/ml 四甲基氯化铵20.6μ1 1.5X
SA-PE0.3 μ Ilmg/mL
TE74.7 μ I1.0Χ ； 杂交体系的反应条件为:将扩增产物、探针-微球偶联体混合液、Tris-Cl缓冲液混合；95°C变性5min ;杂交，杂交温度为46°C~50°C，杂交时间为30_60min ;然后，加入藻红蛋白，46 °C反应15min，获得杂交产物。
8.一种用于检测急性呼吸道传染性疾病的试剂盒，所述的试剂盒包括试剂组份1~4，其中，试剂组份I为权利要求1所述的用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群；试剂组份2为根据权利要求3所述的用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群和探针群的应用方法所制得的探针-微球偶联体混合液；试剂组份3为权利要求6所述的用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群和探针群的应用方法中的dNTP、Bestar Taq Buffer、Bestar Taq DNAPolymerase和双蒸水；试剂组份4为权利要求7所述的用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群和探针群的应用 方法中的四甲基氯化铵、报告混合液藻红蛋白和去核酸水。
【文档编号】C12Q1/70GK103993104SQ201410226772
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年5月27日 优先权日:2014年5月27日
【发明者】陈愉生, 沈晓娜, 伍严安, 王毅 申请人:福建省立医院, 福建省疾病预防控制中心, 上海透景生命科技有限公司