专利名称：治疗慢性呼吸道疾病的药物的制作方法
技术领域：
本发明提供甲基黄嘌呤(methylxanthine)衍生物诸如茶碱和类固醇药物在协同联合治疗慢性阻塞性肺病(COPD)中的应用。类固醇和茶碱以每个单一成分没有或具最小限度的抗炎作用的剂量的联合给药，产生治疗协同抗炎反应。
导言茶碱是作为口服药物用于慢性呼吸道疾病诸如哮喘和COPD的便宜的白色结晶粉末。氨茶碱，或称茶碱乙二胺，是茶碱与乙二胺结合而成的并且具有与茶碱相似的特性。茶碱已知具有支气管扩张效应和轻微的抗炎作用，部分是由于其活性作为弱的非选择性磷酸二酯酶(PDE)抑制剂。迄今为止，所述药物的特征为窄治疗指数，该药物的以胃肠不适、震颤、心律失常和其它合并症著称的毒性反应常见于临床实践中。用于慢性呼吸道疾病的其它药物，诸如吸入的β-激动剂和吸入的类固醇，经常被开出处方以替代茶碱而避免不良效应。
虽然茶碱已经在临床应用多年，其作用的分子机理和其作用位点尚不确定。已提出包括下列的多种有关作用的分子机理。
茶碱是磷酸二酯酶的弱的和非选择性抑制剂，所述酶降解细胞的环核苷，从而，导致细胞内的环AMP和GMP浓度增加。茶碱通过抑制PDE(PDE3、PDE4和PDE5)活性松驰气道平滑肌，但是需要相对高的浓度达最大松驰作用(Rabe，等Eur Respir J 1999，8637-42)。在与治疗相关的茶碱浓度时，PDE的抑制程度非常小。没有证据显示茶碱对于任何具体的同工酶，诸如，例如PDE4B(气道中介导抗炎作用的炎性细胞中的主要PDE同工酶)具有任何选择性。
在治疗浓度，茶碱是潜在的腺苷受体抑制剂，其拮抗A1和A2受体，尽管其对A3受体无效(Pauwels，R.A.，Joos，G.F.Arch IntPharmacodyn Ther 1995，329151-60)。
茶碱增加具有广谱抗炎作用的白细胞介素-10的释放。此作用可经由PDE抑制作用介导，尽管未见此剂量于哮喘中是有效的(Oliver，等Allergy 2001，561087-90)。
茶碱防止促炎转录因子核因子-κB(NF-κB)迁徙进入细胞核，因而潜在地减少哮喘和COPD中的炎性基因的表达(Tomita，等ArchPharmacol 1999，359249-55)。这些作用见于高浓度时且也可由PDE的抑制介导。
此外，最近显示茶碱激活组蛋白乙酰基转移酶(HDAC)。组蛋白的蛋白乙酰化作用与基因功能的活化相关联，相信激活炎性基因的促炎转录因子还引起的增加组蛋白乙酰基转移酶活性。随着HDAC活性和脱乙酰作用组蛋白蛋白质的增加，相信茶碱抑制炎性基因的表达(见Barnes，(2003)Am J Respir Crit Care Med 167813-818)。
糖皮质激素药物(类固醇)已经成为哮喘的首选疗法并且通常以吸入的形式广泛用于COPD的治疗。然而，尽管吸入性的类固醇在多数哮喘患者中是有效的，它们在COPD中的使用由于其缺乏可论证的抗炎作用(Culpitt，S.V.等(1999).Am.J Respir.Crit Care Med.160，5Pt 1，1635-1639)和它们明显不能影响疾病进程(Burge，等(2000).BMJ3201297-1303)而存在异议。给予对低剂量类固醇无反应的哮喘患者较高剂量，在布地奈德的案例中最高达每天1600μg。
Evans等，(2004)NEJM 3371412，建议吸入性类固醇的高剂量可由通过给予正常的糖皮质激素剂量合并低剂量的茶碱取代，用于哮喘。给予患者400μg的布地奈德(标准剂量)合并250或375mg的茶碱，或800μg的布地奈德加上安慰剂，每天两次。在本研究中的茶碱的血浆浓度达到2.5至17.1mg/l的范围，其中值为8.7mg/l。此两个治疗范例的效应相似，提示在给予类固醇时茶碱具有使其剂量节省(sparing)的作用。然而，在所用的剂量下，患者遭受药物相关的副作用，包括胃肠不适、心悸、咽痛和与类固醇和/或茶碱治疗相关联的其它副作用。此外，作者不确定所述药物对于炎症的任何作用。调查吸入的类固醇和口服茶碱之间的潜在相互作用的类似的研究尚未在COPD患者中进行。
因此，存在对提供有效的抗炎活性和避免与现有疗法相关的副作用的用于COPD的治疗方案的需求。
发明简述本发明人已经证明，在COPD动物模型中，在给予类固醇和甲基黄嘌呤化合物单独治疗由吸烟(TS)引起的炎症无效的剂量时，当合并给予时具有协同作用，并且能够通过下面提出的试验能够显著减少所述模型中的炎症的50％或50％以上。TS暴露(TS exposure)是广泛接受的人COPD的主要病因。
因此，在第一个方面，本文提供甲基黄嘌呤化合物和类固醇联合用于制备组合物中的应用，所述组合物用于治疗慢性呼吸道疾病，其中所述甲基黄嘌呤化合物的剂量在独立给予时对治疗所述呼吸道疾病无效，但是合并给予类固醇后有效减少呼吸道的炎症。
优选地，所述慢性疾病是COPD。有利地，慢性疾病可包括严重哮喘和囊性纤维化(cystic fibrosis)。
本发明认识到甲基黄嘌呤化合物和类固醇药物之间的协同作用引起非常高的抗炎活性。此协同作用是通过使用当单独给予时是无效的各药物的剂量而达到的。其作用不是相加而是协同，其中可同时给予两种少有或没有作用的药物，以获得对炎性反应的高度显著的抑制。
在此使用的甲基黄嘌呤化合物，指的是茶碱和药理学上等价的化合物和盐，包括氨茶碱和胆茶碱(oxtriphylline)。这样的化合物为甲基黄嘌呤类，包括咖啡因、可可碱、呋拉茶碱(Furaphylline)、7-丙基-茶碱-多巴胺、恩丙茶碱(enprofylline)等。类固醇药物包括糖皮质激素、皮质类固醇和盐皮质激素，诸如地塞米松和布地奈德、倍氯米松、氟尼缩松(flunisolide)、氟替卡松、环索奈德(Ciclesonide)、莫米他松(mometasone)、氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙、曲安西龙、倍他米松、氟氢可的松和去氧皮质酮。类固醇药物还可包括在临床上开发的用于COPD的类固醇，诸如GW-685698、GW-799943和在国际专利申请WO0212265、WO0212266、WO02100879、WO03062259、WO03048181和WO03042229中提及的化合物。类固醇药物还可包括开发为减少的副作用特性的下一代分子，诸如选择性糖皮质激素受体激动剂(SEGRAs)，包括ZK-216348和国际专利申请WO00032585、WO000210143、WO2005034939、WO2005003098、WO2005035518和WO2005035502中提及的化合物。
优选地，甲基黄嘌呤是茶碱。
依据本发明，可以标准剂量或如果将甲基黄嘌呤化合物独立给予患者时将不产生作用的剂量，给予类固醇。
有利地，类固醇以所用的剂量，对减少所述呼吸道疾病的炎症是无效的。某些呼吸道疾病，包括COPD，对类固醇治疗耐受，且类固醇药物在减少炎症上是无效的。然而，合用茶碱可观察到抗炎作用。
可通过任何适当的途径给药，所述途径包括口服、吸入、注射，采用长效释放植入剂等。口服给药是有利的，特别是在不发达国家，那里对注射剂的管理存在问题，和在非处方医疗申请时。吸入性药物当然常用于慢性呼吸道疾病诸如哮喘的患者中，他们常用吸入器。优选地，茶碱经口服给药。
另一方面，本发明提供一种为单位剂量形式的药用组合物，所述组合物包含如果独立给予则不足以有效治疗呼吸道疾病的剂量的甲基黄嘌呤化合物，和类固醇。这样的单位剂量可被包装以提供用于治疗呼吸道疾病的药剂盒，所述药剂盒包含为单位剂量形式的甲基黄嘌呤化合物和类固醇，其中甲基黄嘌呤化合物的剂量为如果独立给予则不足以有效治疗呼吸道疾病的剂量。
这样的药剂盒可包含，例如，指导用户大体上同时给药使用的用法说明书，这样它们在同一时间存在于患者体内。
本发明还提供为单位剂量形式的甲基黄嘌呤化合物和类固醇，用于同时地，分开同时或序贯地应用以治疗呼吸道疾病，其中的甲基黄嘌呤化合物的剂量如果在独立给予时，不足以有效治疗呼吸道疾病。
在依据本发明的药剂盒或单位剂量中，优选类固醇的剂量为，如果独立给予时不足以有效治疗呼吸道疾病的剂量。
本发明还提供为单位剂量形式的甲基黄嘌呤化合物和类固醇，用于同时地，分开同时或序贯地应用以治疗呼吸道疾病，其中甲基黄嘌呤化合物是这样的剂量提供的，即所述剂量如果独立给予时，不足以有效治疗呼吸道疾病。
在本发明的前述方面，不发挥任何治疗学或药理学作用的甲基黄嘌呤化合物的口服剂量，有利地是低于5mg/kg，优选0.1至4mg/kg，最优选0.1至3mg/kg。有利地，甲基黄嘌呤的剂量为3mg/kg或更低。由甲基黄嘌呤的这些剂量所达到的血浆水平减到通常认为的临床效能所需的水平(10-20mg/l)以下(Cazzola等，(2004)PulmonaryPharmacology&Therapeutics 17，141-145)。
在本发明的前述方面，在COPD动物模型中不发挥任何明显药理学作用的类固醇的剂量，有利地是低于0.5mg/kg，优选0.1至0.4mg/kg，最优选0.1至0.3mg/kg。有利地，类固醇的剂量为0.3mg/kg或更低。
依据本发明，可通过任何可能评价炎症的技术检测治疗有效性。在优选的实施方案中，呼吸道疾病的治疗通过计数由支气管肺泡灌洗术(BAL)回收的细胞进行评价。炎症也可用痰或用支气管上皮活组织检查进行评价。
有利地，所述细胞选自巨噬细胞、上皮细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性细胞和淋巴细胞。
本发明能够基本减少呼吸道疾病中的炎症。有利地，给予甲基黄嘌呤化合物和类固醇后细胞计数减少50％或更多，优选70％或更多。
同时，有利地，当单个剂量的甲基黄嘌呤化合物和类固醇加在一起，总共可减少细胞数量40％或更低，优选30％或更低，理想的是20％或更低。此时给予甲基黄嘌呤化合物和类固醇后的细胞计数协同减少70％或更多，单个药物的附加作用优选为减少60％或更低，有利地，56％或更低。
图的简述
图1或者单独或者联合口服给予茶碱和地塞米松(11天连续的每天TS暴露的1h前和6h后)对末次暴露后24h的BAL中回收的总的细胞数量的作用。以3mg/kg单独给予茶碱或以3和1mg/kg与地塞米松(0.3mg/kg)联合给予。
图2或者单独或者联合口服给予茶碱和地塞米松(11天连续的每天TS暴露的1h前和6h后)对末次暴露后24h的BAL中回收的巨噬细胞数量的作用。以3mg/kg单独给予茶碱或以3和1mg/kg与地塞米松(0.3mg/kg)联合给予。
图3或者单独或者联合口服给予茶碱和地塞米松(11天连续的每天TS暴露的1h前和6h后)对末次暴露后24h的BAL中回收的上皮细胞数量的作用。以3mg/kg单独给予茶碱或以3和1mg/kg与地塞米松(0.3mg/kg)联合给予。
图4或者单独或者联合口服给予茶碱和地塞米松(11天连续的每天TS暴露的1h前和6h后)对末次暴露后24h的BAL中回收的嗜中性粒细胞数量的作用。以3mg/kg单独给予茶碱或以3和1mg/kg与地塞米松(0.3mg/kg)联合给予。
图5口服给予茶碱和地塞米松(LPS的1h前和6h后)对LPS引起的激发(challenge)24h后总的BAL细胞增加的作用。
图6口服给予茶碱和地塞米松(LPS的20和1h前以及6h后)对LPS引起的激发24h后总的BAL嗜中性粒细胞增加的作用。
图7A/J小鼠口服给药后的茶碱的血浆浓度。
发明详述本发明采用如下详述的药理学和生物化学的标准技术。在本发明的上下文中，某些术语具有如下特别的含义。
本发明描述了甲基黄嘌呤和类固醇药物以联合的形式给药，和与联合给药相对的独立给予各个所述药物。因此，“独立(in isolation)”指的是给予甲基黄嘌呤化合物而不给予类固醇，或反之亦然，不管是在甲基黄嘌呤化合物之前、同时或之后给予类固醇。其目的是使甲基黄嘌呤化合物和类固醇的给予之间有区别，这样它们可同时或分别地在靶生物体内发挥它们的药理学活性。
“联合应用”或“组合”在本发明中的含义应该理解的含义为单个成分可同时(以组合药物的形式)、分开但是几乎是同时(例如以分开的剂量)或序贯地给予(直接地连续或在适合的时间间隔之后给药，条件是这两个药物同时在体内是具活性的)。
在提及炎性疾病和/或呼吸道疾病的治疗时，“有效”指的是在检测呼吸道疾病的炎症的化验中获得反应。优选的试验是支气管肺泡灌洗术(BAL)后进行细胞计数，其中细胞的存在表明肺部有炎症。在病人中，BAL、所产生的痰和支气管活检为评价炎症优选的方法。炎症可由任何预想的方式诸如烟草吸入、给予刺激物诸如LPS等引起。烟草吸入是优选的，因为，如在此所显示的，LPS的使用不能如实地复制如在COPD中所见的类固醇耐受的炎性反应。在本上下文中，BAL/细胞计数测定，“有效的”优选包括细胞数量比没有给药的对照组减少30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％或更多。
“无效”在相同化验中意指更加低水平的反应。优选地，在BAL/细胞计数化验中，“无效”意指细胞数量减少30％或以下，有利地，28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％或21％或以下，和优选地20％或以下。在某些例子中，“无效”可包括炎症的增强，例如，见到细胞数量增加。
“协同”意指在设定的试验中，两个药物的效应比通过将分别的单个的效应相加的预期的效应要强。例如，在BAL试验中，如果在独立给予甲基黄嘌呤化合物和类固醇时，它们分别使细胞数量减少10％和20％，以同样的剂量联合给予同样的药物，将看到如果细胞数量减少超过30％，则为协同反应。
“给予”指的是给予药物的整个剂量，诸如以大剂量给予预想的患者。在本发明的上下文中，剂量优选以达到的血浆水平(＜5mg/l；6-9mg/l；10-20mg/l)表示，血浆水平优选在1至9mg/l之间，最优选少于1mg/l。
“剂量”是如上所描述的给予药物的量。给药可通过任何适合的途径进行，包括以上提及的途径。总之，不可能通过两种给药途径给予相等的剂量。例如，吸入性类固醇一般以比口服类固醇较低的剂量给予，以达到相当的效应，因为它们直接传递到作用部位而不是全身。
“单位剂量”形式是在一个或更多的包装量中的药用组合物的制剂，其各自包含依据本发明的单个剂量。典型的单位剂量包括丸剂、胶囊剂、栓剂、单次使用的安瓿剂等。
茶碱和类固醇茶碱和氨茶碱茶碱具有下示的结构
且可以以多种商品名称从商业上获得，包括Accurbron、Aerobin、Aerolate、Afonilum、Aquaphyllin、Armophylline、Asmalix、Austyn、Bilordyl、Bronchoretard、Bronkodyl、Cetraphylline、Constant T、Duraphyllin、Diffumal、Elixomin、Elixophyllin、Etheophyl、Euphyllin、Euphylong、LaBID、Lanophyllin、Lasma、Nuelin、Physpan、Pro-Vent、PulmiDur、Pulmo-Timelets、Quibron、Respid、Slo-Bid、Slo-Phyllin、Solosin、Sustaire、Talotren、Teosona、Theobid、Theoclear、Theochron、Theo-Dur、Theolair、Theon、Theophyl、Theograd、Theo-Sav、Theospan、Theostat、Theovent、T-Phyl、Unifyl、Uniphyl、Uniphyllin和Xanthium。茶碱的化学名为3，7-二氢-1，3-二甲基-1H-嘌呤-2，6-二酮或1，3-二甲基-黄嘌呤且其化学通式为C7H8N4O2。
氨茶碱茶碱衍生物，与茶碱乙二胺同义。氨茶碱为茶碱的衍生物，两者均为甲基黄嘌呤类并衍生于黄嘌呤。药物氨茶碱在结构上与茶碱稍有不同，它含有乙二胺和更多分子的水。氨茶碱比茶碱往往具较少的效能并且作用较短。其结构示于下面
茶碱从胃肠道充分吸收，生物利用度最高至90-100％。服药后1-2个小时达到峰水平，但是在有食物存在时减慢。茶碱有约60％血浆蛋白结合和平均分布容积为0.5l/kg。在婴儿和肝硬化患者中血浆蛋白结合减少。在成人，虽然存在个体间和个体内大的差异，茶碱的平均血浆半衰期约为8个小时，并且在约为30个小时龄的早产新生婴儿中也有很大的差异，在头6个月中为12个小时，直到出生的第一年为5个小时和直到20岁约为3.5个小时，其后再逐渐增加。由于茶碱的相对短的血浆半衰期，有许多商业上可获得的缓释制剂。所有这些都随它们的生物利用度和达峰血浆浓度的时间而变化(详见下文)。
茶碱主要在肝脏通过使用细胞色素P450系统进行去甲基化或氧化代谢。仅少量未经变化的被肾脏排泄，所以在肾衰竭患者中的剂量需要调整。然而，当使用其它的也是由细胞色素系统代谢的药物时，需要作出警告，此时需要在检测血浆水平下进行剂量调整。许多药物可影响茶碱的代谢。必须特别关注某些抗生素，因为气道阻塞的急性感染性加重的患者会被疏忽，而没有考虑对茶碱代谢的作用。包括大环内酯(如红霉素)和喹喏酮(如环丙沙星)家族的这些抗生素均使茶碱清除率不同程度下降。使茶碱清除率下降的其它药物包括西咪替丁、别嘌呤醇和普萘洛尔(虽然这将是相当不寻常的治疗组合)。增加茶碱代谢的药物包括利福平、苯巴比妥和特别是苯妥英和卡马西平，但不包括口服避孕药丸。茶碱的代谢率在吸烟者中(半衰期可减半)充分增加，尽管在少于10支/天的吸烟者中可无显著性。吸大麻具有如同食用高蛋白质膳食一样的相似作用。肝功能紊乱、心力衰竭和肺源性心脏病均降低茶碱的清除率，并且低白蛋白状态减少血液中蛋白质结合的药物的量，因此血浆水平的结果须小心阐释。因此，随着伴肺源性心脏病的心力衰竭或呼吸衰竭的患者的临床状态改善，茶碱的清除率改变和剂量的调整可为必须的。
甲基黄嘌呤甲基黄嘌呤化合物，包括茶碱和氨茶碱，具有通式 其中X表示氢、脂族烃基或-CO-NR3R4；R1、R2和R3表示脂族烃基；R4表示氢或脂族烃基和R3和R4与氮原子一起也可表示具有5至6元环的亚烷基亚氨基或吗啉代基团；和R5表示氢或脂族烃基。
所有这样的化合物均在的范围本发明内；然而，茶碱本身是特别优选的。
类固醇类固醇药物一般适合用于本发明。下面列出具体的类固醇。
通常吸入的类固醇包括·Pulmicort(布地奈德)
·Flovent(氟替卡松)·Asmanex(莫米他松)·Alvesco(环索奈德)·Aerobid(氟尼缩松)·Azmacort(曲安西龙)·Qvar(倍氯米松HFA)·类固醇也可以与包含β2肾上腺素能激动剂和/或毒蕈碱能拮抗剂的机制范围的长效支气管扩张剂的组合形式给予。包含在类固醇组合中的支气管扩张剂在同一分子中可具有β2肾上腺素能激动剂和毒蕈碱拮抗剂活性。
·Advair(Flovent和Serevent)注释Serevent是长效β-激动剂沙美特罗(salmeterol)。
·Symbicort(Pulmicort和Oxis)注释Oxis是长效β-激动剂福莫特罗(formoterol)。
普通类固醇丸剂和糖浆剂包括·Deltasone(泼尼松)·Medrol(甲泼尼龙)·Orapred、Prelone、Pediapred(泼尼松龙)布地奈德 化学名C25H34O6430.54(+)-[(RS)-16a，17a-亚丁基二氧基-11b，21-二羟基-1，4-孕二烯(pregnadiene)-3，20-二酮]
CAS登记号51333-22-3布地奈德最初由16a-羟基波尼松龙合成。独特的分子结构是其高的局部抗炎效能及相对低的潜在的全身副作用组合的关键。另外，布地奈德具有充分的水溶性，易于溶解于粘膜液体和具有脂溶性，被粘膜快速摄取。因为缩醛基团是不对称的，布地奈德以两种差向异构体(已知为22R和22S)的1∶1的混合物存在。
氟替卡松 商品名Cutivate、Flixonase、Flixotide、Flonase、Flovent、Flunase化学名(6(，11(，16(，17()-6，9-二氟代-11-羟基-16-甲基-3-氧代-17-(1-氧代丙氧基)雄甾-1，4-二烯-17-硫代羟酸S-(氟甲基)酯化学式C25H31F3O5SCAS号80474-14-2倍氯米松
化学名(11(，16()-9-氯-11，17，21-三羟基-16-甲基孕甾-1，4-二烯-3，20-二酮化学式C22H29ClO5CAS号4419-39-0商品名(不同的)Aerobec(二丙酸倍氯米松)、Aldecin(二丙酸倍氯米松)、Anceron(二丙酸倍氯米松)、Andion(二丙酸倍氯米松)、Beclacin(二丙酸倍氯米松)、Becloforte(二丙酸倍氯米松)、Beclomet(二丙酸倍氯米松)、Beclorhinol(二丙酸倍氯米松)、Becloval(二丙酸倍氯米松)、Beclovent(二丙酸倍氯米松)、Becodisks(二丙酸倍氯米松)、Beconase(二丙酸倍氯米松)、Beconasol(丙酸倍氯米松)、Becotide(丙酸倍氯米松)、Clenil-A(二丙酸倍氯米松)、Entyderma(二丙酸倍氯米松)、Inalone(二丙酸倍氯米松)、Korbutone(二丙酸倍氯米松)、Propaderm(二丙酸倍氯米松)、Qvar(二丙酸倍氯米松)、Rino-Clenil(二丙酸倍氯米松)、Sanasthmax(二丙酸倍氯米松)、Sanasthmyl(二丙酸倍氯米松)、Vancenase(二丙酸倍氯米松)、Vanceril(二丙酸倍氯米松)、Viarex(二丙酸倍氯米松)和Viarox(二丙酸倍氯米松)。
曲安西龙
商品名Aristocort、Aristospan、Azmacort、Kenalog Nasacort化学名(11(，16()-9-氟代-11，21-二羟基-16，17-[1-甲基亚乙基二(氧基)]孕甾-1，4-二烯-3，20-二酮化学式C24H31FO6CAS号76-25-5沙美特罗/Advair商品名*1-羟基-2-萘甲酸酯*1-羟基-2-萘甲酸酯Arial、Salmetedur、Serevent
化学名(()-4-羟基-(`-[[[6-(4-苯基丁氧基)己基]氨基]甲基]-1，3-苯二甲醇化学式C25H37NO4CAS号89365-50-4甲泼尼龙 化学名
(6(，11()-11，17，21-三羟基-6-甲基孕甾-1，4-二烯-3，20-二酮化学式C22H30O5CAS号83-43-2商品名Medrate、Medrol、Medrone、Metastab、Metrisone、Promacortine、Suprametil、Urbason泼尼松 商品名Ancortone、Colisone、Cortancyl、Dacortin、Deeortancyl、Decortin、Delcortin、Deltacortone、Deltasone、Deltison、Di-Adreson、Encorton、Meticorten、Nurison、Orasone、Paracort、Prednilonga、Pronison、Rectodelt、Sone、Ultracorten化学名17，21-二羟基孕甾-1，4-二烯-3，11，20-三酮化学式C21H26O5CAS号53-03-2制剂黄嘌呤衍生物诸如茶碱和氨茶碱可以以多种药物制剂包括缓释、透皮传递制剂、用于口服或吸入性(鼻)传递的制剂而可广泛地获得。同样地，类固醇药物可以以多种制剂而广泛地获得。在本文描述的实施例中所使用的制剂进一步描述如下，但是任何制剂均可用于本发明，使药物以所需的剂量传递至患者。
总之，药物制剂可为经口服、静脉、吸入、直肠或经皮给予的制剂。
对于依据本发明的应用的优选的组合物，可适合采取片剂、胶囊剂、颗粒剂、球体(spheroids)、粉剂或液体制剂的形式。
用于口服给药的片剂和胶囊剂可通过常规技术用药学上可接受的赋形剂诸如粘合剂、填充剂、滑润剂、崩解剂、润湿剂、着色剂和矫味剂制备。片剂可依据本领域熟悉的方法包衣。
优选地，依据本发明制备或使用的组合物以剂量单位形式，如以片剂或装填的胶囊剂形式存在。另外，可以想象的是活性物质以控释形式存在。
包含在控释基质中的适合的原料包括，例如(a)亲水的或疏水的聚合物，诸如树胶、纤维素酯、纤维素醚、衍生自蛋白质的原料、尼龙、丙烯酸树脂、聚乙酸、聚乙烯氯、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素乙酸邻苯二甲酸酯。这些聚合物中，纤维素醚特别是取代的纤维素醚诸如烷基纤维素(诸如乙基纤维素)、C1-6羟烷基纤维素(诸如羟丙基纤维素和特别是羟乙基纤维素)和丙烯酸树脂(例如异丁烯酸酯类诸如甲基丙烯酸共聚物)是优选的。控释基质可便利地包含1％至80％重量的亲水的或疏水的聚合物。
(b)可消化的、长链(C8-C50，特别是C8-C40)、取代的或未取代的烃，诸如脂肪酸、氢化植物油，诸如Cutina(商标)、脂肪醇(诸如十二醇、十四醇、十八醇、十六醇或优选十六醇十八醇混合物)、脂肪酸的甘油基酯例如单硬脂酸甘油基酯矿物油和蜡类(诸如蜂蜡、乙二醇蜡(glycolwax)、蓖麻(caster)蜡或巴西棕榈蜡)。具有20℃至90℃熔点的烃类是优选的。这些长链烃原料中，脂肪(脂肪族)醇是优选的。基质可包含最多至60％重量的至少一种可消化的长链烃。
(c)聚亚烷基二醇。基质可包含最多至60％重量的至少一种聚亚烷基二醇。
含控释基质的药物可易于通过采用常规制药技术诸如湿法制粒、干混、干法制粒或共沉淀(coprecipitation)，使活性成分分散至控释系统中制备。
本发明的药物可以吸入的形式给予。例如，通过压力驱动的喷射雾化器或超声波雾化器可产生气雾剂，但是，有利地是，通过抛射剂驱动的计量定量气雾剂(metered aerosols)或无抛射剂的从吸入用胶囊剂给予微粉化的活性化合物。
如所描述的依靠所用的吸入器系统给予活性化合物，除了活性化合物，给药形式还包含必需的赋形剂，诸如，例如，抛射剂(如在计量定量气雾剂中的氟利根)、表面活性物质、乳化剂、稳定剂、防腐剂、矫味剂、填充剂(如粉末吸入剂中的乳糖)或者，如果适当，其它的活性化合物。
为了吸入的目的，可用到大量装置，通过所述装置可产生最适宜的颗粒大小的气雾剂，并且可采用适合于患者的吸入技术给予。除了使用适配器(adaptors)(贮雾器(spacers)、发泡器(expanders))和梨形容器(如Nebulator、Volumatic)，和发射吹气喷雾的自动装置(Autohaler)，对于计量定量气雾剂，特别是在粉末吸入剂的情况下，可用到大量技术方案(如Diskhaler、Rotadisk、Turbohaler或例如在欧洲专利申请EP 0 505 321中描述的吸入器(inhalers))。
由本发明治疗的呼吸道疾病特别包括变态反应原和炎症引起支气管疾病(支气管炎、阻塞性支气管炎、痉挛性支气管炎、变态反应性支气管炎、变态反应性哮喘、支气管性哮喘、囊性纤维化和COPD)，它们可通过依据本发明的联合用药治疗。本发明的协同联合治疗在长期疗法中特别需要，因为比在常规单药疗法(monotherapies)中需要较低量的药物。
1.材料所用化合物购自外部供应商。羧甲基纤维素(CMC)(钠盐)(产品编码C-4888)得自Sigma。磷酸盐缓冲盐水(PBS)得自Gibco。无菌盐水(0.95w/v NaCl)和Euthatal(戊巴比妥钠)分别得自Fresenius Ltd.和the Veterinary Drug Company。脂多糖(来自绿脓杆菌)得自Sigma。
使用购自Institute of Tobacco Research，University of Kentucky，USA.的1R1牌香烟产生烟草吸食。
动物雌性近亲繁殖的AJ小鼠(在使用的最初那天的体重17.2-27.4g)得自Harlan，完全圈养并在收到时证明没有指定的微生物。将小鼠笼养在单独通风的、聚碳酸酯实心底的用8级白杨木片垫底(with grade8 aspen chip bedding)的笼(IVC)中，每笼最多5只。经IVC系统(Techniplast)控制笼中环境(气流、温度和湿度)。随意提供食物(RM 1，Special Diet Services)和水。用独特的颜色“派通(pentel)”笔在尾上作标记以识别各个动物，称重并随机分配至各治疗组。
2.配制取所需量的化合物置入研钵中。缓慢加入所需体积的一半的CMC以形成细的糊，然后将其小心加回容器中。用需要达到所需剂量的剩余体积的CMC清洗研钵，将清洗液加回容器中。对于联合给药，每一化合物以所需终浓度的两倍进行配制和将相等体积的每一化合物加在一起。
配制频度每天在p.o.给药前新鲜配制化合物。溶媒(0.5甲基纤维素的水溶液)每3天新鲜配制并以若干等份于4℃贮存。这些等份的溶媒在配制化合物前温至室温。
3.0方法之前的研究已确定，11天连续的每天TS暴露的末次TS暴露后24h的BAL中回收的细胞总数量显著增加，这个时间点用于此报告的研究中。之前的研究已经显示，用0.3μg的LPS鼻内激发后24h达到BAL嗜中性粒细胞数峰值。在此报告的研究中，采用LPS的这个剂量和这个时间点。对照动物鼻内接受磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
小鼠暴露于TS或LPS的实验方案，获得支气管肺泡灌洗术(BAL)，用于不同的细胞计数的细胞离心涂片器的载玻片的制备概述如下。
动物连续11天每天暴露于TS在这个暴露实验方案中，小鼠以每组5只在单个透明的聚碳酸酯小室(27cm×16cm×12cm)中暴露。允许来自香烟的TS以100ml/min的流速进入暴露小室。为了将任何由重复暴露于高水平的TS(6支香烟)而引起的可能的问题减到最少，在暴露期小鼠对TS的暴露逐渐增加至最多6支香烟。用于这个研究的暴露进度表如下天12支香烟 (约16min暴露)天23支香烟 (约24min暴露)天34支香烟 (约32min暴露)天45支香烟 (约40min暴露)天5至116支香烟 (约48min暴露)另一组小鼠每天(on a daily basis)暴露于空气等长时间作为对照(无TS暴露)。
LPS激发鼻内激发前约3min，通过吸入异氟磷引起麻醉。向每只小鼠滴注50μl的溶媒(PBS)或LPS。LPS浓度为6μg/ml(每只小鼠0.3μg)。使动物于37℃温箱中苏醒，然后返回饲养笼中。
支气管肺泡灌洗术(bronchoalveolar lavage)和细胞离心涂片器(cytospin)分析支气管肺泡灌洗术实施如下用缩短至约8mm的Portex尼龙静脉内套管((粉红流尔式针座(pink luer fitting))将导管插入气管。使用包含肝素(10单位/ml)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为灌洗液。轻轻滴注0.4ml的体积和用1ml的注射器回抽3次，然后置于Eppendorf管中并且在冰上保存直到随后的检测。
细胞计数通过离心使灌洗液分离出细胞，轻轻倒出上清液并冷冻用于随后的分析。使细胞沉淀(pellet)再悬浮于已知体积的PBS中，通过使用血球计在显微镜下计数染色(Turks着色剂)的等分试样，计算总细胞数量。
分类细胞计数实施如下将剩余的细胞沉淀稀释至每ml约105个细胞。将500μl体积移入细胞离心涂片器载玻片的浅窝(funnel)中并于800rpm离心8min。使载玻片风干和用′Kwik-Diff溶液(Shandon)染色，按照专利说明书使用。当干燥和盖上盖玻片时，使用光学显微镜计数不同的细胞。使用光学显微镜，通过无偏差的操纵器(un biased operator)，计数到最多至400个细胞。采用标准形态度量技术进行细胞分类。
口服给药后的A/J小鼠茶碱血浆水平的药物动力学评价动物经称重和标记并以或者3、1或者0.3mg/kg p.o.给予茶碱(5ml/kg)。在口服给予茶碱后指定的时间间隔(15、30、60或240分钟)内，在间隔末麻醉动物并用含20U肝素锂的5μl的注射器经心脏穿刺收集血液。将收集血液进行混合和轻轻移入eppendorf管中，于微型超速离心机(microfuge)中离心。收集血浆并储存于-80℃，后用HPLC/MS/MS方法分析。用于检测血浆水平的设备为MicromannQuatro Micro Mass Spectrometer(Micromass UK Limited)和Waters2795 Alliance HT液相色谱(Waters USA)。
用掺加示踪剂的(spiking)小鼠血浆与溶解于甲醇的备用浓度的茶碱，制备六个参比标准浓度。茶碱于小鼠血浆的终浓度从0.1至6mg/l。通过将200μl的乙腈(含0.25mg/l右啡烷(dextrorphan)作为内标)加至每一份50μl解冻的样本和标准品中并剧烈混合，制备用于分析的样本。然后将每一份样本和标准品于10000g离心2分钟病移出上清液用于LC-MS/MS分析。
使用反相HPLC串联质谱检测(LC-MS/MS)，进行茶碱和右啡烷的分析。在Multiple Reaction Monitoring模型中，使用Micromass QuatroMicro Mass Spectrometer结合Micromass MassLynx软件版本4.0，监测母体化合物和特殊的片段产品的阳离子。将每一份样本和标准品的25μl的等分试样进样到液相色谱系统中。
3.1处理方案在TS研究中，11天中的每天，动物在吸烟暴露1个小时前和6个小时后(-1h和+6h)，口服溶媒(1％羧甲基纤维素)、PDE4抑制剂(3mg/kg)、茶碱(0.3mg/kg)、地塞米松(0.3mg/kg)或茶碱/地塞米松组合(分别以3和0.3mg/kg)。另外，接受类固醇或类固醇组合的动物在首次TS暴露前20h给予类固醇。对照组的小鼠(假吸烟(shams))在第1天至第11天每天接受溶媒并暴露于每天最大量的空气50分钟。BAL在第12天，第十一次和末次TS暴露后24h实施。
在LPS研究中，在i.n.滴注LPS的20和1个小时前和6个小时后，口服给予动物溶媒(1％羧甲基纤维素)、地塞米松(0.3mg/kg)、茶碱(0.3mg/kg)。
在PK研究中，只给予小鼠3、1或0.3mg/kg茶碱，在15、30、60或240分钟后处死动物和提取血浆样本。
3.2数据测量和统计学分析所有结果以每一只动物的单个数据点形式呈现，针对每一组计算平均值。
由于正态检验是阳性的，对数据进行单因素方差分析检验(ANOVA)，之后进行邦弗朗尼更正(Bonferroni correction)用于多因素比较以检验各治疗组之间的显著性。＜0.05的“p”值被认为在统计上有显著意义。对于细胞数据，用下列公式在Excel电子数据表中自动计算出百分抑制
其它参数的抑制数据使用上式手工计算。
4.0结果4.1由连续11天每天暴露于TS(末次暴露后24h)引起的支气管肺泡灌洗术中的炎性反应在本研究中，连续11天每天暴露于TS，在末次暴露后24h引起炎性反应。这与暴露于空气(假吸烟)中的动物相比，被认为显著的增加支气管肺泡灌洗液(BAL回收自BAL液)中的嗜中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性细胞、淋巴细胞和上皮细胞(均为p＜0.01)。巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性细胞和淋巴细胞的增加说明细胞流入，而BAL上皮细胞增加或许为这些细胞的减少的粘附的指征。
4.2茶碱、地塞米松和茶碱/地塞米松组合对支气管肺泡灌洗术中由连续11天每天暴露于TS(末次暴露后24h)引起的炎性反应的作用数组小鼠在11天中的每天暴露的1h前和6h后经口服给予或者溶媒或者PDE4抑制剂、茶碱、地塞米松和以下二者之一的茶碱/地塞米松组合(茶碱3mg/kg+地塞米松0.3mg/kg每天两次或茶碱1mg/kg+地塞米松0.3mg/kg每天两次)处理。在末次暴露于TS/空气后24h处死动物。实施BAL并计数回收的总细胞的数量。数据以单个点的呈现并显示出平均值。数据来自每组9-10只动物。用ANOVA进行统计学分析。＜0.05的“p”值被认为在统计上有显著意义，ns＝在统计上没有显著意义。
当在每天暴露于TS的1h前和6h后口服给予或者茶碱(3mg/kg)或者地塞米松(0.3mg/kg)11天，均不显著减少BAL中回收的总细胞的数量。在任何特殊的细胞类型中，未见在统计上有显著意义减少作用。
相反，在每天暴露于TS的1h前和6h后口服给予茶碱(3mg/kg)/地塞米松(0.3mg/kg)组合11天，显著抑制BAL中回收的63％的总细胞数量(p＜0.001)。这个对于总细胞数的作用分别包括抑制77％、60％和66％的巨噬细胞、上皮细胞和嗜中性粒细胞(均为p＜0.05)。在淋巴细胞或嗜酸性细胞的剂量上，均未见在统计上有显著意义的减少作用。
当在每天暴露于TS的1h前和6h后口服给予较低剂量的茶碱和地塞米松(分别为1和0.3mg/kg)组合11天时，显著抑制BAL中回收的47％的总细胞数量(p＜0.001)。这包括分别抑制59％和66％的巨噬细胞、上皮细胞和嗜中性粒细胞(均为p＜0.05)。未见在统计上有显著意义的上皮细胞、淋巴细胞或嗜酸性细胞的减少。
抑制的程度和显著性概述于表1中且各数据示于图1-4中。
4.3茶碱和地塞米松对于在支气管肺泡灌洗术中由单次LPS激发引起的炎性反应(激发24h后)的作用在LPS激发(0.3μg)的20和2h前和6h后，小鼠经口服溶媒、茶碱或地塞米松处理。LPS激发24h后处死动物。实施BAL并计数回收的总细胞的数量。数据以各个点呈现并显示出平均值。数据来自每组9-10只动物。用ANOVA进行统计学分析。＜0.05的“p”值被认为在统计上有显著意义，ns＝在统计上没有显著意义。
LPS经鼻内给予A/J小鼠导致激发后24h的BAL中回收的总细胞的数量增加(p＜0.01)。此细胞的增加完全为嗜中性粒细胞。当于LPS激发的-20、-1和6h后口服给予地塞米松(0.3mg/kg)时，显著减少BAL中的总细胞(68％，p＜0.01)和嗜中性粒细胞(71％，p＜0.001)。各结果示于图7和8中。
4.4药物动力学分析将茶碱经口服给予A/J小鼠后，检测所有给药剂量的血浆水平。茶碱口服给药后的血浆水平于15至60分钟达峰，其后水平下降。3mg/kg剂量(3.66±2.64mg/l)茶碱的峰水平于给药后30分钟出现。对于所有动物在所有时间点，在这个剂量的药物血浆水平保持低于5mg/l，除了在30分钟时间点(6.7mg/l)。在所分析的所有时间点，0.3和1mg/kg剂量的血浆浓度比1mg/l的少。数据概述于表2和图7中。
5.0讨论在本研究中，用类固醇进行每天治疗在本COPD的肺炎模型中没有任何抑制作用。这与在包括在本文报告的LPS模型的其它模型得到的数据相反。在此COPD模型中，茶碱也不能证明任何显著的抗炎活性。然而，当将化合物以和单独给予时同样的剂量共同给予(茶碱3mg/kg/地塞米松0.3mg/kg)时，可见显著的抗炎活性。在PK研究中，以3mg/kg剂量给予的茶碱的血浆水平，在所有评价的时间点都比5mg/l的低，提示在COPD模型中，茶碱在低于被认为对于抗炎效能是必需的那些血浆水平(10-20mg/l)的血浆水平时达到协同作用。尽管茶碱和地塞米松(3和0.3mg/kg)组合的优越抑制活性(＞60％)，相对于TS引起的巨噬细胞、上皮细胞和嗜中性粒细胞的增加，未见对嗜酸性细胞和淋巴细胞的增加有在统计上有显著意义抑制作用。所见的使用该组合的抑制水平提示，真实的协同作用已经由共同给予所述化合物揭示。这进一步使较低剂量的茶碱(1mg/kg)与地塞米松(0.3mg/kg)组合的所见效能再增强，这个组合还对TS引起的巨噬细胞(59％)和嗜中性粒细胞(66％)的增加具显著的抑制活性。1mg/kg茶碱的血浆水平在所有评价的时间点均保持在1mg/l水平以下，再次提示低于那些对于效能正常必需的血浆水平可能揭示类固醇活性。
将LPS鼻内单次性给予A/J小鼠导致激发后24h肺性嗜中性粒细胞增多症。与亚慢性TS模型相反，用地塞米松处理显著减少LPS引起的肺炎证明类固醇对这个模型敏感。茶碱在试验的剂量水平没有活性。
这些数据证明类固醇对小鼠亚慢性TS模型不敏感，此外，加强治疗剂量的类固醇与非活性剂量茶碱联合的协同作用作为用于COPD的治疗范例。严格地，这个作用是在低于那些与抗炎活性关联的正常血浆水平的血浆水平达到的。
表1茶碱、地塞米松和茶碱/地塞米松组合对于每天暴露连续11天后24h所见的TS引起的炎症的作用
n.s.无显著性+表示有效由于正态检验是阳性的，对数据进行单因素方差分析检验(ANOVA)，之后进行邦弗朗尼更正用于多因素比较以检验各处理组之间的显著性。＜0.05的“p”值被认为在统计上有显著意义。
表2 口服给药后A/J小鼠的茶碱血浆水平(mg/l)
数据以平均值±标准差表示。
权利要求
1.甲基黄嘌呤化合物和类固醇在制备用于治疗慢性呼吸道疾病的组合物中的应用，其中所述甲基黄嘌呤化合物以在独立给予时对治疗所述呼吸道疾病无效的剂量给予。
2.依据权利要求1的应用，其中所述类固醇以在独立给予时对减轻与呼吸道疾病相关的炎症无效的剂量给予。
3.依据权利要求2的应用，其中所述类固醇以在独立给予时，对在治疗所述呼吸道疾病中肺功能和炎症的改善具最小效果的剂量给予。
4.依据权利要求1或权利要求2的应用，其中所述甲基黄嘌呤化合物和类固醇协同作用以治疗所述呼吸道疾病的炎症。
5.依据任一项前述权利要求的应用，其中所述甲基黄嘌呤化合物和/或类固醇通过选自吸入、注射、口服给药的途径和采用长效释放植入剂给予。
6.依据权利要求4的应用，其中所述甲基黄嘌呤化合物和类固醇由相同的途径给予。
7.一种为单位剂量形式的药用组合物，所述组合物包含甲基黄嘌呤化合物和类固醇，其中甲基黄嘌呤化合物的剂量如果独立给予则不足以有效治疗呼吸道疾病。
8.依据权利要求7的药用组合物，其中所述类固醇以在独立给予时不足以显示其在治疗呼吸道疾病中的抗炎活性的剂量给予。
9.依据权利要求6或权利要求7的药用组合物，其中所述治疗是减少呼吸道疾病中的炎症，由此抗炎作用可导致患者健康状况的改善。
10.一种用于治疗呼吸道疾病的药剂盒，所述药剂盒包含为单位剂量形式的甲基黄嘌呤化合物和类固醇，其中所述甲基黄嘌呤化合物以在独立给予时不足以有效治疗呼吸道疾病的剂量提供。
11.一种依据权利要求9的药剂盒，其中所述类固醇以在独立给予时不足以显示其在治疗呼吸道疾病中的抗炎活性的剂量提供。
12.同时地，分开同时地或序贯地用于治疗呼吸道疾病的单位剂量形式的甲基黄嘌呤化合物和类固醇，其中所述甲基黄嘌呤化合物以在独立给予时不足以有效治疗呼吸道疾病的剂量提供。
13.同时地，分开同时地或序贯地用于治疗呼吸道疾病的单位剂量形式的甲基黄嘌呤化合物和类固醇，其中所述甲基黄嘌呤化合物和类固醇以在独立给予时不足以显示它们在治疗呼吸道疾病中的抗炎活性的剂量提供。
14.依据任何权利要求1至13中任一项的本发明，其中所用的甲基黄嘌呤化合物的剂量达到的血浆水平低于临床效能所需的血浆水平(＜5mg/L)。
15.依据权利要求1至14中任一项的本发明，其中通过吸入所给予的甲基黄嘌呤化合物的剂量低于临床效能所需的剂量(30mg至500mg)。
16.依据权利要求1至15中任一项的本发明，其中类固醇的剂量为或者次最佳或者不能显示抗炎活性的临床上使用的剂量。
17.依据权利要求16的本发明，其中所述类固醇为布地奈德，其或者单独给予或者与支气管扩张剂联合给予，且每天给药两次，剂量分别为400μg或800μg。
18.依据任一项前述权利要求的本发明，其中所述呼吸道疾病的治疗是通过对支气管肺泡灌洗液中的细胞计数或经支气管肺泡灌洗术产生的痰或支气管活组织检查中的细胞计数来评价的。
19.依据权利要求18的本发明，其中所述细胞选自巨噬细胞、上皮细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性细胞和淋巴细胞。
20.依据权利要求18或权利要求19的本发明，其中所述细胞计数在给予甲基黄嘌呤化合物和类固醇后减少了50％或更多。
21.依据权利要求20的本发明，其中所述细胞计数在给予甲基黄嘌呤化合物和类固醇后减少了70％或更多。
全文摘要
本发明提供甲基黄嘌呤化合物和类固醇在协同联合治疗呼吸道疾病的协同组合中的应用，其中所述甲基黄嘌呤化合物以在独立给予时对治疗所述疾病无效的剂量给予。
文档编号A61K31/573GK101035538SQ200580033604
公开日2007年9月12日 申请日期2005年8月3日 优先权日2004年8月5日
发明者C·福克斯, H·芬奇, M·费茨格拉尔德 申请人:阿根塔发明有限公司