拮抗白介素－21受体活性的制作方法

专利名称：拮抗白介素－21受体活性的制作方法
专利说明拮抗白介素-21受体活性 本申请要求于2004年8月5日申请的美国临时专利申请顺序号60/599,086和2004年12月23日申请的美国临时专利申请顺序号60/639,176的权益，这两份临时申请的全部公开内容都通过引用全部结合到本文中。
背景技术：
发明领域本发明涉及将IL-21受体拮抗剂用于拮抗、降低和/或抑制白介素-21(IL-21)/IL-21受体(MU-1)活性的方法和组合物。本文所公开的方法和组合物可用作免疫治疗药。
相关的
背景技术：
人IL-21是一种细胞因子，其序列与IL-2、IL-4和IL-15同源(Parrish-Novak等(2000)Nature 40857-63)。尽管白介素细胞因子间序列同源性低，但是细胞因子全都折叠成为该家族中具有代表性的“四螺旋束(four-helix-bundle)”结构。大多数细胞因子可与I类或II类细胞因子受体结合。II类细胞因子受体包括IL-10受体和干扰素受体，而I类细胞因子受体包括IL-2至IL-7、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13和IL-15的受体，以及造血生长因子受体、瘦蛋白受体和生长激素受体(Cosman(1993)Cytokine 595-106)。
人IL-21受体(IL-21R)是淋巴组织、尤其是NK、B和T细胞所表达的I类细胞因子受体(Parrish-Novak等(2000)，出处同上)。编码人白介素-21(IL-21)及其受体(IL-21R)的核苷酸序列和氨基酸序列描述于WO 00/53761；WO 01/85792；Parrish-Novak等(2000)，出处同上；和Ozaki等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9711439-44。IL-21R与IL-2受体β链和IL-4受体α链具有最高同源序列(Ozaki等(2000)，出处同上)。一旦配体结合，IL-21R与共同的γ细胞因子受体链(γc)缔合，IL-2、IL-3、IL-4、IL-7、IL-9、IL-13和IL-15的受体都可共享该受体链(Ozaki等(2000)，出处同上；Asao等(2001)J Immunol.1671-5)。IL-21R在淋巴中广泛分布，提示IL-21在免疫调节中可能具有作用。实际上，体外研究已经知道，IL-21明显能调节B细胞、CD4+和CD8+T细胞和NK细胞的功能(Parrish-Novak等(2000)，出处同上；Kasaian等(2002)Immunity.16559-69)。然而，支持IL-21体内调节作用的证据却很有限。
发明概述 本文公开了干扰白介素-21(IL-21)和IL-21受体(在本文中亦称“IL-21R”或“MU-1”)活性和/或相互作用的方法和组合物，例如使用IL-21拮抗剂或IL-21R拮抗剂(在本文中亦称“IL-21/IL-21R拮抗剂”或“拮抗剂”或“IL-21/IL-21R途径拮抗剂”)。
例如，申请人已经知道，通过使用IL-21拮抗剂(例如包含与Fc免疫球蛋白区融合的IL-21R胞外域的融合蛋白)，降低IL-21R活性，在一些动物模型中改善了炎性症状，所述模型能合理地预测炎性疾病和/或自身免疫性疾病，例如炎性肠病(EBD)、类风湿性关节炎(RA)、移植/移植排斥、移植物抗宿主病、哮喘、系统性红斑狼疮(SLE)(包括肾小球肾炎形式)和银屑病(实施例7-14)。在胶原诱发关节炎(CIA)小鼠脚爪中，IL-21R mRNA的表达被上调(实施例8)。此外，在哮喘模型中，IL-21R缺陷型小鼠表现出症状减轻(实施例12)。因此，IL-21/IL-21R拮抗剂的活性可用于在体内诱导免疫抑制，例如用于治疗或预防炎性疾病或自身免疫性疾病。这些拮抗剂也可用于治疗或预防免疫细胞相关疾病，例如与一种或多种成熟T细胞(例如成熟CD8+或成熟CD4+T细胞)、成熟NK细胞、B细胞、巨噬细胞和巨核细胞异常活性相关的疾病。
因此，一方面，本发明的特征在于治疗(例如治愈、抑制、延迟)、改善(例如减轻、缓解、降低、减少)患者的炎性疾病或自身免疫性疾病和/或预防(例如预防其发作或预防其复发或恶化)的方法。所述方法包括给予患者IL-21/IL-21R拮抗剂，例如其用量足以治疗、改善或预防该病，或者其用量足以抑制或降低免疫细胞活性和/或细胞数。
IL-21/IL-21R拮抗剂可以单独给予患者，或者与IL-21/IL-21R拮抗剂联用，或者与本文所述的其它治疗性形式联用。优选患者是罹患炎性疾病或自身免疫性疾病或处于其危险之中的哺乳动物，例如人。例如，所述方法可用于治疗或预防患者的炎性疾病或自身免疫性疾病。这样的疾病的实例包括但不限于移植排斥；糖尿病(例如I型)；多发性硬化；关节炎(例如类风湿性关节炎(RA)、青少年类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病性关节炎或关节强硬性脊椎炎(优选RA))；重症肌无力；脉管炎；系统性红斑狼疮(SLE)；肾小球肾炎；自身免疫性甲状腺炎；皮肤炎性疾病(例如皮炎(包括特应性皮炎和湿疹性皮炎)、硬皮病或银屑病)；红斑狼疮；纤维化或纤维变性病(例如肺纤维化或肝纤维化)；呼吸性疾病(例如哮喘或COPD)；特应性疾病(例如包括变态反应)；或肠道炎性疾病(例如IBD，例如节段性回肠炎(Crohn’s disease)或溃疡性结肠炎)。
优选使用本发明的IL-21或IL-21R拮抗剂治疗以下疾病红斑狼疮、皮肤炎性疾病(例如银屑病)、肠道炎性疾病(例如IBD、节段性回肠炎、溃疡性结肠炎)、移植排斥、哮喘、特应性疾病或类风湿性关节炎。
在一个实施方案中，IL-21/IL-21R拮抗剂影响IL-21或IL-21R(例如与其结合)，优选哺乳动物(例如人)的IL-21或IL-21R(在本文中分别称为“IL-21拮抗剂”和“IL-21R拮抗剂”)，并且降低或抑制一种或多种IL-21和/或IL-21R活性。优选的拮抗剂以高亲和力结合IL-21或IL-21R，例如亲和常数至少约107M-1，优选约108M-1，更优选约109M-1至1010M-1或更强。
例如，IL-21/TL-21R拮抗剂可通过中和IL-21而减少和/或抑制IL-21R活性。在一个实施方案中，拮抗剂可以是融合蛋白，其包含IL-21R片段与非IL-21R片段(例如免疫球蛋白Fc区)。在其它实施方案中，拮抗剂是抗IL-21R抗体或抗IL-21抗体或其抗原结合片段、可溶性形式的IL-21受体、肽或小分子抑制剂。
在一个实施方案中，IL-21/IL-21R拮抗剂是抗IL-21R抗体或抗IL-21抗体或其抗原结合片段；例如抗体是单克隆抗体或单特异性抗体，所述抗体能结合IL-21(例如人IL-21)或IL-21受体(例如人IL-21受体多肽或其抗原结合片段(例如Fab、F(ab′)2、Fv或单链Fv片段))。优选的抗体为针对人IL-21或人IL-21受体多肽的人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或体外产生的抗体。优选的抗体是中和抗体。
在其它实施方案中，IL-21/IL-21R拮抗剂包含全长IL-21多肽或其片段，例如IL-21多肽的抑制性IL-21受体结合域，例如人IL-21多肽(例如具有示于SEQ ID NO19的氨基酸序列的本文所述的人IL-21多肽)或者与它们具有至少85％、90％、95％、98％或更高同一性的序列；或者由示于SEQ ID NO18的相应核苷酸序列或与它们具有至少85％、90％、95％、98％或更高同一性的序列所编码。或者，拮抗剂包括全长(例如SEQ ID NO2的约氨基酸1-538或20-538；或者SEQ ID NO10的约氨基酸1-529或20-529)，或者IL-21受体多肽片段，例如IL-21受体多肽的IL-21结合域，例如IL-21R可溶性片段(例如IL-21R片段，其包含鼠或人IL-21R胞外域；例如SEQ ID NO2(人)的约氨基酸1-235、1-236、20-235、20-236，或者SEQ ID NO10(鼠)的约氨基酸1-236、20-236，或者由SEQ ID NO1或SEQ ID NO9的相应核苷酸或与它们具有至少85％、90％、95％、98％或更高同一性的序列所编码。
在一个实施方案中，拮抗剂为融合蛋白，其包含前述IL-21或IL-21受体多肽或其片段，以及例如与其融合的第二部分，例如多肽(例如免疫球蛋白链、GST、Lex-A或MBP多肽序列)。在一个优选的实施方案中，融合蛋白包含至少能够结合IL-21的IL-21R多肽片段，例如IL-21R的可溶性片段(例如IL-21R片段，其包含鼠或人IL-21R胞外域，例如SEQ ID NO2(人)的约氨基酸1-235、1-236、20-235、20-236，或者SEQ ID NO10(鼠)的约氨基酸1-236、20-236，或由SEQ ID NO1或SEQ ID NO9的相应核苷酸或与它们具有至少85％、90％、95％、98％或更高同一性的序列所编码)，以及例如与其融合的第二部分，例如多肽(例如不同同种型的免疫球蛋白链、Fc片段、重链恒定区，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE)。例如，融合蛋白可包含人IL-21R胞外域，例如SEQ ID NO2的约氨基酸1-235、1-236、20-235、20-236，以及与其融合的人免疫球蛋白Fc链(例如人IgG，例如人IgG1，例如天然存在的人IgG1或突变形式的人IgG1)。在一个实施方案中，人Fc序列在一个或多个氨基酸上具有突变，例如在天然存在的SEQ ID NO28序列的残基254和257上突变，以减少Fc受体结合。在其它实施方案中，融合蛋白可包含鼠IL-21R胞外域(例如SEQ ID NO10(鼠)的约氨基酸1-236、20-235)，以及例如与其融合的鼠免疫球蛋白Fc链(例如鼠IgG，例如鼠IgG2a或鼠IgG2a突变形式)。
融合蛋白还可包含将第一部分(例如IL-21R片段)与第二部分(例如免疫球蛋白片段)连接的接头序列。在其它实施方案中，另外的氨基酸序列可添加到融合蛋白的N端或C端，以便于表达、空间柔性、检测和/或分离或纯化。
可用于本发明方法的拮抗性融合蛋白的实例见图7-15。在一个实施方案中，融合蛋白包含选自例如以下的氨基酸序列SEQID NO23、SEQ ID NO25、SEQ ID NO27、SEQ ID NO29、SEQ IDNO31、SEQ ID NO33、SEQ ID NO35、SEQ ID NO37或SEQ ID NO39，或者与它们具有至少85％、90％、95％、98％或更高同一性的序列。在其它实施方案中，融合蛋白包含选自例如以下的核苷酸序列所编码的氨基酸序列SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36或SEQ ID NO38，或者与它们具有至少85％、90％、95％、98％或更高同一性的序列。优选的融合蛋白具有示于SEQ ID NO25或SEQ ID NO29的氨基酸序列(分别见图8A-8C和

图10A-10C)，或者与它们具有至少85％、90％、95％、98％或更高同一性的序列。在其它实施方案中，融合蛋白包含选自例如以下的核苷酸序列所编码的氨基酸序列SEQ ID NO24或SEQ ID NO28(分别见图8A-8C和图10A-10C)，或与它们具有至少85％、90％、95％、98％或更高同一性的序列。最优选的融合蛋白具有示于SEQ ID NO29的氨基酸序列或者具有示于SEQ ID NO28的核苷酸序列所编码的氨基酸序列(图10A-10C)。
本文所述的IL-21/IL-21R拮抗剂，例如本文所述的融合蛋白可以衍生或与另一功能性分子(例如另一种肽或蛋白(例如Fab′片段)连接。例如，融合蛋白或抗体或抗原结合部分可以功能性连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其它方式)一种或多种其它分子实体，例如抗体(例如双特异性抗体或多特异性抗体)、毒素、放射性同位素、细胞毒性剂或细胞生长抑制剂等。
在一个实施方案中，本文所述的IL-21/IL-21R拮抗剂(例如其药物组合物)在联合疗法中与其它药物例如治疗药联合给予，所述治疗药可用于治疗例如选自以下的一种或多种炎性疾病或自身免疫性疾病关节炎(包括RA、青少年类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病性关节炎或关节强硬性脊椎炎)；SLE；肾小球肾炎；皮肤炎性疾病(例如银屑病)；呼吸性疾病(例如哮喘、COPD)；特应性疾病；纤维变性病(例如肺纤维化或肝纤维化)；肠道炎性疾病(例如IBD，例如节段性回肠炎或溃疡性结肠炎)；或移植排斥。例如，联合疗法可包含一种或多种IL-21/IL-21R拮抗剂(例如抗IL-21抗体或抗IL-21R抗体或其抗原结合片段；IL-21R融合蛋白；可溶性IL-21R受体；肽抑制剂或小分子抑制剂)与一种或多种其它治疗药一起配制和/或一起给予，所述其它治疗药例如本文所述的一种或多种细胞因子和生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎药、代谢抑制剂、酶抑制剂和/或细胞毒性剂或细胞生长抑制剂。
可以与一种或多种IL-21/IL-21R拮抗剂一起给予和/或一起配制的优选的其它治疗药的实例，包括但不限于一种或多种以下药物TNF拮抗剂(例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或体外产生的抗体或其抗原结合片段，它们能结合TNF；TNF受体的可溶性片段，例如p55或p75人TNF受体或其衍生物，例如75kdTNFR-IgG(75kDa TNF受体-IgG融合蛋白，ENBRELTM)、p55kDa TNF受体-IgG融合蛋白；TNF酶拮抗剂，例如TNFα转化酶(TACE)抑制剂)；IL-6、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-22的拮抗剂；T细胞和B细胞消耗剂(depleting agent)(例如抗CD4抗体或抗CD22抗体)；小分子抑制剂，例如甲氨蝶呤和来氟米特；西罗莫司(雷帕霉素)及其类似物，例如CCI-779；Cox-2和cPLA2的抑制剂；NSAID；p38抑制剂、TPL-2、Mk-2和NFκb的抑制剂；RAGE或可溶性RAGE；P-选择蛋白或PSGL-1的抑制剂(例如小分子抑制剂、其抗体，例如抗P-选择蛋白的抗体)；雌激素受体β(ERB)激动剂或ERB-NFκb拮抗剂。可以与一种或多种IL-21/IL-21R拮抗剂一起给予和/或一起配制的最优选的其它治疗药包括一种或多种以下药物TNF受体可溶性片段，例如p55或p75人TNF受体或其衍生物，例如75kdTNFR-IgG(75kDa TNF受体-IgG融合蛋白，ENBRELTM)；甲氨蝶呤、来氟米特或西罗莫司(雷帕霉素)或其类似物，例如CCI-779。
另一方面，提供了用于降低例如以下一种或多种免疫细胞的活性的方法成熟T细胞(成熟CD8+、CD4+、淋巴结T细胞、记忆T细胞)、成熟NK细胞、B细胞、抗原呈递细胞(APC)(例如树突细胞、巨噬细胞或巨核细胞)或细胞群体，例如混合或基本纯化的免疫细胞群体。该方法包括使免疫细胞接触足够量的IL-21/IL-21R拮抗剂，例如本文所述的拮抗剂，以降低免疫细胞活性。
另一方面，本发明的特征在于融合蛋白，它包含至少能够结合IL-21多肽的IL-21R多肽片段，例如IL-21R可溶性片段(例如包含鼠或人IL-21R胞外域的IL-21R片段；例如SEQ ID NO2(人)的约氨基酸1-235、1-236、20-235、20-236，或者SEQ ID NO10(鼠)的约氨基酸1-236、20-236，或者由SEQ ID NO1或SEQ ID NO9的相应核苷酸或与它们具有至少85％、90％、95％、98％或更高同一性的序列所编码)，以及例如与其融合的第二部分，例如多肽(例如不同同种型的免疫球蛋白链、Fc片段、重链恒定区，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE)。例如，融合蛋白可包含人IL-21R胞外域(例如SEQ ID NO2的约氨基酸1-235、1-236、20-235、20-236)，以及例如与其融合的人免疫球蛋白Fc链(例如人IgG，例如人IgG1或人IgG1的突变形式)。在一个实施方案中，人Fc序列已在一个或多个氨基酸上带有突变，例如在野生型序列SEQ IDNO28的残基254和257上带有突变，以减少Fc受体结合。在其它实施方案中，融合蛋白可包含鼠IL-21R胞外域(例如SEQ ID NO10(鼠)的约氨基酸1-236、20-236)以及例如与其融合的鼠免疫球蛋白Fc链(例如鼠IgG，例如鼠IgG2a或鼠IgG2a的突变形式)。融合蛋白还可包含将IL-21R片段与第二部分连接在一起的接头序列。在其它实施方案中，另外的氨基酸序列可添加在融合蛋白的N端或C端，以便于表达、检测和/或分离或纯化。
本发明的特征还在于编码本文所述融合蛋白的核酸序列。
另一方面，本发明的特征在于含有本发明核酸的宿主细胞和载体。优选宿主细胞为真核细胞(例如哺乳动物细胞、昆虫细胞或酵母细胞)或原核细胞(例如大肠杆菌(E.coli))。例如，哺乳动物细胞可以是培养的细胞或细胞系。示例性的哺乳动物细胞包括淋巴细胞系(例如NSO)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、COS细胞、卵母细胞和来自转基因动物的细胞，例如乳腺上皮细胞。例如，编码本文所述的融合蛋白的核酸可以在转基因动物中表达。在一个实施方案中，核酸处于组织特异性启动子(例如乳腺特异性启动子)的控制之下，并且抗体在转基因动物中产生。例如，融合蛋白分泌到转基因动物的乳汁中，例如转基因牛、猪、马、绵羊、山羊或啮齿动物的乳汁中。
另一方面，本发明提供融合蛋白例如本文所述的融合蛋白的制备方法。该方法包括(a)在合适培养基中培养本发明的宿主细胞和(b)从培养物中纯化融合蛋白。也提供了按此方法产生的蛋白质。
另一方面，本发明提供组合物例如药物组合物，它包含药学上可接受的载体和至少一种本文所述的IL-21/IL-21R拮抗剂(例如本文所述的融合蛋白)。在一个实施方案中，组合物例如药物组合物包含两种以上IL-21/IL-21R拮抗剂的组合。IL-21/IL-21R拮抗剂与药物(例如治疗药(例如一种或多种本文所述的细胞因子和生长因子的抑制剂、免疫抑制剂、抗炎药、代谢抑制剂、酶抑制剂和/或细胞毒剂或细胞生长抑制剂)或抗原(例如抗原性肽)和/或抗原呈递细胞的组合，也包括在本发明的范围之内。
在一个实施方案中，药物组合物包含IL-21/IL-21R拮抗剂和至少一种其它治疗药以及药学上可接受的载体。可以与一种或多种IL-21/IL-21R拮抗剂一起配制在组合物例如药物组合物中的优选的其它治疗药的实例包括但不限于一种或多种以下药物TNF拮抗剂(例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或体外产生的抗体或其抗原结合片段，它们可与TNF结合；TNF受体可溶性片段，例如p55或p75人TNF受体或其衍生物，例如75kdTNFR-IgG(75kDa TNF受体-IgG融合蛋白、ENBRELTM)、p55kDa TNF受体-IgG融合蛋白；TNF酶拮抗剂，例如TNFα转化酶(TACE)抑制剂)；IL-6、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-22的拮抗剂；T细胞和B细胞的消耗剂(例如抗CD4抗体或抗CD22抗体)；小分子抑制剂，例如甲氨蝶呤和来氟米特；西罗莫司(雷帕霉素)及其类似物，例如CCI-779；Cox-2和cPLA2抑制剂；NSAID；p38抑制剂、TPL-2、Mk-2和NFκb的抑制剂；RAGE或可溶性RAGE；P-选择蛋白或PSGL-1的抑制剂(例如小分子抑制剂，其抗体，例如抗P-选择蛋白的抗体)；雌激素受体β(ERB)激动剂或ERB-NFκb拮抗剂。可与一种或多种IL-21/IL-21R拮抗剂共同给予和/或一起配制的最优选的其它治疗药包括一种或多种以下药物TNF受体可溶性片段，例如p55或p75人TNF受体或其衍生物，例如75kdTNFR-IgG(75kDa TNF受体-IgG融合蛋白，ENBRELTM)；甲氨蝶呤、来氟米特或西罗莫司(雷帕霉素)或其类似物，例如CCI-779。
另一方面，本发明的特征在于治疗、改善或预防患者例如哺乳动物(例如人)的特应性疾病的方法。该方法包括给予患者IL-21/IL-21R拮抗剂，例如其用量足以治疗、改善或预防该病，或者其用量足以抑制或降低免疫细胞活性和/或细胞数。在一个实施方案中，特应性疾病是变应性哮喘。在另一个实施方案中，特应性疾病是特应性皮炎、荨麻疹、湿疹、变应性鼻炎或变应性肠胃炎。在一个实施方案中，IL-21/IL-21R拮抗剂可以与其它治疗药联合给予，所述治疗药例如细胞因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎药、酶抑制剂、白三烯拮抗剂、支气管扩张药、β2-肾上腺素受体激动剂、抗毒蕈碱药或肥大细胞稳定剂。可以与IL-21/IL-21R拮抗剂联合给予以治疗、改善或预防特应性疾病的优选治疗药的实例包括例如TNF拮抗剂、IL-6拮抗剂、IL-12拮抗剂、IL-15拮抗剂、IL-17拮抗剂、IL-18拮抗剂、IL-22拮抗剂、T细胞消耗剂、B细胞消耗剂、甲氨蝶呤、来氟米特、西罗莫司(雷帕霉素)或其类似物、Cox-2抑制剂、cPLA2抑制剂、NSAID和p38抑制剂。
另一方面，本发明的特征在于治疗、改善或预防患者的自身免疫性疾病的方法。该方法包括给予患者IL-21/IL-21R拮抗剂，例如其用量足以治疗、改善或预防该病，或者其用量足以抑制或降低免疫细胞活性和/或细胞数。在一个实施方案中，自身免疫性疾病是狼疮，例如SLE。在一个实施方案中，IL-21/IL-21R拮抗剂可以与其它治疗药联合给予，所述治疗药例如细胞因子抑制剂、生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎药、代谢抑制剂、酶抑制剂、细胞毒剂或细胞生长抑制剂。可以与IL-21/IL-21R拮抗剂联合给予以治疗、改善或预防自身免疫性疾病的优选治疗药的实例包括例如TNF拮抗剂、IL-6拮抗剂、IL-12拮抗剂、IL-15拮抗剂、IL-17拮抗剂、IL-18拮抗剂、IL-22拮抗剂、T细胞消耗剂、B细胞消耗剂、氯喹、羟氯喹、甲氨蝶呤、来氟米特、西罗莫司(雷帕霉素)或其类似物、Cox-2抑制剂、cPLA2抑制剂、NSAID和p38抑制剂。
另一方面，本发明的特征在于治疗、改善或预防患者的纤维变性病的方法。该方法包括给予患者IL-21/IL-21R拮抗剂，例如其用量足以治疗、改善或预防该病，或者其用量足以抑制或降低免疫细胞活性和/或细胞数。例如，患者可能罹患内脏纤维化(例如肝纤维化、肾纤维化或肺纤维化)、皮肤纤维化疾病或眼纤维化，或者处于其危险之中。
另一方面，本发明的特征在于将器官、组织或细胞移植给患者的方法。该方法包括给予患者IL-21/IL-21R拮抗剂，例如在移植之前、期间或之后。移植的器官和组织可以包括但不限于例如心脏、肾脏、肝脏、肺、胰脏、骨髓、软骨、角膜、神经元组织及其细胞。在一个实施方案中，IL-21/IL-21R拮抗剂与其它治疗药联合给予，所述治疗药例如细胞因子抑制剂、生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎药、代谢抑制剂、酶抑制剂、细胞毒剂和细胞生长抑制剂。可以与IL-21/IL-21R拮抗剂联用的优选治疗药的实例包括例如雷帕霉素、环孢菌素、抗CTLA-4抗体、抗CD40抗体、抗CD40L抗体和抗CD154抗体。
另一方面，本发明的特征在于移植受体的移植排斥症状或移植排斥相关疾病(例如纤维化或移植物抗宿主病(GVHD))的评价和治疗方法。该方法包括鉴别患者的移植排斥症状并给予IL-21/IL-21R拮抗剂，例如其用量足以治疗或改善移植排斥症状。移植排斥症状包括例如炎症、器官功能减退、异常活检和纤维化。在另一个实施方案中，本发明提供通过给予IL-21/IL-21R拮抗剂而预防(例如降低其危险)移植排斥或移植排斥相关疾病的方法。
另一方面，本发明的特征在于治疗、改善或预防患者的移植排斥或移植排斥相关疾病的方法。该方法的特征在于给予患者IL-21/IL-21R拮抗剂，其用量足以治疗或改善或预防(例如降低其危险)排斥，或者其用量足以抑制或降低免疫细胞活性和/或细胞数。移植器官或组织可以包括例如心脏、肾脏、肝脏、肺、胰脏和骨髓。在一个实施方案中，IL-21/IL-21R拮抗剂可以与其它治疗药联用，所述治疗药例如细胞因子抑制剂、生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎药、代谢抑制剂、酶抑制剂、细胞毒剂或细胞生长抑制剂。可以与IL-21/IL-21R拮抗剂联用以治疗、改善或预防移植排斥的优选治疗药的实例包括例如雷帕霉素、环孢菌素、抗CTLA-4抗体、抗CD40抗体、抗CD40L抗体和抗CD154抗体。
“MU-1”和“IL-21R”以及肽、多肽和蛋白质等术语在本文中可互换使用。
除非另有说明，否则本文所用的所有科技术语都具有本发明所属领域普通技术人员公认的含义。尽管方法与材料都类似于或等同于本发明实践和实验中所用的方法与材料，但是下面描述了合适的方法与材料。所有出版物、专利申请、专利和本文所提到的其它参考文献都通过引用全部结合到本文中。在有矛盾的情况下，本说明书，包括定义，将会作调整。此外，材料、方法和实施例仅为说明性的，而不是限制性的。
根据以下发明详述和所附的权利要求书，本发明的其它特征和优势将会是显而易见的。
附图简述 图1表示鼠IL-21R/MU-1的全长cDNA序列。该核苷酸序列对应于SEQ ID NO9的核苷酸1-2628。
图2A-2B表示鼠和人IL-21R/MU-1的氨基酸序列。图2A表示鼠IL-21R/MU-1的氨基酸序列(对应于SEQ ID NO10的氨基酸1-529)。在氨基酸1-19具有预测的前导序列(经SPScan预测)，其得分为10.1(粗体字)。SEQ ID NO10的氨基酸237-253为预测的跨膜域(下划线)。预测信号基序包括以下各区盒1氨基酸265-274，盒2氨基酸310-324(粗体+下划线)；六个酪氨酸位于SEQ ID NO10的氨基酸位置281、319、361、368、397和510。WSXWS基序(SEQ IDNO8)位于氨基酸残基214至氨基酸残基218(大号字+粗体)。潜在的STAT泊位(docking site)包括SEQ ID NO10的氨基酸393-398和氨基酸510-513。图2B表示人MU-1的氨基酸序列(对应于SEQ ID NO2)。标明了预测的信号序列(SEQ ID NO2的约氨基酸1-19)；WSXWS基序(SEQ ID NO2的约氨基酸213-217)；和跨膜域(SEQ ID NO2的约氨基酸236-252、236-253、236-254(下划线)。也标明了潜在的JAK结合位点、信号基序和STAT泊位。这些位点的大致位置都加了方框。
图3表示人与鼠MU-1 cDNA序列(分别对应于SEQ ID NO1的核酸1-2665和SEQ ID NO9的核酸1-2628)的GAP比较。HuMU-1＝人 MU-1，murMU-1＝鼠 MU-1。空位参数空位权重＝50，平均匹配＝10.000，长度权重＝3，平均错配＝0.000，％同一性＝66.116。
图4表示人MU-1蛋白(对应于SEQ ID NO2的氨基酸)与鼠MU-1蛋白(对应于SEQ ID NO10的氨基酸)的GAP比较。通过BLOSUM62氨基酸取代矩阵产生比对(Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8910915-19)。空位参数＝空位权重8，平均匹配＝2.912，长度权重＝2，平均错配＝-2.003；％同一性＝65.267。
图5表示人MU-1氨基酸(对应于SEQ ID NO2)、鼠MU-1氨基酸(对应于SEQ ID NO10)与人IL2β链氨基酸(GENBANK检索号M26062)的多序列比对。前导序列和跨膜区带有下划线。保守的细胞因子受体模块基序用粗体字表示。潜在的信号传导区用下划线+粗体字表示。
图6表示通过MU-1的信号传导。在Clone E7 EPO-MU-1嵌合体中，MU-1使STAT 5磷酸化。在实施例3的特定条件下，通过MU-1的信号传导导致在所有测试时间点都使STAT 5磷酸化。用IL-3处理对照或嵌合BAF-3细胞，引起STAT 3、而不是STAT 1或5的磷酸化。
图7A-7B表示人IL-21R单体(对应于SEQ ID NO2的氨基酸20-235)在其氨基端与蜜蜂前导序列和His6标记(SEQ ID NO23的氨基酸1-44)融合的核苷酸序列和氨基酸序列比对。该核苷酸序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO22和SEQ ID NO23。
图8A-8C表示人IL-21R胞外域(对应于SEQ ID NO2的氨基酸1-235)在其C-端通过接头(对应于SEQ ID NO25的氨基酸236-243)与人免疫球蛋白G1(IgG1)Fc序列(对应于SEQ ID NO25的氨基酸244-467)融合的核苷酸序列和氨基酸序列比对。该核苷酸序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO24和SEQ ID NO25。
图9A-9C表示人IL-21R胞外域(对应于SEQ ID NO2的氨基酸1-235)在其C-端通过接头(对应于SEQ ID NO27的氨基酸236-243)与人免疫球蛋白G1(IgG1)Fc序列(对应于SEQ ID NO27的氨基酸244-467)以及His6序列标记(对应于SEQ ID NO27的氨基酸468-492)融合的核苷酸序列和氨基酸序列比对。该核苷酸序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO26和SEQ ID NO27。
图10A-10C表示人IL-21R胞外域(对应于SEQ ID NO2的氨基酸1-235)在其C-端通过接头(对应于SEQ ID NO29的氨基酸236-243)与人免疫球蛋白G1(IgG1)Fc突变序列(对应于SEQ ID NO29的氨基酸244-467)融合的核苷酸序列和氨基酸序列比对。人Fc序列在野生型序列的残基254和257带有突变，以减少Fc受体结合。该核苷酸序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO28和SEQ ID NO29。
图11A-11B表示人IL-21R胞外域(对应于SEQ ID NO2的氨基酸1-235)在其C-端与视紫红质序列标记融合的核苷酸序列和氨基酸序列比对。该核苷酸序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO30和SEQ ID NO31。
图12A-12C表示人IL-21R胞外域(对应于SEQ ID NO2的氨基酸1-235)在其C-端与EK切割位点和突变IgG1 Fc区(对应于SEQ ID NO33的氨基酸236-470)融合的核苷酸序列和氨基酸序列比对。该核苷酸序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO32和SEQ IDNO33。
图13A-13B表示鼠IL-21R胞外域在其C-端与小鼠免疫球蛋白G2a(IgG2a)融合的核苷酸序列和氨基酸序列比对。该核苷酸(基因组)序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO34和SEQ ID NO35。
图14A-14B表示鼠IL-21R胞外域在其C-端与Flag和His6序列标记融合的核苷酸序列和氨基酸序列比对。该核苷酸(基因组)序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO36和SEQ ID NO37。
图15A-15B表示(蜜蜂前导序列)鼠IL-21R胞外域在其C-端与Flag和His6序列标记融合的核苷酸序列和氨基酸序列比对。该核苷酸(基因组)序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO38和SEQ IDNO39。
图16为用胶原诱发关节炎(CIA)小鼠模型进行实验的预防性、治疗性和半治疗性治疗方案的总时间表。
图17是曲线图，表示MuIL-21RFc(200μg/小鼠，3次/周)对半治疗性CIA小鼠的效果是治疗后天数的函数。用小鼠Ig(200μg/小鼠，3次/周)作为对照。
图18A-18B是照片，表示与阴性对照(图B)相比，CIA小鼠患有关节炎的脚爪中IL-21R mRNA表达增加(图A)。
图19和图20是线状图，表示与IgG对照相比，用muIL-21RFc和mEnbrel治疗的大鼠的IBD样症状的临床评分显著下降。图19中的左图为照片，表示正常人肠道淋巴细胞和淋巴结中MU-1mRNA的原位杂交。
图21为给予MuIL-21RFc后，大鼠IBD模型的疾病严重程度的组织学评分下降的统计表。
图22是线状图，表示在注射了经逆转录病毒转导的表达IL-21的T细胞、muIL-21RFc或对照(GFP)的小鼠中，移植物存活百分比随过继转移后(post-adoptive transfer)的天数的变化。
图23是线状图，表示在给予MuIL-21RFc后，CD45RB高过继转移模型的银屑病性病灶的临床评分的改善。图23中的左图表示用MuIL-21RFc治疗前后的小鼠照片。
图24是折线图，表示卵清蛋白(OVA)致敏小鼠经磷酸缓冲盐溶液(PBS)或OVA攻击后的气道过度反应(AHR)水平。序贯给予小鼠渐增量的乙酰甲胆碱。Penh(停顿增加)变化是AHR的标志。
图25A-25D是柱状图，表示OVA致敏小鼠经PBS或OVA攻击后其支气管肺泡灌洗液(BALF)中的细胞数。图25A表示BALF中的细胞总数。图25B表示BALF中的嗜酸性粒细胞数。图25C表示BALF中的淋巴细胞数。图25D表示BALF中的嗜中性粒细胞数。空心柱表示经PBS攻击的WT小鼠；实心柱表示经OVA攻击的WT小鼠；灰色柱表示经PBS攻击的IL-21R-/-小鼠；斜纹柱表示经OVA攻击的IL-21R-/-小鼠。*表示p＜0.05，是通过Mann-Whitney U检验测定的。
图26和图27是OVA致敏小鼠经OVA攻击后其BALF中细胞因子水平的柱状图。图26表示TNFα和IL-5水平。图27表示IL-13水平。空心柱表示经PBS攻击的WT小鼠；实心柱表示经OVA攻击的WT小鼠；灰色柱表示经PBS攻击的IL-21R-/-小鼠；斜纹柱表示经OVA攻击的IL-21R-/-小鼠。*表示p＜0.05，是通过Mann-Whitney U检验测定的。
图28A-28B是柱状图，表示OVA致敏小鼠用OVA或PBS攻击后其血清IgE水平。图28A表示血清总IgE水平。图28B表示抗OVA特异性IgE水平。空心柱表示经PBS攻击的WT小鼠；实心柱表示经OVA攻击的WT小鼠；灰色柱表示经PBS攻击的IL-21R-/-小鼠；斜纹柱表示经OVA攻击的IL-21R-/-小鼠。*表示p＜0.05，是通过Mann-Whitney U检验测定的。
图29A-29D是表示MRL-Faslpr小鼠经MuIL-21RFc或对照治疗后的循环dsDNA自身抗体水平的图。图29A表示IgG1水平。图29B表示IgG2a水平。图29C表示IgG2b水平。图29D表示IgG3水平。*表示p＜0.05，是通过Mann-Whitney U检验测定的。
图30A-30D是表示MRL-Faslpr小鼠经MuIL-21RFc或对照治疗后的循环总IgG水平的图。图30A表示IgG1水平。图30B表示IgG2a水平。图30C表示IgG2b水平。图30D表示IgG3水平。*表示p＜0.05，是通过Mann-Whitney U检验测定的。
图31为是表示经山羊抗小鼠IgG-FITC染色后的小鼠肾切片的荧光水平的图。
图32为示意图，表示IL-21对免疫应答的示例性效果。
图33为示意图，表示抑制IL-21/IL-21R途径的示例性策略。
图34为示意图，表示示例性的可溶性IL-21RFc受体融合蛋白。
图35是曲线图，表示MuIL-21RFc治疗组和对照治疗组小鼠用柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)(“Etenella”)刺激后平均银屑病评分。
图36为统计表，表示与对照治疗小鼠相比，用MuIL-21RFc治疗的柔嫩艾美耳球虫刺激小鼠的银屑病症状的发作延迟和减轻。
图37是曲线图，表示与对照治疗小鼠相比，用MuIL-21RFc治疗的柔嫩艾美耳球虫刺激小鼠在体重减轻方面有所减少。体重指数定义为测量体重与起始体重的比值。
图38A是线状图，表示与对照治疗小鼠相比，用MuIL-21RFc治疗的柔嫩艾美耳球虫刺激小鼠的平均粪便评分下降。
图38B是表示各治疗组的每只柔嫩艾美耳球虫刺激小鼠在转移后77天时的粪便评分的图。
图39为图38A的数据统计表。
图40A是表示与对照治疗小鼠相比，用MuIL-21RFc治疗的柔嫩艾美耳球虫刺激小鼠的IFN-γ血清水平的图。
图40B是表示与对照治疗小鼠相比，用MuIL-21RFc治疗的柔嫩艾美耳球虫刺激小鼠的粪便评分的图。
图41是曲线图，表示用IL-21治疗后，3H-胸苷掺入到活化的CD45RBhi和CD45RBlo细胞中。
图42A-B是柱状图，表示用IL-21治疗后，活化的CD45RBhi细胞的细胞因子分泌增加。
图43为柱状图，表示用MuIL-21RFc治疗后，活化的CD45RBhi细胞的细胞因子分泌减少。
图44A-B为柱状图(A)和散布图(B)，表示在SLE的GVHD模型中，移植了B6 bm12脾细胞的IL-21R敲出小鼠不产生抗dsDNA的自身抗体(A)，而且在这些小鼠肾中也没有观察到IgG沉积(B)。
发明详述 本文公开了使用IL-21或IL-21受体(“IL-21R”或“MU-1”)的拮抗剂以抑制白介素-21(IL-21)/IL-21受体(MU-1)活性的方法和组合物。IL-21/IL-21R拮抗剂可用于在体内诱导免疫抑制，例如用于治疗或预防炎性疾病或自身免疫性疾病(例如与一种或多种成熟T细胞(成熟CD8+T细胞、成熟CD4+T细胞)、成熟NK细胞、B细胞、巨噬细胞和巨核细胞异常活性相关的疾病，包括移植排斥、银屑病和自身免疫性疾病，例如类风湿性关节炎和IBD)。
在一个实施方案中，申请人已经提出，通过使用中和融合蛋白(其包含与Fc免疫球蛋白区融合的IL-21R胞外域)来降低IL-21R活性，以改善胶原诱发关节炎(CIA)动物模型的炎症症状(实施例7)，以及改善动物模型的IBD(实施例9和11)、移植排斥(实施例10)、银屑病(实施例11)和狼疮(实施例13)。在CIA小鼠脚爪中，IL-21RmRNA的表达被上调(实施例8)。IL-21R缺陷型小鼠显示出抗原诱发的气道炎症减轻(实施例12)。因此，能拮抗IL-21/IL-21R活性的IL-21R结合剂可用于在体内诱导免疫抑制，例如用于治疗或预防炎性疾病或自身免疫性疾病(例如肾小球肾炎、移植排斥、银屑病、特应性疾病、哮喘、自身免疫性疾病(例如类风湿性关节炎和SLE)和IBD(例如节段性回肠炎、溃疡性结肠炎))。
为了便于理解本发明，首先定义一些术语。其它定义将在发明详述中给出。
本文所用的术语“MU-1”、“MU-1蛋白”、“白介素-21受体”或“IL-21R”是指I类细胞因子家族受体，也称为NILR(WO01/85792；Parrish-Novak等(2000)Nature 40857-63；Ozaki等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9711439-444)。MU-1与IL-2受体和IL-15受体和IL-4α共享的β链同源(Ozaki等(2000)，出处同上)。一旦配体结合，IL-21R/MU-1能够影响共同的γ细胞因子受体链(γc)(Asao等(2001)J.Immunol.1671-5)，并诱导STAT1和STAT3磷酸化(Asao等(2001))或STAT5磷酸化(Ozaki等(2000))。MU-1在淋巴组织中广泛分布。术语“MU-1”是指能够与IL-21(优选来自哺乳动物，例如鼠或人IL-21)相互作用(例如结合)的受体(优选哺乳动物受体，例如来自鼠或人)，并且具有以下特征之一(i)天然存在的哺乳动物MU-1多肽IL-21R/MU-1或其片段的氨基酸序列，例如SEQ ID NO2(人)或SEQ ID NO10(鼠)所示氨基酸序列或其片段；(ii)基本上与SEQ IDNO2(人)或SEQ ID NO10(鼠)所示氨基酸序列或其片段具有例如至少85％、90％、95％、98％或99％同源性的氨基酸序列；(iii)由天然存在的哺乳动物IL-21R/MU-1核苷酸序列或其片段(例如SEQ IDNO1(人)或SEQ ID NO9(鼠)或其片段)所编码的氨基酸序列；(iV)由与SEQ ID NO1(人)或SEQID NO9(鼠)所示核苷酸序列或其片段具有例如至少85％、90％、95％、98％、99％同源性的核苷酸序列所编码的氨基酸序列；(v)由与天然存在的IL-21R/MU-1核苷酸序列或其片段简并的核苷酸序列(例如SEQ ID NO.1(人)或SEQ ID NO9(鼠)或其片段)所编码的氨基酸序列；或(vi)在严格性条件例如高度严格性条件下与前述核苷酸序列之一杂交的核苷酸序列。
IL-21R/MU-1来源于哺乳动物，优选人。人IL-21R/MU-1的核苷酸序列和预测氨基酸序列分别示于SEQ ID NO1和SEQ IDNO2。分析人IL-21R/MU-1氨基酸序列(SEQ ID NO2；图2B)，揭示出以下结构特征前导序列(SEQ ID NO2的约氨基酸1-19(图2B))；WSXWS基序(SEQ ID NO2的约氨基酸213-217)；跨膜域(SEQID NO2的约氨基酸236-252(图2B))；SEQ ID NO2的约氨基酸1-235的胞外域；和SEQ ID NO2的约253-538的胞内域。据信，成熟人IL-21R/MU-1具有SEQ ID NO2的氨基酸20-538的序列。
IL-21R/MU-1 cDNA于1998年3月10日保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，保藏号ATCC98687。
短于全长的IL-21R/MU-1蛋白的任何形式都可用于本发明的方法和组合物，只要它保留结合IL-21多肽的能力。短于全长的IL-21R/MU-1蛋白，例如可溶性IL-21R，可由编码全长MU-1蛋白的多核苷酸相应片段在宿主细胞中表达而产生。这些相应的多核苷酸片段也是本发明的组成部分。如上所述的修饰多核苷酸可以通过标准分子生物学技术来制备，所述技术包括合适所需缺失突变体的构建、定点诱变方法或者通过使用合适的寡核苷酸引物的聚合酶链式反应。
本文所用的“可溶性IL-21R/MU-1多肽”是不能将自身锚定在膜上的IL-21R/MU-1多肽。这类可溶性多肽包含例如MU-1或IL-21R多肽，它们缺乏锚定所述多肽的足够的跨膜区部分，或者它们经修饰使得跨膜区无功能，例如IL-21R的可溶性片段(例如IL-21R片段，其包含鼠或人IL-21R的胞外域，包括SEQ ID NO2(人)的约氨基酸1-235、1-236、20-235、20-236的氨基酸序列，或者SEQID NO10(鼠)的约氨基酸1-236、20-236的氨基酸序列。可溶性IL-21R/MU-1多肽还可以包括第二部分(例如与其融合)，所述第二部分例如多肽(例如免疫球蛋白链、GST、Lex-A或MBP多肽序列)。例如，融合蛋白可包含与第二部分融合的至少能结合IL-21的IL-21R多肽片段，例如IL-21R可溶性片段(例如包含鼠或人IL-21R胞外域的IL-21R片段；例如SEQ ID NO2(人)的约氨基酸1-235、1-236、20-235、20-236，或者SEQ ID NO10(鼠)的约氨基酸1-236、20-236；所述第二部分例如多肽(例如不同同种型的免疫球蛋白链、Fc片段、重链恒定区，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE)。
术语“白介素-21”或“IL-21”是指与IL-2、IL-4和IL-15具有序列同源性的细胞因子(Parrish-Novak等(2000)Nature 40857-63)。尽管白介素细胞因子间序列同源性低，但是细胞因子全都折叠成为该家族中具有代表性的“四螺旋束”结构。它主要在活化CD4+T细胞中表达，据报道它能影响NK、B和T细胞(Parrish-Novak等(2000)，出处同上；Kasaian等(2002)，出处同上)。IL-21结合IL-21R(在本文中也称为MU-1和NILR)。一旦IL-21结合，IL-21R的活化就会导致STAT5或STAT3信号传导(Ozaki等(2000)，出处同上)。术语“IL-21”或“IL-21多肽”是指能够与IL-21R(优选来自哺乳动物，例如鼠或人IL-21)相互作用(例如结合)的蛋白质(优选来自哺乳动物，例如鼠或人)，并且具有以下特征之一(i)天然存在的哺乳动物IL-21的氨基酸序列或其片段，例如SEQ ID NO19(人)所示的氨基酸序列或其片段；(ii)基本上与SEQ ID NO19(人)所示氨基酸序列或其片段具有例如至少85％、90％、95％、98％、99％同源性的氨基酸序列；(iii)由天然存在的哺乳动物IL-21核苷酸序列或其片段(例如SEQ ID NO18(人)或其片段)所编码的氨基酸序列；(iv)由与SEQ ID NO18(人)所示核苷酸序列或其片段具有例如至少85％、90％、95％、98％、99％同源性的核苷酸序列所编码的氨基酸序列；(v)由与天然存在的IL-21核苷酸序列或其片段简并的核苷酸序列(例如SEQ ID NO19(人)或其片段)所编码的氨基酸序列；或(vi)在严格性条件例如高度严格性条件下与前述核苷酸序列之一杂交的核苷酸序列。
短语MU-1或IL-21R多肽的“生物活性”是指相应的成熟MU-1蛋白的一种或多种生物活性，包括但不限于(1)与IL-21多肽(例如人IL-21多肽)相互作用(例如结合)；(2)与γc、JAK1等信号传导分子缔合；(3)刺激stat蛋白(例如STAT5和/或STAT3)磷酸化和/或活化；和/或(4)调节(例如刺激或降低)、增殖、分化、效应细胞功能、细胞溶解活性、细胞因子分泌和/或免疫细胞存活，所述免疫细胞例如T细胞(CD8+、CD4+T细胞)、NK细胞、B细胞、巨噬细胞和巨核细胞)。
本文所用的可用于本发明方法的“IL-21/IL-21R拮抗剂”是指能够降低、抑制或消除IL-21R/MU-1多肽的一种或多种生物活性的药物。在一个优选的实施方案中，拮抗剂与IL-21R/MU-1多肽相互作用(例如结合)。在另一个优选的实施方案中，拮抗剂与IL-21多肽相互作用(例如结合)。用IL-21/IL-21R的拮抗剂进行拮抗，不一定表现出对IL-21R/MU-1多肽和/或IL-21多肽生物活性的完全消除。
本文所用的IL-21/IL-21R拮抗剂的“治疗有效量”是指以单剂量或多剂量给予患者(例如人患者)的药用有效量，以治愈、改善或预防该病的一种或多种症状或降低其严重程度、或使患者的生存期比未经该治疗的患者的生存期更长。
本文所用的IL-21/IL-21R拮抗剂的“预防有效量”是指以单剂量或多剂量给予患者(例如人患者)的IL-21/IL-21R拮抗剂有效量，以预防疾病，例如本文所述疾病或延迟其发作或复发。
术语“诱导”、“诱发”、“抑制”、“增强”、“提高”、“增加”、“降低”等，例如用于两种状态间的数量差异时，是指两种状态间数量上至少具有统计学上显著性差异。
术语“联用”在本文中是指基本上同时(一起或序贯)给予几种药物。如果是序贯给药，在给予第二种化合物的同时，优选这两种化合物中的第一种在治疗部位或患者体内仍存在可检测的有效浓度。
本文所用的“融合蛋白”是指含有两种以上有效缔合(例如连接)的部分例如蛋白质部分的蛋白质。优选各部分间共价缔合。各部分可以直接缔合或者通过间隔区或接头连接。
本文所用的术语“抗体”是指包含至少一个、优选两个重(H)链可变区(在本文中缩写为VH)以及至少一个、优选两个轻(L)链可变区(在本文中缩写为VL)的蛋白质。VH区和VL区还可进一步分为超变区和构架区(FR)，前者称为“互补决定区”(“CDR”)，其中间插着更为保守的构架区。已经准确定义了构架区和CDR(参见例如Kabat等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美国健康和人类服务部(U.S.Department of Health and HumanServices)，NIH公布号91-3242，和Chothia等(1987)J.Mol.Biol.196901-17，所述文献都通过引用结合到本文中)。每个VH和VL都由3个CDR和4个FR组成，按以下顺序从氨基端到羧基端排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
抗体还可包含重链恒定区和轻链恒定区，因而分别形成免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，抗体是两个免疫球蛋白重链和两个免疫球蛋白轻链的四聚体，其中免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链彼此通过例如二硫键连接。重链恒定区由以下三个结构域组成CH1、CH2和CH3。轻链恒定区由一个结构域CL组成。重链可变区和轻链可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区通常介导抗体与宿主组织或因子的结合，所述因子包含免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。
本文所用的术语“免疫球蛋白”是指由基本上由免疫球蛋白基因所编码的一种或多种多肽组成的蛋白质。已鉴定的人免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA1和IgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白“轻链”(约25kD或214个氨基酸)是由NH2-端的可变区基因(约110个氨基酸)和COOH-端的κ或λ恒定区基因所编码的。同样，全长免疫球蛋白“重链”(约50kD或446个氨基酸)是由可变区基因(约116个氨基酸)和其它上述恒定区基因之一(例如γ(编码约330个氨基酸))所编码的。
本文所用的“同种型”是指由重链恒定区基因所编码的抗体类别(例如IgM或IgG1)。
本文所用的术语抗体的“抗原结合片段”(或简称“抗体部分”，或“片段”)是指全长抗体的一个或多个片段，其保留与抗原(例如CD3)特异性结合的能力。结合片段的实例包括在术语抗体的“抗原结合片段”范围内，它包括(i)Fab片段，即由VL区、VH区、CL区和CH1区组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，即包含在铰链区以二硫键相连的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH区和CH1区组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL区和VH区组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等(1989)Nature 341544-546)，其由VH区组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个区即VL和VH，是由各自的基因所编码的，但是可以用重组方法，通过合成的接头使它们彼此连接，所述接头能使它们成为一条蛋白单链，其中VL区和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等(1988)Science 242423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883)。这类单链抗体也包括在术语抗体的“抗原结合片段”之内。可用本领域技术人员已知的常规技术获取这些抗体片段，而且这些片段经筛选可以相同的方式用作完整抗体。
与本文所公开的序列类似或同源(例如具有至少约85％序列同一性)的序列也是本申请的组成部分。在一些实施方案中，序列同一性可以是约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。或者，当核酸区段在选择性杂交条件(例如高度严格性杂交条件)下与该链的互补链杂交时，即具有基本同一性。核酸可存在于完整细胞、细胞裂解物中，或以部分纯化或基本纯化形式存在。
两个序列之间的“同源性”或“序列同一性”(这两个术语在本文中可互换使用)的计算进行如下。为了最佳比较目的，将序列进行比对(例如为了进行最佳比对，可以在第一和第二氨基酸序列或核酸序列中或两者中引入空位，而且为了比较的目的，非同源序列可以忽略不计)。在一个优选的实施方案中，为了进行比较而比对的参考序列的长度为参考序列长度的至少30％、优选至少40％、更优选至少50％、甚至更优选至少60％，甚至更优选至少70％、80％、90％、100％。然后，比较相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，那么所述分子在该位置上是相同的(本文所用的氨基酸或核酸的“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。两个序列间％同一性是两个序列共享的相同位置数的函数，其中考虑了空位数和每个空位的长度，它们是为了两个序列最佳比对的目的而引入的。
两个序列间的序列比较和确定％同一性，可以采用数学算法而完成。在一个优选的实施方案中，两个氨基酸序列间的％同一性采用Needleman和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48444-453)算法而得出，所述算法结合到GCG软件包(可得自http://www.gcg.com)的GAP程序中，用BLOSUM 62矩阵或PAM250矩阵，空位权重为16、14、12、10、8、6或4，而长度权重为1、2、3、4、5或6。在再一个优选的实施方案中，两个核苷酸序列间的％同一性运用GCG软件包(可得自http://www.gcg.com)的GAP程序而得出，用NWSgapdna.CMP矩阵，其空位权重为40、50、60、70或80，而长度权重为1、2、3、4、5或6。一组特别优选的参数(和应当采用的参数，如果技术人员不知道用什么参数来确定某分子是否是在本发明的序列同一性或同源性限制范围内的话)是BLOSUM62打分矩阵，其空位罚分为12，空位延伸罚分为4，移码空位罚分为5。两个氨基酸或核苷酸序列间的％同一性也可用E.Meyers和W.Miller((1989)CABIOS，411-17)的算法而得出，该算法结合到ALIGN程序(2.0版)中，用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。
本文所用的术语“在严格性条件下杂交”是指杂交和洗涤条件。严格性条件是本领域技术人员已知的，可在以下文献中找到Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。有水方法和无水方法描述于该参考文献中，两种方法都可采用。严格性杂交条件的一个优选实例是在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，在约45℃进行杂交，再在0.2X SSC、0.1％SDS中，于50℃洗涤一次或多次。严格性杂交条件的另一个实例是在6X SSC中，在约45℃进行杂交，再在0.2X SSC、0.1％SDS中，于55℃洗涤一次或多次。严格性杂交条件的再一个实例是在6X SSC中，在约45℃进行杂交，再在0.2X SSC、0.1％SDS中，于60℃洗涤一次或多次。优选的严格性杂交条件是在6X SSC中，在约45℃进行杂交，再在0.2X SSC、0.1％SDS中，于65℃洗涤一次或多次。特别优选的严格性杂交条件(和应当采用的条件，如果技术人员不知道用什么条件来确定某分子是否是在本发明的杂交限制范围内的话)是在0.5M磷酸钠、7％SDS中，于65℃杂交，再在0.2X SSC、0.1％SDS中，于65℃洗涤一次或多次。本发明分离的多核苷酸可用作杂交探针和引物，以鉴定和分离与编码本发明公开的多核苷酸具有序列同一性或相似性的核酸。用于鉴定和分离核酸的杂交方法包括聚合酶链式反应(PCR)、DNA杂交、原位杂交和RNA杂交，这些方法都是本领域技术人员众所周知的。本文提供有关杂交条件和反应的更多公开内容。
可在不同严格性条件下进行杂交反应。杂交反应的严格性包括任两个核酸分子彼此杂交的难度。优选每个杂交的多核苷酸在降低的严格性条件下与其相应的多核苷酸杂交，更优选严格性条件，最优选高度严格性条件。严格性条件的实例见下表1高度严格性条件是至少与例如条件A-F一样严格的条件；严格性条件是至少与例如条件G-L一样严格的条件；而降低的严格性条件是至少与例如条件M-R一样严格的条件。
表1


1杂交长度是杂交多核苷酸的杂交区。当多核苷酸与未知序列的靶多核苷酸杂交时，杂交长度假定为杂交多核苷酸的长度。当已知序列的多核苷酸杂交时，可通过多核苷酸序列比对并鉴定最佳序列互补区而确定杂交长度。
2SSPE(1xSSPE是0.15M NaCl，10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA，pH 7.4)在杂交和洗涤缓冲液中可替代SSC(1xSSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)，杂交完成后15分钟可进行洗涤。
TB*-TR*对于长度小于50个碱基对的杂合体的杂交温度应比杂合体的解链温度(Tm)低5-10℃，其中根据以下公式求出Tm。对于长度小于18个碱基对的杂合体，Tm(℃)＝2(A+T碱基数)+4(G+C碱基数)。对于长度介于18-49个碱基对的杂合体，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10Na+)+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是杂合体碱基数，Na+是杂交缓冲液中的钠离子浓度(1X SSC的Na+＝0.165M)。
多核苷酸杂交的严格性条件的其它实例参见Sambrook等，Molecular Cloning A Laboratory Manual，第9和11章，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)，和Ausubel等(编著)，Current Protocols in Molecular Biology，第2.10&6.3-6.4节，John Wiley & Sons，Inc(1995)，所述文献通过引用结合到本文中。
本发明分离的多核苷酸可用作杂交探针和引物，以鉴定和分离具有编码本文公开的多核苷酸等位变异体的序列的DNA。等位变异体是本文公开的多核苷酸的天然存在的替代形式，它所编码的多肽与本文公开的多核苷酸所编码的多肽具有同一性或显著的相似性。优选等位变异体与本文公开的多核苷酸具有至少90％序列同一性(更优选至少95％同一性；最优选至少99％同一性)。
本发明分离的多核苷酸也可用作杂交探针和引物，以鉴定和分离具有与本文公开的多核苷酸同源的编码多肽的序列的DNA。这些同源序列是从与本文所公开的多肽和多核苷酸不同的物种中分离得到的多核苷酸和多肽，或者尽管是从同一物种中分离，但具有与本文所公开的多核苷酸和多肽明显的序列相似性。优选多核苷酸同源序列与本文公开的多核苷酸具有至少50％序列同一性(更优选至少75％同一性；最优选至少90％同一性)，而多肽同源序列与本文公开的多肽具有至少30％序列同一性(更优选至少45％同一性；最优选至少60％同一性)。优选本文公开的多核苷酸和多肽的同源序列是从哺乳动物中分离的。
本发明分离的多核苷酸也可用作杂交探针和引物，以鉴定表达本发明多肽的细胞和组织以及它们表达的条件。
人们知道，本发明的IL-21/IL-21R拮抗剂可具有其它保守或非必需氨基酸取代，这些取代对其功能基本上没有影响。“保守氨基酸取代”是这样的取代其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。本领域已经确定具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括带有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，带有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，带非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，带β支链侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和带芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
本文所用的术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)是指其中导入重组表达载体的细胞。可以理解，该术语不仅是指具体的受试细胞，而且是指所述细胞的子代。因为突变或环境影响，某些修饰可在以后的后代中发生，所以这样的后代实际上与亲代细胞并不相同，但是这样的细胞仍然包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围之内。
IL-21/IL-21R拮抗剂 在一个实施方案中，IL-21R/MU-1多肽或其活性片段可以与第二部分例如免疫球蛋白或其片段(例如其Fc结合片段)融合。例如，IL-21R/MU-1的可溶性形式可以通过“接头”序列与免疫球蛋白的Fc部分融合。也可使用其它融合蛋白，例如与GST、Lex-A或MBP融合的蛋白。
融合蛋白还可包含将IL-21或IL-21R片段与第二部分连接的接头序列。例如，融合蛋白可包含肽接头，例如长度约4-20个氨基酸的肽接头，更优选5-10个氨基酸的肽接头；在一个实施方案中，肽接头长度为8个氨基酸。肽接头中的每个氨基酸都选自Gly、Ser、Asn、Thr和Ala；在一个实施方案中，肽接头包括Gly-Ser元件。在其它实施方案中，融合蛋白包含肽接头，肽接头包含具有式(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)y的序列，其中y为1、2、3、4、5、6、7或8。
在其它实施方案中，融合蛋白的N端或C端还可添加另外的氨基酸序列，以便于表达、检测和/或分离或纯化。例如，IL-21/IL-21R融合蛋白可以与一种或多种额外部分连接，所述额外部分例如GST、His6标记、FLAG标记。例如，融合蛋白还可以与GST融合蛋白连接，其中融合蛋白序列与GST(即谷胱甘肽S-转移酶)序列的C-端融合。这样的融合蛋白有利于MU-1融合蛋白的纯化。
在另一个实施方案中，融合蛋白在其N-端包含异源信号序列(即在MU-1核酸所编码的多肽上并不存在的多肽序列)。例如，天然MU-1信号序列可以被去除，并且被另一种蛋白质的信号序列取代。在某些宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中，可以使用异源信号序列来增加MU-1的表达和/或分泌。
可以通过标准的重组DNA技术产生本发明的嵌合蛋白或融合蛋白。例如，按照常规技术例如使用平端或粘端进行连接，将编码不同多肽序列的DNA片段符合读框地连接在一起，经限制酶消化，提供合适末端，如需要的话，补平粘端，用碱性磷酸酶处理以避免不想要的连接，再进行酶促连接。在另一个实施方案中，可以通过自动DNA合成仪等常规技术合成融合基因。或者，使用锚定引物可以进行基因片段的PCR扩增，这可产生两个连续基因片段之间的互补突出端(overhang)，其随后可以退火并重新扩增以产生嵌合基因序列(参见例如Ausubel等(编著)Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，1992)。此外，许多表达载体是市售的，它们可编码融合部分(例如免疫球蛋白重链Fc区)。MU-1编码核酸可克隆到这样的表达载体中，使融合部分与免疫球蛋白蛋白符合读框地连接在一起。在某些实施方案中，MU-1融合多肽以寡聚体例如二聚体或三聚体形式存在。可以使用本领域已知方法，构建第一多肽和/或编码第一多肽的核酸。
在某些实施方案中，提供在天然存在的MU-1序列(野生型)中具有突变的变异型MU-1多肽的MU-1多肽部分，它可产生MU-1多肽与IL-21结合的更高的亲和性(相对于未突变的序列来说)。
在某些实施方案中，提供在天然存在的MU-1序列(野生型)中具有突变的变异型MU-1多肽的MU-1多肽部分，它可使MU-1序列对蛋白水解具有更高的抗性(相对于未突变的序列来说)。在某些实施方案中，第一多肽包含全长MU-1多肽。或者，第一多肽包含小于全长MU-1多肽。
融合蛋白中可包含的信号肽是MPLLLLLLLLPSPLHP(SEQ ID NO21)。如需要的话，还可将一个或多个氨基酸插入到含有MU-1部分的第一多肽部分和第二多肽部分之间。
第二多肽优选是可溶的。在某些实施方案中，第二多肽延长了所连接多肽的半寿期(例如血清半寿期)。在某些实施方案中，第二多肽包含有利于将融合多肽与第二MU-1多肽缔合的序列。在优选的实施方案中，第二多肽至少包含免疫球蛋白多肽区。免疫球蛋白融合多肽是本领域已知的，参见例如美国专利号5,516,964、5,225,538、5,428,130、5,514,582、5,714,147和5,455,165。
在一些实施方案中，第二多肽包含全长免疫球蛋白多肽。或者，第二多肽包含小于全长免疫球蛋白多肽，例如重链、轻链、Fab、Fab2、Fv或Fc。优选的第二多肽包含免疫球蛋白多肽重链。更优选的第二多肽包含免疫球蛋白多肽Fc区。
在本发明的另一方面，第二多肽具有比野生型免疫球蛋白重链Fc区更少的效应子功能。Fc效应子功能包括例如Fc受体结合，补体结合和T细胞消耗活性(参见例如美国专利第6,136,310号)。T细胞消耗活性、Fc效应子功能和抗体稳定性的测定方法是本领域已知的。在一个实施方案中，第二多肽对Fc受体仅有低亲和性或没有亲和性。在一个替代实施方案中，第二多肽对补体蛋白C1q仅有低亲和性或没有亲和性。
优选的第二多肽序列包含SEQ ID NO17的氨基酸序列。该序列包含Fc区。具有下划线的氨基酸不同于野生型免疫球蛋白序列相应位置上的氨基酸
HTCPPCPAPEALGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO17) 可用于本发明方法的拮抗性融合蛋白的实例见图7-15。在一个实施方案中，融合蛋白包含选自例如以下的氨基酸序列SEQID NO23、SEQ ID NO25、SEQ ID NO27、SEQ ID NO29、SEQ IDNO31、SEQ ID NO33、SEQ ID NO35、SEQ ID NO37或SEQ ID NO39、或与它们具有至少85％、90％、95％、98％或更高同一性的序列。在其它实施方案中，融合蛋白包含选自例如以下的核苷酸序列所编码的氨基酸序列SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36或SEQ ID NO38，或与它们具有至少85％、90％、95％、98％或更高同一性的序列。优选的融合蛋白具有氨基酸序列示于SEQ ID NO25或SEQ ID NO29(分别见图8A-8C和图10A-10C)，或与它们具有至少85％、90％、95％、98％或更高同一性的序列。在其它实施方案中，融合蛋白包含选自例如以下的核苷酸序列所编码的氨基酸序列SEQ ID NO24或SEQ ID NO28(分别见图8A-8C和图10A-10C)，或与它们具有至少85％、90％、95％、98％或更高同一性的序列。最优选的融合蛋白具有SEQ ID NO29所示的氨基酸序列，或者具有SEQ ID NO28所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列(图10A-10C)。
在其它实施方案中，IL-21/IL-21R拮抗剂是抗体或其抗原结合片段，它们能结合IL-21或IL-21R，优选能结合哺乳动物(例如人或鼠)IL-21或IL-21R。
本发明的MU-1蛋白也可用于免疫动物，以获得多克隆抗体和单克隆抗体，这样的抗体可与MU-1蛋白特异性反应，可抑制配体与受体的结合。可以使用完整MU-1作为免疫原，或者通过使用MU-1片段，得到这样的抗体。较小片段的MU-1也可用于免疫动物。肽免疫原还可在羧基端含有半胱氨酸残基，并且与半抗原缀合，所述半抗原例如匙孔血蓝蛋白(KLH)。可通过用硫酸化酪氨酸残基替代酪氨酸残基而制备其它肽免疫原。这些肽的合成方法是本领域众所周知的。
能结合MU-1蛋白的中和抗体或非中和抗体(优选单克隆抗体)，也可用于治疗上述疾病。这些中和单克隆抗体能阻断配体与MU-1受体链的结合。
本发明还提供组合物，它包含与IL-21或IL-21R特异性反应的抗体。
用携带人免疫球蛋白基因(而不是小鼠系统)的转基因小鼠，可产生针对IL-21或IL-21R的人单克隆抗体(mAb)。这些来自经目标抗原免疫的转基因小鼠的脾细胞，用于产生杂交瘤，该杂交瘤分泌对人蛋白表位具有特异性亲和力的人mAb(参见例如Wood等，国际公布号WO91/00906，Kucherlapati等，国际公布号WO 91/10741；Lonberg等，国际公布号WO92/03918；Kay等，国际公布号92/03917；Lonberg，N.等1994 Nature 368856-859；Green，L.L.等(1994)NatureGenet.713-21；Morrison，S.L.等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.816851-6855；Bruggeman等(1993)Year Immunol 733-40；Tuaillon等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.903720-3724；Bruggeman等(1991)Eur J Immunol 211323-1326)。
也可通过重组DNA技术领域技术人员已知的其它方法产生单克隆抗体。已经开发了一个替代方法，称为“组合抗体展示(combinatorial antibody display)”方法，鉴定并分离具有特定抗原特异性的抗体片段，该方法可用于产生单克隆抗体；该方法是本领域众所周知的。用免疫原免疫动物后，克隆所得B细胞库的所有抗体。通过使用寡聚引物混合物和PCR以获取免疫球蛋白分子各群体可变区的DNA序列的方法，通常是已知的。例如，对应于5′前导(信号肽)序列和/或构架1(FR1)序列的混合寡核苷酸引物，以及针对保守的3′恒定区引物的引物，可用于PCR扩增，以便从各种鼠抗体扩增重链可变区和轻链可变区(Larrick等(1991)，Biotechniques 11152-156)。类似的策略也可用于从人抗体扩增人重链可变区和轻链可变区(Larrick等(1991)，MethodsCompanion to Methods in Enzymology 2106-110)。
嵌合抗体，包括嵌合免疫球蛋白链，可通过本领域已知的重组DNA技术而制备。例如，用限制酶消化编码鼠(或其它物种)单克隆抗体分子Fc恒定区的基因，以去除鼠Fc编码区，并且用人Fc恒定区编码基因的等同部分来取代(参见Robinson等，国际专利申请号PCT/US86/02269；Akira等，欧洲专利申请184,187；Taniguchi，M.，欧洲专利申请171,496；Morrison等，欧洲专利申请173,494；Neuberger等，国际公布号WO 86/01533；Cabilly等，美国专利第4,816,567号；Cabilly等，欧洲专利申请125,023；Better等(1988)Science 2401041-1043)；Liu等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.843439-3443；Liu等(1987)J.Immunol.1393521-3526；Sun等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84214-218；Nishimura等(1987)Canc.Res.47999-1005；Wood等(1985)Nature 314446-449；和Shaw等(1988)J.Natl CancerInst.801553-1559)。
可以通过本领域已知方法，使抗体或免疫球蛋白链人源化。可通过用人Fv可变区等同序列取代不直接参与抗原结合的Fv可变区的序列，而产生人源化抗体(包括人源化免疫球蛋白链)。产生人源化抗体的通用方法由以下文献提供Morrison，S.L.(1985)Science2291202-1207，Oi等(1986)BioTechniques 4214，和Queen等，美国专利第5,585,089、5,693,761和5,693,762号，所述文献的内容通过引用全部结合到本文中。这些方法包括编码至少一个重链或轻链的全部或部分免疫球蛋白Fv可变区的核酸序列的分离、操纵和表达。对于本领域技术人员来说，所述核酸的来源是众所周知的，例如可得自产生针对预先确定的靶标的抗体的杂交瘤。然后，编码人源化抗体或其片段的重组DNA可以克隆到合适的表达载体中。
可通过CDR移植或CDR取代，制备人源化或CDR移植抗体分子或免疫球蛋白，其中一个、两个或所有免疫球蛋白链的CDR都可以被取代(参见例如美国专利第5,225,539号；Jones等(1986)Nature 321552-525；Verhoeyan等(1988)Science 2391534；Beidler等(1988)J.Immunol.1414053-4060；Winter，美国专利第5,225,539号，所有这些文献的内容通过引用全部结合到本文中。Winter描述了CDR移植方法，所述方法可用于制备本发明的人源化抗体(1987年3月26日申请的英国专利申请GB 2188638A；Winter，美国专利第5,225,539号，所述文献的内容通过引用结合到本文中)。特定人抗体的所有CDR都可以被至少一部分非人类CDR取代，或者仅有部分CDR可以被非人类CDR取代。仅有必要取代人源化抗体与预先确定的抗原结合所需的CDR的数量。
通过缺失、添加或取代抗体其它部分(例如恒定区)而修饰的单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体，也包括在本发明范围内。例如，抗体可以通过以下方法修饰(i)缺失恒定区；(ii)用另一个恒定区取代原有恒定区，所述另一个恒定区例如能增加抗体半寿期、稳定性或亲和性的恒定区，或者所述恒定区来自另一物种或抗体类别；或(iii)修饰恒定区内的一个或多个氨基酸，以改变例如糖基化位点的数目、效应细胞功能、Fc受体(FcR)结合、补体固定等。
改变抗体恒定区的方法是本领域已知的。可以通过在抗体恒定部分用一个不同的残基取代至少一个氨基酸残基，产生具有功能改变(例如对细胞上的FcR或补体C1组分等效应配体的亲和性发生改变)的抗体(参见例如E.P.388,151A1、U.S.5,624,821和U.S.5,648,260，所述文献的内容全都通过引用结合到本文中)。当用于鼠或其它物种的免疫球蛋白时，类似的改变形式可降低或消除这些功能。
例如，可通过用侧链上具有合适官能团的残基取代指定残基，或者通过引入带电荷的官能团(例如谷氨酸或天冬氨酸，或许芳族非极性残基，例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或丙氨酸)，来改变抗体(例如IgG，例如人IgG)的Fc区对FcR(例如FcγR1)或对C1q结合的亲和性(参见例如U.S.5,624,821)。
IL-21多肽的氨基酸序列是公知的。例如，人IL-21的核苷酸序列和氨基酸序列可得自GENBANK检索号X_011082。所公开的人IL-21核苷酸序列如下1 gctgaagtga aaacgagacc aaggtctagc tctactgttg gtacttatga gatccagtcc61 tggcaacatg gagaggattg tcatctgtct gatggtcatc ttcttgggga cactggtcca121 caaatcaagc tcccaaggtc aagatcgcca catgattaga atgcgtcaac ttatagatat181 tgttgatcag ctgaaaaatt atgtgaatga cttggtccct gaatttctgc cagctccaga241 agatgtagag acaaactgtg agtggtcagc tttttcctgc tttcagaagg cccaactaaa301 gtcagcaaat acaggaaaca atgaaaggat aatcaatgta tcaattaaaa agctgaagag361 gaaaccacct tccacaaatg cagggagaag acagaaacac agactaacat gcccttcatg421 tgattcttat gagaaaaaac cacccaaaga attcctagaa agattcaaat cacttctcca481 aaagatgatt catcagcatc tgtcctctag aacacacgga agtgaagatt cctgaggatc541 taacttgcag ttggacacta tgttacatac tctaatatag tagtgaaagt catttctttg601 tattccaagt ggaggag(SEQ ID NO18) 所公开的人IL-21多肽的氨基酸序列如下MRSSPGNMERIVICLMVIFLGTLVHKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS(SEQ ID NO19) 本发明也包括这样的核酸所述核酸在高度严格性条件(例如0.1X SSC，65℃)下与SEQ ID NO1、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36或SEQ ID NO38所示的核苷酸杂交。本发明也包括编码MU-1蛋白或融合蛋白的分离的多核苷酸，但是所述多核苷酸因遗传密码简并性而不同于SEQ ID NO1、SEQ IDNO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36或SEQ ID NO38所示的核苷酸序列。本发明也包括因点突变或引入修饰所导致的在以下序列所示的核苷酸序列中的变化SEQ ID NO1、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36或SEQ ID NO38。
本发明分离的多核苷酸可以与表达控制序列(例如Kaufman等(1991)Nucleic Acids Res.19，4485-4490中公开的pMT2表达载体或pED表达载体)操作性连接，以便产生重组MU-1蛋白。许多合适的表达控制序列是本领域已知的。表达重组蛋白的通用方法也是已知的，例如参见R.Kaufman(1990)Methods in Enzymology 185，537-566。本文所定义的“操作性连接”是指本发明分离的多核苷酸和表达控制序列经酶促连接或化学连接形成共价键，其方式使得MU-1蛋白由宿主细胞表达，所述细胞已经用所连接的多核苷酸/表达控制序列转化(转染)。
本文所用的术语“载体”是指能够转运与其连接的另一核酸分子的核酸分子。一类载体是“质粒”，它是环状双链DNA环，其中可连接其它DNA区段。另一类载体是病毒载体，其中其它DNA区段可连接到病毒基因组中。某些载体在导入它们的宿主细胞后能自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)在导入宿主细胞后，可整合到宿主细胞基因组中，因而可随宿主基因组复制而复制。此外，某些载体能指导与其操作性连接的基因的表达。这类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称“表达载体”)。一般而言，用于重组DNA技术的表达载体通常呈质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明包括其它形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，它们行使相同的功能。
术语“调节序列”包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)，其控制抗体链基因的转录或翻译。这类调节序列例如参见Goeddel(1990)Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA。本领域技术人员将会理解，表达载体的设计，包括调节序列的选择，都取决于待转化宿主细胞的选择、所需蛋白的表达水平等因素。对于哺乳动物宿主细胞的表达来说，优选的调节序列包括在哺乳动物细胞中指导蛋白高水平表达的病毒元件，例如来自以下的启动子和/或增强子FF-1a启动子和BGH poly A、巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒。有关病毒调节元件及其序列的进一步描述可参见例如Stinski的美国专利第5,168,062号、Bell等的美国专利第4,510,245号和Schaffner等的美国专利第4,968,615号。
本发明的重组表达载体可携带额外序列，例如在宿主细胞中调节载体复制的序列(例如复制起点)和选择性标记基因。选择性标记基因有利于选择其中导入载体的宿主细胞(参见例如Axel等的美国专利第4,399,216、4,634,665和5,179,017号)。例如，在导入载体的宿主细胞中的选择性标记基因通常具有抗药性，所述药物例如G418、潮霉素或甲氨蝶呤。优选的选择性标记基因包含二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr-宿主细胞，用甲氨蝶呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。
许多类型的细胞可作为合适的宿主细胞，用于表达MU-1蛋白或其融合蛋白。能表达功能性MU-1蛋白的任何细胞类型都可使用。合适的哺乳动物宿主细胞包括例如猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人肾293细胞、人表皮A431细胞、人Colo205细胞、3T3细胞、CV-1细胞、其它转化的灵长类细胞系、正常二倍体细胞、来自原代体外组织培养物的细胞株、原代外植体、HeLa细胞、小鼠L细胞、BHK、HL-60、U937、HaK、Rat2、BaF3、32D、FDCP-1、PC12、M1x或C2C12细胞。
也可通过在一种或多种昆虫表达载体中，将本发明分离的多核苷酸与合适的控制序列操作性连接，使用昆虫表达系统，产生MU-1蛋白或其融合蛋白。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料与方法是以试剂盒形式市售的，得自例如Invitrogen，San Diego，Calif.U.S.A.(MAXBAC试剂盒)，所述方法是本领域众所周知的，描述于Summers和Smith，Texas Agricultural Experiment StationBulletin No.1555(1987)，所述文献通过引用结合到本文中。MU-1蛋白的可溶性形式也可用如上所述的合适的分离的多核苷酸，在昆虫细胞中产生。
或者，MU-1蛋白或其融合蛋白可以在酵母等低等真核生物或细菌等原核生物中产生。合适的酵母菌株包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)菌株、假丝酵母属(Candida)或能表达异源蛋白的任何酵母菌株。合适的细菌菌株包括大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或能表达异源蛋白的任何细菌菌株。
在细菌中表达，导致形成含有重组蛋白的包涵体。因此，需要对重组蛋白进行重折叠，以便产生有活性或活性更高的材料。从细菌包涵体中正确获取折叠的异源蛋白的一些方法是本领域已知的。这些方法通常包括从包涵体中溶出所述蛋白，然后用离液剂使蛋白完全变性。当蛋白质的一级氨基酸序列中存在半胱氨酸残基时，它通常需要在允许正确形成二硫键的环境(氧化还原系统)中完成重折叠。重折叠的通用方法公开于Kohno(1990)Meth.Enzym.，185187-195；E.P.0433225和美国专利第5,399,677号描述了其它合适的方法。
MU-1蛋白或其融合蛋白也可表达为转基因动物的产物，例如表达为转基因母牛、山羊、猪或绵羊的乳汁成分，所述转基因动物的特征是体细胞或生殖细胞中含有编码MU-1蛋白或其融合蛋白的多核苷酸序列。
可通过在表达所需蛋白必需的培养条件下培养转化的宿主细胞，制备MU-1蛋白或其融合蛋白。所得的表达蛋白然后可以从培养基或细胞提取物中纯化出来。MU-1蛋白或其融合蛋白的可溶形式可从条件培养基中纯化出来。可通过从表达细胞中制备总膜成分并用非离子型去垢剂(例如TRITONX-100)提取膜，纯化本发明的MU-1蛋白的膜结合形式。
可采用本领域技术人员已知的方法，纯化MU-1蛋白或融合蛋白。例如，本发明的MU-1蛋白可用市售的蛋白浓缩滤器(例如AMICON或PELLICON超滤单元，Millipore，Billerica，MA)进行浓缩。浓缩步骤之后，浓缩液可加到纯化基质例如凝胶过滤介质上。或者，可使用阴离子交换树脂，例如，具有二乙氨基乙基(DEAE)或聚亚乙基亚胺(polyetheyleneimine，PEI)侧基的基质或衬底。这些基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或通常用于蛋白质纯化的其它种类。或者，可以采用阳离子交换步骤。合适的阳离子交换剂包括含磺基丙基或羧基甲基的各种不溶性基质。优选磺基丙基(例如S-SEPHAROSE柱)。从培养上清液中纯化MU-1蛋白或融合蛋白，也可以包括一个或多个过柱步骤，例如伴刀豆球蛋白A-琼脂糖、肝素-TOYOPEARL或Cibacron blue 3GA SEPHAROSE等亲和树脂；或通过疏水作用层析，用苯基醚、丁基醚或丙基醚等树脂；或通过免疫亲和层析。最后，可以使用一个或多个反相高效液相层析(RP-HPLC)步骤，用疏水RP-HPLC介质，例如具有甲基或其它脂族侧基的硅胶，进一步纯化MU-1蛋白。包含抗MU-1蛋白抗体的亲和柱也可用于按照已知方法进行纯化。上述纯化步骤的部分步骤或全部步骤，以不同组合或与其它已知方法组合，也可用于提供基本上纯化的分离的重组蛋白。优选分离的MU-1蛋白是纯化的，使它基本上不含其它哺乳动物蛋白。
本发明的MU-1蛋白或融合蛋白也可用于筛选能与MU-1结合的药物。用所需结合蛋白(无论是否固定化)的结合测定是本领域众所周知的，可用于使用本发明MU-1蛋白的该目的。基于纯化细胞或基于蛋白(无细胞)的筛选试验可用于鉴定所述药物。例如，MU-1蛋白可以纯化形式固定到载体上，可以测定纯化MU-1蛋白的结合配体或潜在配体。
药物组合物 IL-21/IL-21R-拮抗剂当与药物可接受的载体混合后，可用作药物组合物。除了IL-21/IL-21R-拮抗剂和载体之外，所述组合物还可含有各种稀释剂、填充剂、盐类、缓冲剂、稳定剂、增溶剂和本领域众所周知的其它材料。术语“药学上可接受的”是指无毒材料，其不干扰活性成分的生物学活性的功效。载体的特性取决于给药途径。
本发明的药物组合物可以呈脂质体形式，其中IL-21/IL-21R-拮抗剂除了与其它药学上可接受的载体联用外，还与两亲性物质(例如以聚集形式存在成为胶束、不溶性单层的脂质、液晶或在水溶液中呈片层形式)联用。用于脂质体制剂的合适脂质包括但不限于甘油单酯、甘油二酯、硫脑苷酯、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、胆汁酸等。这类脂质体制剂的制备在本领域技术人员水平范围内，并在以下文献中公开例如美国专利第4,235,871、4,501,728、4,837,028和4,737,323号，所有这些文献都通过引用结合到本文中。
本文所用的术语“治疗有效量”是指足以给患者带来有用的益处的药物组合物或方法的各活性成分的总有效量，所述益处例如改善症状、治愈所述疾病或提高其治愈率。当用于单一活性成分单独给予时，该术语是指产生疗效的单一组分的用量。当用于联用时，该术语是指产生疗效的活性成分的总量，无论是联合、序贯还是同时给予。
在本发明的治疗方法或用途的实践中，将治疗有效量的IL-21/IL-21R-拮抗剂给予患者，例如哺乳动物(例如人)。IL-21/IL-21R-拮抗剂可以按照本发明的方法单用或与以下详述的其它疗法联合给予。当与一种或多种药物联合给予时，IL-21-和/或IL-21R-拮抗剂可以与第二药物同时或序贯给予。如果是序贯给药的话，主治医师将会决定给予IL-21/IL-21R-拮抗剂以及其它药物的合适顺序。
可以按各种常规途径，给予用于药物组合物或实施本发明的方法所用的IL-21/IL-21R-拮抗剂，所述途径例如口服摄入、吸入或皮肤、皮下或静脉内注射。优选静脉内给予患者。
当治疗有效量的IL-21/IL-21R-激动剂或拮抗剂是经口服给药时，所述结合剂将呈片剂、胶囊剂、粉剂、溶液剂或酏剂的形式。当以片剂给药时，本发明的药物组合物还可含有固体载体，例如明胶或辅料。片剂、胶囊剂和粉剂含有约5-95％的结合剂，优选含有约25-90％的结合剂。当以液体形式给药时，可加入液体载体，例如水、石油、动物油或植物油，例如花生油、矿物油、大豆油或芝麻油，或合成油。药物组合物的液体形式还可含有生理盐水、葡萄糖或其它糖溶液，或二醇，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。当以液体形式给药时，药物组合物含有约0.5-90％(重量)的结合剂，优选约1-50％的结合剂。
当治疗有效量的IL-21/IL-21R-拮抗剂是经静脉内、皮肤或皮下注射给予时，所述结合剂将呈无热源、胃肠外可接受的水溶液形式。具有适当的pH、等渗性、稳定性等的所述胃肠外可接受的蛋白溶液剂的制备在本领域技术范围内。除了结合剂外，供静脉内、皮肤或皮下注射用的优选药物组合物还应含有等渗溶媒，例如氯化钠注射液、林格注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、乳酸林格注射液或本领域已知的其它溶媒。本发明的药物组合物也可含有稳定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧化剂或本领域技术人员已知的其它添加剂。
本发明药物组合物中IL-21/IL-21R-拮抗剂的用量将取决于所治疗疾病的性质和严重程度，以及该患者以前曾接受过的治疗的性质。最终，主治医师将会决定用于治疗每个患者的结合剂的用量。开始，主治医师将给予低剂量的结合剂，并观察患者的反应。可给予更大剂量的结合剂，直到所述患者达到最佳治疗效果，而且在该点通常不再继续增加剂量。用于本发明方法的实践的不同药物组合物应含有约0.1μg至约100mg IL-21/IL-21R-拮抗剂/千克体重。
用本发明药物组合物进行静脉内治疗的持续时间将会不同，取决于所治疗疾病的严重程度和每个患者的情况和潜在的特异反应。每次应用IL-21/IL-21R-拮抗剂的持续时间范围将在12-24小时连续静脉内给药。最后，主治医师将会决定本发明药物组合物的静脉内治疗的合适持续时间。
本发明的多核苷酸和蛋白质表现出本文所鉴定的一种或多种用途或生物活性(包括与本文引用的试验相关的那些用途或生物活性)。通过给予或使用所述蛋白质或者给予或使用编码所述蛋白质的多核苷酸(例如在基因疗法或适于导入DNA的载体中)，可提供本发明蛋白质的用途或活性。
使用IL-21/IL-21R拮抗剂以降低免疫细胞活性 在又一方面，本发明的特征在于抑制免疫细胞活性的方法，所述免疫细胞例如成熟T细胞(成熟CD8+T细胞、成熟CD4+T细胞)、成熟NK细胞、B细胞、巨噬细胞和巨核细胞或其群体，所述方法包括使T细胞群体接触足够量的IL-21/IL-21R拮抗剂，以抑制免疫细胞或群体的活性。也可将IL-21和/或IL-21R的拮抗剂(例如本文所述的融合蛋白或中和抗体)给予希望能抑制免疫应答的患者。这些病症或疾病包括例如自身免疫性疾病(例如关节炎、RA、IBD)、SLE、哮喘、肾小球肾炎、银屑病或移植物/器官移植(及其相关排斥)。
申请人:已经知道，通过使用中和融合蛋白(例如包含与Fc免疫球蛋白区融合的IL-21R胞外域的融合蛋白)降低IL-21R活性，在一些动物模型中改善了炎性症状，所述模型例如胶原诱发关节炎(CIA)动物模型(实施例7)，以及节段性回肠炎、溃疡性结肠炎和IBD的动物模型(实施例9和11)，移植排斥(实施例10)、银屑病(实施例11)和狼疮的动物模型(实施例13)。在CIA小鼠脚爪中，IL-21R mRNA的表达被上调(实施例8)。在抗原诱发的气道炎症中，IL-21R缺陷型小鼠表现出症状较轻(实施例12)。因此，拮抗IL-21/IL-21R活性的IL-21R结合剂可用于在体内诱导免疫抑制，例如用于治疗或预防免疫细胞相关的病理，包括自身免疫性疾病(例如关节炎、RA、IBD)、SLE、肾小球肾炎、哮喘、银屑病或移植物/器官移植。
也将IL-21R DNA作图到节段性回肠炎的染色体基因座上，因此对于使用IL-21/IL-21R拮抗剂来治疗节段性回肠炎和其它炎性肠病来说，提供了额外的支持。
所述方法也可用于调节(例如抑制)免疫细胞活性(例如增殖、分化、存活)，因此可用于治疗或预防各种免疫性疾病。可治疗或预防的疾病的非限制性实例包括但不限于移植物排斥、自身免疫性疾病(包括例如糖尿病、关节炎(包括RA、青少年RA、骨关节炎(OA)、银屑病性关节炎)、多发性硬化、脑脊髓炎、重症肌无力、SLE、肾小球肾炎、自身免疫性甲状腺炎、皮炎(包括特应性皮炎和湿疹性皮炎)、银屑病及相关皮肤病(例如UV损伤相关病症，例如光衰老、特应性皮炎、皮肤T细胞淋巴瘤例如蕈样肉芽肿病、过敏性和刺激性接触性皮炎、扁平苔藓、斑秃、白癜风、眼部疤痕性类天疱疮和荨麻疹)、斯耶格伦综合征(Sjgren′s syndrome)、节段性回肠炎、口疮性溃疡、虹膜炎、溃疡性结肠炎、椎关节强硬性关节病、关节强硬性脊椎炎、内源性哮喘、变应性哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、间质性肺纤维化、皮肤性红斑狼疮、硬皮病、药疹、自身免疫性葡萄膜炎、变应性脑脊髓炎、韦格纳肉芽肿病(Wegener’s granulomatosis)、肝炎、史蒂文斯-约翰逊综合征(Stevens-Johnson syndrome)、特发性口炎性腹泻、格雷夫斯病(Graves′disease)、结节病、肝纤维化、原发性胆汁性肝硬化、后葡萄膜炎(uveitis posterior)、移植物抗宿主病和变态反应，例如特应性变态反应。可用IL-21/IL-21R拮抗剂进行治疗的疾病优选包括关节炎(例如RA、青少年RA、OA、银屑病性关节炎和关节强硬性脊椎炎(优选类风湿性关节炎))、多发性硬化、I型糖尿病、狼疮(SLE)、IBD(节段性回肠炎、溃疡性结肠炎)、哮喘、脉管炎、变态反应、硬皮病、肾小球肾炎和银屑病。
在另一个实施方案中，IL-21/IL-21R拮抗剂单用或与本文所述的其它治疗药(例如TNF拮抗剂)联用，可用于治疗多发性骨髓瘤和相关的B淋巴细胞性恶性肿瘤(Brenne等(2002)Blood 99(10)3756-3762)。
使用IL-21/IL-21R拮抗剂可以多种方式调节免疫应答。下调可以是抑制或阻断已经开始进行的免疫应答的方式，或者可参与预防对免疫应答的诱导。可以通过抑制T细胞应答或通过诱T细胞特异性耐受性或这两者，来抑制活化T细胞的功能。T细胞应答的免疫抑制通常是活性的、非抗原特异性的过程，该过程需要使T细胞持续暴露给抑制剂。耐受性(即诱导T细胞无应答或无反应性)与免疫抑制的不同之处在于耐受性通常是抗原特异性的，并且在停止暴露给耐受剂后仍然能持久存在。从操作上看，在耐受剂不存在时再次暴露给特异性抗原后，仍缺乏T细胞应答，由此可证明耐受性。
下调或阻止免疫功能，例如用IL-21/IL-21R拮抗剂，将用于组织、皮肤和器官移植和移植物抗宿主病(GVHD)的情况下。例如，抑制T细胞功能，在组织移植中会减少组织破坏。通常在组织移植中，移植物排斥是因T细胞将移植物识别成外源物而开始的，接着就是破坏移植物的免疫反应。给予IL-21/TL-21R拮抗剂，无论是在移植之前、期间或之后单独使用还是与抑制或阻断其他免疫效应物相互作用的分子联用，都可用于降低免疫应答。
可用动物模型评价IL-21/IL-21R拮抗剂在预防器官移植排斥或GVHD中的功效，这样的动物模型能用于预测在人体内的功效和剂量。可使用的合适系统的实例包括大鼠的同种异体心脏移植和小鼠的异种胰岛细胞移植，这两者都用于在体内检测CTLA4 Ig融合蛋白的免疫抑制效应，参见Lenschow等(1992)Science 257789-92和Turka等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，8911102-05。也可在血管化心脏同种异体移植物和全厚度皮肤同种异体移植物的其它动物模型例如在鼠模型中评价IL-21/IL-21R拮抗剂。这些模型可测定组织排斥(所述组织具有完全MHC错配)并且可将IL-21阻断与供体特异性淋巴细胞转输结合起来。另外，GVHD的鼠模型(参见例如Paul(编著)，Fundamental Immunology，Raven Press，New York(1989)第846-47页)可用于确定IL-21/IL-21R拮抗剂在体内对GVHD或SLE发展的影响。也可评价IL-21/IL-21R拮抗剂与其它治疗药联用于预防器官移植排斥或GVHD中的功效，所述治疗药例如免疫抑制剂，例如雷帕霉素、环孢菌素或CTLA4Ig。
IL-21/IL-21R拮抗剂也可治疗性用于治疗自身免疫性疾病。许多自身免疫性疾病的起因是T细胞异常活化从而与自身组织反应并促进产生参与疾病病理的细胞因子和自身抗体。防止自身反应性T细胞活化，可减少或消除疾病症状。给予IL-21/IL-21R拮抗剂，单独或与其它药物(例如本文所述的药物)联用，可用于抑制T细胞活化并预防产生自身抗体或T细胞衍生的细胞因子，这些抗体或细胞因子可参与疾病进程。此外，IL-21/IL-21R拮抗剂单用或与其它药物(例如本文所述的药物)联用，增加了自身反应性T细胞的抗原特异性耐受性并能长期缓解疾病。可以使用各种明确表征的人自身免疫性疾病的动物模型，来测定这些药物在预防或缓解自身免疫性疾病中的功效。实例包括MRL/lpr/lpr小鼠或NZB杂交小鼠的鼠实验性自身免疫性脑炎、系统性红斑狼疮，NOD小鼠和BB大鼠的鼠自身免疫性胶原性关节炎、糖尿病，以及鼠实验性重症肌无力(参见例如Paul(编著)，Fundamental Immunology，Raven Press，New York(1989)第840-56页)。
在一个实施方案中，IL-21/IL-21R拮抗剂，例如其药物组合物，在联合疗法中给予，即与其它药物例如治疗药联用，所述药物用于治疗病理性病症或疾病，例如免疫性疾病和炎性疾病。术语“联用”在本文中是指基本上同时(一起或序贯)给药。如果是序贯给药，在给予第二种化合物的同时，优选两种化合物中的第一种在治疗部位或患者体内仍具有可检测的有效浓度。
例如，联合疗法可以包括一种或多种IL-21/IL-21R拮抗剂(例如针对IL-21或IL-21受体的抗体或其抗原结合片段(例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或体外产生的抗体或其抗原结合片段)、IL-21融合蛋白、可溶性IL-21受体、肽抑制剂或小分子抑制剂)，与一种或多种其它治疗药一起配制和/或一起给药，所述其它治疗药例如在本文中更详细描述的一种或多种细胞因子抑制剂和生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎药、代谢抑制剂、酶抑制剂和/或细胞毒剂或细胞抑制剂。此外，本文所述的一种或多种IL-21/IL-21R拮抗剂可用于与本文所述的两种以上治疗药联用。所述联合疗法可有利地用于给予低剂量治疗药，从而避免可能的毒性或各单一疗法相关的并发症。此外，本文所公开的治疗药作用途径与IL-21/IL-21R受体途径不同，因而有望增强IL-21/IL-21R拮抗剂的作用和/或与IL-21/IL-21R拮抗剂产生协同作用。
与IL-21/IL-21R拮抗剂联用的优选的治疗药是那些干扰自身免疫和随后炎症反应不同时相的药物。在一个实施方案中，本文所述的一种或多种IL-21/IL-21R拮抗剂可与一种或多种其它治疗药一起配制和/或一起给药；所述治疗药例如其它细胞因子拮抗剂或生长因子拮抗剂(例如可溶性受体、肽抑制剂、小分子、配体融合物)；或与其它靶标结合的抗体或其抗原结合片段(例如与其它细胞因子或生长因子、其受体或其它细胞表面分子结合的抗体)；和抗炎细胞因子或其激动剂。可与本文所述IL-21/IL-21R拮抗剂联用的药物的非限制性实例包括但不限于一种或多种白介素(IL)或其受体的拮抗剂，例如IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18和IL-22的拮抗剂；细胞因子或生长因子或其受体的拮抗剂，例如肿瘤坏死因子(TNF)、LT、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF的拮抗剂。IL-21/IL-21R拮抗剂也可与针对以下细胞表面分子的抗体等的抑制剂联用CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD90或它们的配体，包括CD154(gp39或CD40L)或LFA-1/ICAM-1和VLA-4/VCAM-1(Yusuf-Makagiansar等(2002)Med.Res.Rev.22(2)146-67)。可与本文所述的IL-21/IL-21R拮抗剂联用的优选拮抗剂包括IL-1、IL-6、IL-12、TNFα、IL-15、IL-17、IL-18和IL-22的拮抗剂。
这些药物的实例包括IL-12拮抗剂，例如与IL-12(优选人IL-12)结合的嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或体外产生的抗体(或其抗原结合片段)，所述抗体例如在WO 00/56772，GeneticsInstitute/BASF中公开的抗体；IL-12受体抑制剂，例如抗人IL-12受体的抗体；和IL-12受体(例如人IL-12受体)的可溶性片段。IL-6拮抗剂的实例包括针对IL-6或其受体的抗体(或其抗原结合片段)，例如针对人IL-6或其受体的嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或体外产生的抗体，IL-6受体的可溶性片段和IL-6结合蛋白。IL-15拮抗剂的实例包括这样的抗体针对IL-15或其受体的抗体(或其抗原结合片段)，例如针对人IL-15或其受体的嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或体外产生的抗体，IL-15受体的可溶性片段和IL-15结合蛋白。IL-18拮抗剂的实例包括这样的抗体例如针对人IL-18的嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或体外产生的抗体(或其抗原结合片段)，IL-18受体的可溶性片段和IL-18结合蛋白(IL-18BP，Mallat等(2001)Circ.Res.89e41-45)。IL-1拮抗剂的实例包括白介素-1转化酶(ICE)抑制剂例如Vx740、IL-1拮抗剂例如IL-1RA(ANIKINRATM，Amgen)、sIL1RII(Immunex)和抗IL-1受体抗体(或其抗原结合片段)。
TNF拮抗剂的实例包括针对TNF(例如人TNFα)的嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或体外产生的抗体(或其抗原结合片段)，例如D2E7(人TNFα抗体，U.S.6,258,562；BASF)、CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356(人源化抗TNFα抗体；Celltech/Pharmacia)、cA2(嵌合抗TNFα抗体；REMICADETM，Centocor)；抗TNF抗体片段(例如CPD870)；TNF受体的可溶性片段，例如p55或p75人TNF受体或其衍生物，例如75kdTNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，ENBRELTM；Immunex；参见例如Arthritis & Rheumatism(1994)第37卷，S295；J.Invest.Med.(1996)第44卷，235A)，p55kdTNFR-IgG(55kD TNF受体-IgG融合蛋白(Lenercept))；酶拮抗剂，例如TNFα转化酶(TACE)抑制剂(例如α-磺酰基异羟肟酸衍生物，WO 01/55112，和N-羟基甲酰胺TACE抑制剂GW 3333、-005或-022)；和TNF-bp/s-TNFR(可溶性TNF结合蛋白；参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S284；Amer.J.Physiol.-Heart and CirculatoryPhysiology(1995)第268卷，第37-42页)。优选的TNF拮抗剂是TNF受体的可溶性片段，例如p55或p75人TNF受体或其衍生物，例如75kdTNFR-IgG和TNFα转化酶(TACE)抑制剂。
在其它实施方案中，本文所述的IL-21-/IL-21R拮抗剂可与一种或多种以下药物联用IL-13拮抗剂，例如可溶性IL-13受体(sIL-13)和/或抗IL-13抗体；IL-2拮抗剂，例如DAB 486-IL-2和/或DAB 389-IL-2(IL-2融合蛋白；Seragen；参见例如Arthritis &Rheumatism(1993)第36卷，1223)，和/或抗IL-2R抗体，例如抗Tac(人源化抗IL-2R；Protein Design Labs，Cancer Res.1990年3月1日；50(5)1495-502)。另一种联合疗法包括IL-21拮抗剂与非消耗性抗CD4抑制剂(IDEC-CE9.1/SB 210396(非消耗性致敏性(primatized)抗CD4抗体；IDEC/SmithKline)的联用。再一些优选的联合药物包含共刺激途径拮抗剂CD80(B7.1)或CD86(B7.2)，所述拮抗剂包括抗体、可溶性受体或拮抗性配体；以及p-选择蛋白糖蛋白配体(PSGL)、抗炎细胞因子，例如IL-4(DNAX/Schering)；IL-10(SCH 52000；重组IL-10DNAX/Schering)；IL-13和TGF，及其激动剂(例如激动剂抗体)。
在其它实施方案中，一种或多种IL-21/IL-21R拮抗剂可以与一种或多种抗炎药、免疫抑制剂或代谢抑制剂或酶抑制剂一起配制和/或一起给予。可与本文所述的IL-21拮抗剂联合使用的药物或抑制剂的非限制性实例包括但不限于一种或多种以下药物非甾体抗炎药(NSAID)，例如布洛芬、替尼达普(参见例如Arthritis &Rheumatism(1996)，第39卷，第9期(增刊)，S280))、奈普生(参见例如Neuro Report(1996)第7卷，第1209-1213页)、美洛昔康、吡罗昔康、双氯芬酸和吲哚美辛；柳氮磺吡啶(参见例如Arthritis &Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S281)；皮质类固醇，例如泼尼松龙；细胞因子抑制性抗炎药(CSAID)；核苷酸生物合成抑制剂，例如嘌呤生物合成抑制剂、叶酸拮抗剂(例如甲氨蝶呤(N-[4-[[(2，4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]甲氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸)；和嘧啶生物合成抑制剂，例如二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)抑制剂(例如来氟米特(参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S131；Inflammation Research(1996)第45卷，第103-107页)。用于与IL-21/IL-21R拮抗剂联用的优选治疗药包括NSAID、CSAID、(DHODH)抑制剂(例如来氟米特)和叶酸拮抗剂(例如甲氨蝶呤)。
其它抑制剂的实例包括一种或多种以下药物皮质类固醇(口服、吸入和局部注射)；免疫抑制药，例如环孢菌素、他克莫司(FK-506)；和mTOR抑制剂，例如西罗莫司(雷帕霉素)或雷帕霉素衍生物，例如可溶性雷帕霉素衍生物(例如雷帕霉素酯衍生物，例如CCI-779(Elit.(2002)Current Opinion Investig.Drugs 3(8)1249-53；Huang等(2002)Current Opinion Investig.Drugs 3(2)295-304)；干扰促炎细胞因子信号转导的药物，所述促炎细胞因子例如TNFα或IL-1(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)；COX2抑制剂，例如塞来考昔及其变体，MK-966，参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S81)；磷酸二酯酶抑制剂，例如R973401(磷酸二酯酶IV型抑制剂；参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S282))；磷脂酶抑制剂，例如胞质磷脂酶2(cPLA2)抑制剂(例如三氟甲酮类似物(U.S.6,350,892))；血管内皮细胞生长因子或生长因子受体的抑制剂，例如VEGF抑制剂和/或VEGF-R抑制剂；和血管生成抑制剂。与IL-21/IL-21R拮抗剂联用的优选的治疗药包括免疫抑制药，例如环孢菌素、他克莫司(FK-506)；和mTOR抑制剂，例如西罗莫司(雷帕霉素)或雷帕霉素衍生物，例如可溶性雷帕霉素衍生物(例如雷帕霉素酯衍生物，例如CCI-779；COX2抑制剂，例如塞来考昔及其变体；和磷脂酶抑制剂，例如胞质磷脂酶2(cPLA2)抑制剂(例如三氟甲酮类似物)。
可与IL-21/IL-21R拮抗剂联合使用的其它治疗药的实例包括一种或多种以下药物6-巯基嘌呤(6-MP)；硫唑嘌呤柳氮磺吡啶(sulphasalazine)；美沙拉秦；奥沙拉秦氯喹/羟氯喹；青霉胺；金硫丁盐(aurothiornalate)(肌内和口服)；硫唑嘌呤；秋水仙碱(colchicine)；β-2肾上腺素受体激动剂(沙丁胺醇、特布他林、沙美特罗(salmeteral))；黄嘌呤(茶碱、氨茶碱)；色甘酸盐；奈多罗米；酮替芬；异丙阿托铵和氧托铵；麦考酚酸吗乙酯；腺苷激动剂；抗血栓药；补体抑制剂；和肾上腺素能药。
下面进一步详细讨论本文所公开的IL-21/IL-21R拮抗剂与其它治疗药联合用于治疗或预防具体免疫性疾病。
可以与IL-21/IL-21R拮抗剂联用以治疗或预防关节炎(例如RA、炎性关节炎、青少年RA、OA和银屑病性关节炎)的药物的非限制性实例，包括一种或多种以下药物本文所述的IL-12拮抗剂，NSAID；CSAID；TNF拮抗剂例如本文所述的TNFα拮抗剂；本文所述的非消耗性抗CD4抗体；本文所述的IL-2拮抗剂；抗炎细胞因子，例如IL-4、IL-10、IL-13和TGFα，或其激动剂；本文所述的IL-1拮抗剂或IL-1受体拮抗剂)；本文所述的磷酸二酯酶抑制剂；本文所述的COX-2抑制剂；伊洛前列素(参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S82)；甲氨蝶呤；沙利度胺(参见例如Arthritis& Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S282)和沙利度胺相关药物(例如Celgen)；来氟米特；血纤蛋白溶酶原激活抑制剂，例如氨甲环酸(参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S284)；细胞因子抑制剂，例如T-614；参见例如Arthritis &Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S282)；前列腺素E1(参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S282)；硫唑嘌呤(参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S281)；白介素-1转化酶(ICE)抑制剂；zap-70和/或lck抑制剂(酪氨酸激酶zap-70或lck抑制剂)；本文所述的血管内皮细胞生长因子抑制剂或血管内皮细胞生长因子受体抑制剂；本文所述的血管生成抑制剂；皮质类固醇抗炎药(例如SB203580)；TNF转化酶抑制剂；白介素-11(参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S296)；白介素-13(参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S308)；白介素-17抑制剂(参见例如Arthritis &Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S120)；金；青霉胺；氯喹；羟氯喹；苯丁酸氮芥；环磷酰胺；环孢菌素；总淋巴辐射；抗胸腺细胞球蛋白；CD5-毒素；口服肽和胶原；氯苯扎利二钠；细胞因子调节剂(CRA)HP228和HP466(Houghten Pharmaceuticals，Inc.)；ICAM-1反义硫代磷酸寡聚脱氧核苷酸(ISIS 2302；IsisPharmaceuticals，Inc.)；可溶性补体受体1(TP10；T Cell Sciences，Inc.)；泼尼松；奥古蛋白；聚硫酸糖胺聚糖；二甲胺四环素；抗IL2R抗体；海洋鱼油和植物脂质(鱼和植物种子脂肪酸；参见例如DeLuca等(1995)Rheum.Dis.Clin.North Am.21759-777)；金诺芬；保泰松；甲氯芬那酸；氟芬那酸；静脉内免疫球蛋白；齐留通；麦考酚酸(RS-61443)；他克莫司(FK-506)；西罗莫司(雷帕霉素)；氨普立糖(therafectin)；克拉曲滨(2-氯脱氧腺苷)；和阿扎立平。优选的联合药物包括一种或多种IL-21拮抗剂与甲氨蝶呤或来氟米特的组合，以及在中度或重度类风湿性关节炎的情况下与环孢菌素联用。
与IL-21/IL-21R拮抗剂联合用于治疗关节炎的优选抑制剂的实例，包括TNF拮抗剂(例如与TNF结合的嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或体外产生的抗体或其抗原结合片段；TNF受体的可溶性片段，例如p55或p75人TNF受体或其衍生物，例如75kdTNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白、ENBRELTM)、p55kDTNF受体-IgG融合蛋白；TNF酶拮抗剂，例如TNFα转化酶(TACE)抑制剂)；IL-6、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-22的拮抗剂；T细胞和B细胞消耗剂(depleting agent)(例如抗CD4抗体或抗CD22抗体)；小分子抑制剂，例如甲氨蝶呤和来氟米特；西罗莫司(雷帕霉素)及其类似物，例如CCI-779；Cox-2和cPLA2抑制剂；NSAID；p38抑制剂、TPL-2抑制剂、Mk-2抑制剂和NFκb抑制剂；RAGE或可溶性RAGE；P-选择蛋白或PSGL-1抑制剂(例如小分子抑制剂，其抗体，例如抗P-选择蛋白的抗体)；雌激素受体β(ERB)激动剂或ERB-NFkb拮抗剂。可以与一种或多种IL-21/IL-21R拮抗剂一起配制和/或一起给予的最优选的其它治疗药，包括一种或多种以下药物TNF受体的可溶性片段，例如p55或p75人TNF受体或其衍生物，例如75kdTNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，ENBRELTM)；甲氨蝶呤、来氟米特或西罗莫司(雷帕霉素)或其类似物，例如CCI-779。
可以与IL-21-/IL-21R拮抗剂联用以治疗或预防多发性硬化的药物的非限制性实例包括以下药物干扰素，例如干扰素-α1a(例如AVONEXTM；Biogen)和干扰素-1b(BETASERONTM；Chiron/Berlex)；共聚物1(Cop-1；COPAXONETM；Teva PharmaceuticalIndustries，Inc.)；高压氧；静脉内免疫球蛋白；克拉曲滨(clabribine)；本文所述的TNF拮抗剂；皮质类固醇；泼尼松龙；甲泼尼龙；硫唑嘌呤；环磷酰胺；环孢菌素；甲氨蝶呤；4-氨基吡啶；和替扎尼定。可与IL-21联合使用的其它拮抗剂包括其它人细胞因子或生长因子的抗体或其它人细胞因子或生长因子的拮抗剂，所述细胞因子或生长因子例如TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-11、GM-CSF、FGF和PDGF。本文所述的IL-21拮抗剂可以与抗体联用，所述抗体是针对以下细胞表面分子的例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90或其配体。IL-21拮抗剂也可以与以下药物联用例如如上所述的甲氨蝶呤、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸吗乙酯、来氟米特、NSAID，例如布洛芬、皮质类固醇例如泼尼松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗血栓药、补体抑制剂、肾上腺素能药、干扰本文所述的促炎细胞因子信号转导的药物、IL-1b转化酶抑制剂(例如Vx740)、抗P7s、PSGL、TACE抑制剂、T细胞信号转导抑制剂例如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤(azathloprine)、6-巯基嘌呤、血管紧张素转化酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物和抗炎细胞因子(例如IL-4、IL-10、IL-13和TGF)。
可以与IL-21拮抗剂联合用于多发性硬化的治疗药的优选实例包括干扰素-β、例如IFNβ-1a和IFNβ-1b；克帕松(copaxone)、皮质类固醇、IL-1抑制剂、TNF抑制剂、针对CD40配体和CD80的抗体、IL-12拮抗剂。
可以与IL-21/IL-21R拮抗剂联合用于治疗或预防炎性肠病(节段性回肠炎；溃疡性结肠炎)的药物的非限制性实例包括以下药物布地奈德(budenoside)；表皮生长因子；皮质类固醇；环孢菌素、柳氮磺吡啶；氨基水杨酸盐；6-巯基嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝唑；脂氧合酶抑制剂；美沙拉秦；奥沙拉秦；巴柳氮；抗氧化剂；血栓烷抑制剂；IL-1受体拮抗剂；抗IL-1单克隆抗体；抗IL-6单克隆抗体；生长因子；弹性蛋白酶抑制剂；吡啶基-咪唑化合物；本文所述的TNF拮抗剂；IL-4、IL-10、IL-13和/或TGFb细胞因子或其激动剂(例如激动剂抗体)；IL-11；葡糖苷酸或葡聚糖-缀合的泼尼松龙、地塞米松或布地奈德的前体药物；ICAM-1反义硫代磷酸寡聚脱氧核苷酸(ISIS2302；Isis Pharmaceuticals，Inc.)；可溶性补体受体1(TP10；T CellSciences，Inc.)；缓释型美沙拉秦；甲氨蝶呤；血小板活化因子(PAF)拮抗剂；环丙沙星；和利多卡因。
在一个实施方案中，IL-21/IL-21R拮抗剂可以与一种或多种抗体联用，所述抗体针对参与调节免疫应答的其它靶标，所述免疫应答例如移植物排斥、移植物抗宿主病或其它免疫应答相关疾病。可以与本发明IL-21/IL-21R拮抗剂联合用于治疗或预防免疫应答的药物的非限制性实例包括以下药物针对细胞表面分子或其配体的抗体，包括但不限于CD25(IL-2受体-a)、CD11a(LFA-1)、CD54(ICAM-1)、CD4、CD40、CD40L、CD45、CD28/CTLA4、CD80(B7-1)和/或CD86(B7-2)。在又一个实施方案中，IL-21/IL-21R拮抗剂可与以下药物联用皮质类固醇；西罗莫司(雷帕霉素)和其类似物，例如CCI-779；环孢菌素A；FK506；FTY720；硫唑嘌呤；环磷酰胺；甲氨蝶呤；抗IL-2R抗体，例如巴利昔单抗、达昔单抗；cA2(嵌合抗TNFα抗体；REMICADETM，Centocor)；抗CD3抗体(例如莫罗单抗-CD3)；共聚物1(Cop-1；COPAXONETM；Teva Pharmaceutical Industries，Inc.)；脱氧精胍菌素；和麦考酚酸吗乙酯。
可与IL-21/IL-21R拮抗剂联合用于治疗或预防银屑病和其它皮肤病的药物的非限制性实例包括一种或多种以下药物CD2或LFA-3相互作用抑制剂(例如可溶性CD2-或LFA-多肽，例如Fc融合物，或针对CD2或LFA-3的抗体)、环孢菌素A、泼尼松、FK506、甲氨蝶呤、PUVA、UV线、甾体、类视色素、干扰素或氮芥。可与IL-21/IL-21R拮抗剂联用的优选药物的实例包括环孢菌素A和甲氨蝶呤。
可与IL-21/IL-21R拮抗剂联合用于治疗或预防哮喘的药物的非限制性实例包括一种或多种以下药物吸入用支气管扩张药，例如吡布特罗、比托特罗、奥西那林；β2-肾上腺素受体激动剂，例如沙丁胺醇、特布他林、沙美特罗、福莫特罗；抗毒蕈碱药，例如异丙托铵、氧托铵；系统性皮质类固醇，例如泼尼松、泼尼松龙、地塞米松；吸入用皮质类固醇，例如氟替卡松、布地奈德、倍氯米松、莫米松；白三烯拮抗剂，例如孟鲁司特钠、扎鲁司特；肥大细胞稳定剂，例如色甘酸二钠、奈多罗米；omalizumab(XOLAIRTM；Genentech/Novartis)；或本文所述的COX-2抑制剂。
可与IL-21/IL-21R拮抗剂联合用于治疗或预防狼疮(例如SLE)的药物的非限制性实例包括一种或多种以下药物IL-6/IL-6R拮抗剂，例如抗IL-6抗体或抗IL-6R抗体；NSAID；皮质类固醇，例如地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙、泼尼松；硫唑嘌呤、环磷酰胺、羟基氯喹或氯喹。
因此，本发明的另一方面涉及药盒，所述药盒用于联合给予IL-21/IL-21R拮抗剂和其它治疗性化合物。在一个实施方案中，药盒包含配制在药物载体中的一种或多种结合剂和至少一种药物例如治疗药，其配制为合适的一种或多种独立的药物制剂。
示例性的疾病 类风湿性关节炎是引起关节疼痛、肿胀、僵硬和功能减退的自身免疫性炎性疾病。类风湿性关节炎通常对称存在。该病累及腕关节和接近手的指关节。它也可累及关节之外的其它部位。另外，类风湿性关节炎病人可有疲劳、偶尔发热和全身不适。类风湿性关节炎诊断的阳性因子包括“类风湿因子”血抗体和瓜氨酸抗体。IL-21/IL-21R拮抗剂可用于治疗、预防或缓解类风湿性关节炎或一种或多种类风湿性关节炎症状。
系统性红斑狼疮(SLE)是导致不同身体组织炎症和损伤的自身免疫性疾病。SLE由针对自身DNA的自身抗体所介导。狼疮可累及许多身体部位，包括关节、皮肤、肾脏、心脏、肺、血管和大脑。尽管可出现不同症状，但是最常见的症状包括极度疲劳、关节疼痛或肿胀(关节炎)、不明发热、皮疹和肾脏问题(例如肾小球肾炎)。示例性的狼疮症状包括关节疼痛或肿胀、不明发热和极度疲劳。特征性的红色皮疹可在鼻子和脸颊上出现。皮疹也可在脸和耳朵、上肢、肩膀、胸和手上出现。狼疮的其它症状包括胸痛、脱发、贫血、口腔溃疡、手指和脚趾因寒冷和应激而苍白或紫红。某些人也会有头痛、眩晕、抑郁、精神错乱或癫痫。SLE诊断的阳性因子包括循环抗核抗体、抗DNA抗体和抗Sm抗体。IL-21/IL-21R拮抗剂可用于治疗、改善(缓解)或预防SLE或一种或多种SLE症状。
关节强硬性脊椎炎是自身免疫性疾病，它不仅累及脊椎、而且累及臀部、肩膀，而且膝(作为骨和关节周围的肌腱和韧带)也发炎，导致疼痛和僵硬。关节强硬性脊椎炎倾向于累及大龄青少年和刚成年的人。IL-21/IL-21R拮抗剂可用于治疗、预防或缓解关节强硬性脊椎炎或其一种或多种症状。
炎性肠病(IBD)是引起肠道炎症的疾病的统称。炎性肠病的两个实例是节段性回肠炎和溃疡性结肠炎。IL-21/IL-21R拮抗剂可用于治疗、预防或缓解炎性肠病或一种或多种炎性肠病症状。
节段性回肠炎引起小肠炎症。节段性回肠炎通常在小肠下段(回肠)发生，但是它也累及从口到肛门的消化道的任何部位。其炎症可发展至深达受累器官内衬，引起疼痛并使肠道频繁排空，导致腹泻。节段性回肠炎最常见症状是腹痛(通常在右下腹)和腹泻。也可出现直肠出血、体重减轻和发热。出血可以是严重而持续的，导致贫血。对肠道进行直接目测，可确定炎症范围。
溃疡性结肠炎为在大肠内衬引起炎症和溃疡的疾病。该炎症通常在直肠和结肠下段发生，但也可累及整个结肠。除了小肠末段(称为回肠末端)以外，溃疡性结肠炎较少累及小肠。炎症使结肠频繁排空，引起腹泻。在炎症杀伤结肠细胞内衬的部位形成溃疡；溃疡会出血并产生脓液。溃疡性结肠炎的最常见症状是腹痛和血性腹泻。患者也会有疲劳、体重减轻、食欲减退、直肠出血以及体液和营养损失。约半数患者具有轻度症状。其它则频繁发热、血性腹泻、恶心和严重腹部痉挛。溃疡性结肠炎也可引起关节炎、眼部炎症、肝病(肝炎、肝硬化和原发性硬化性胆管炎)、骨质疏松症、皮疹和贫血等问题。溃疡性结肠炎的诊断通常取决于血性粪便的鉴别和结肠直接目测。
银屑病为鳞屑剥落(scaling)和炎症的慢性皮肤病。当皮肤细胞从皮肤表面以下的来源处快速产生并在成熟之前就堆积在表面上，即可发生银屑病。通常这样的过程(也称为更新)需要约一个月时间，但是在银屑病中，仅需几天就发生。典型形式的银屑病导致银色鳞屑覆盖的增厚、发炎的皮肤斑块。这些斑块(有时也称为噬斑)通常会瘙痒或感觉疼痛。它们通常发生在肘、膝、腿的其它部位、腰背部、脸、手掌和脚底，但是它们也可发生在身体任何部位的皮肤上。银屑病的诊断主要根据是这些特征性症状。皮肤活检可用于诊断。IL-21/IL-21R拮抗剂可用于治疗、预防或缓解银屑病或一种或多种银屑病症状。银屑病性关节炎发生于某些银屑病(一种鳞屑脱落的皮肤病)患者。银屑病性关节炎通常累及手指和脚趾远端的关节，并伴有指甲和趾甲的变化。如累及脊柱时则会发生背痛。IL-21/IL-21R拮抗剂可用于治疗、预防或缓解银屑病或一种或多种银屑病或银屑病性关节炎症状。
肾小球病包括增殖和非增殖性疾病。肾小球肾炎为具有肾小球内炎症和细胞增殖的疾病(参见例如Hricik等(1998)New Eng.J.Med.339888-99。非增殖性和硬化性肾小球病包括膜性肾小球病、糖尿病性肾病、局灶性节段性肾小球硬化症、薄基底膜病、淀粉样变性、轻链肾病、HIV肾病、家族性出血性肾炎(Alport′s syndrome)、药物诱发的肾小球病和微小病变(minimal-change disease)。伴随肾小球病的炎症的发生主要是因为自身免疫所致的抗体介导的肾小球损伤。体液免疫活化可导致产生针对肾小球细胞表面(例如基底膜)抗体，而且循环抗原-抗体复合物沉积在肾小球上，据报道能引起肾小球肾炎。因此，肾小球损伤和肾小球肾炎通常是由较大的系统性自身免疫性疾病(例如SLE、肝炎和纤维变性病)所致。肾小球肾炎也与以下疾病有关IgA肾病、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、感染(由细菌、病毒、原生动物等引起)、脉管炎、冷球蛋白血症、遗传性肾炎、肉芽肿病(例如韦格纳肉芽肿病、镜下多血管炎(microscopicpolyan gitis)和丘-施综合征(Churg-Strauss syndrome))、肾小球基底膜病、古德帕斯彻综合征(Goodpasture′s syndrome)、肾炎综合征(发生于例如糖尿病、狼疮(例如SLE)、淀粉样变性、药物使用、癌症和感染)、脂肪营养不良、镰刀形细胞病、补体缺乏症、膜增殖性肾小球肾炎、狼疮性肾炎和狼疮膜性肾病。IL-21/IL-21R拮抗剂可用于治疗、改善或预防肾小球肾炎或一种或多种肾小球肾炎和其它肾小球病的症状。
IL-21/IL-21R拮抗剂可用于预防或治疗组织/移植排斥或排斥相关症状，例如在器官、组织或细胞(例如心脏、肺、肝脏、肾脏、胰腺或骨髓)移植之前、期间或之后。当宿主生物的免疫系统产生针对移植组织(例如同种同体、同种异体或异种异体组织)中的非自身抗原的免疫应答时，会发生移植排斥。排斥可由例如抗体、淋巴细胞介导或同时由这两种介导，排斥可表现为不同方式，包括例如超急性排斥(例如在移植后的早期)、急性排斥和慢性排斥(通常是缓慢发展的过程，使移植物功能逐渐减退)。排斥通常伴随炎症，并可导致移植组织或器官损伤和/或失败，例如血管病、纤维化或器官功能减退。在排斥期间，宿主会有全身不适、移植部位疼痛或肿胀和/或发热。可以通过活体检查排斥体征或者通过评价器官功能，来监控器官和组织移植物的排斥现象。排斥的组织病理学体征包括例如II类HLA抗原表达增加，例如在肾移植后在肾小管细胞中。可以通过例如测定胆红素和肝酶(例如碱性磷酸酶)血清水平来评价肝功能；可以通过例如测定血清肌酸水平来评价肾功能。
骨关节炎(OA)的特征是关节软骨破坏。这使骨在软骨下彼此摩擦，引起关节疼痛、肿胀和运动减退。随时间延长，关节可失去正常形状，在关节边缘长出骨刺或骨赘。另外，少数骨或软骨会破碎并漂浮在关节间隙中，引起更多疼痛和损伤。OA病人通常都有关节痛和运动受限。与其它类型的关节炎不同，OA仅累及关节，并不累及内脏。OA诊断的阳性因子包括经X光可见的软骨丢失。IL-21/IL-21R拮抗剂可用于治疗、预防或缓解OA或一种或多种OA的症状。
呼吸性疾病 IL-21/IL-21R拮抗剂可用于治疗呼吸性疾病，包括但不限于哮喘(例如变应性和非变应性哮喘)；支气管炎(例如慢性支气管炎)；慢性阻塞性肺病(COPD)(例如肺气肿，例如香烟诱发的肺气肿)；涉及气道炎症的病症、嗜酸性粒细胞增多症、纤维化和产生过多粘液，例如囊性纤维化、肺纤维化和变应性鼻炎。
治疗或预防哮喘的方法包括治疗或预防外源性哮喘(也称为变应性哮喘或特应性哮喘)、内源性哮喘(也称为非变应性哮喘或非特应性哮喘)或这两者的组合(称为混合型哮喘)的方法。外源性或变应性哮喘包括由变应原引起或与变应原相关的疾病，所述变应原例如花粉、孢子、稻草或杂草、宠物鳞屑、灰尘、螨虫等。因为一年中的不同时间点存在特有的变应原和其它刺激物，所以这类疾病也称为季节性哮喘。外源性哮喘也包括支气管哮喘和变应性支气管肺曲霉病。
本发明方法可治疗或缓解的哮喘包括由感染因子引起的哮喘，所述感染因子例如病毒(例如感冒和流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、副粘病毒、鼻病毒和流感病毒)。RSV、鼻病毒和流感病毒感染常见于儿童，病毒感染是婴幼儿呼吸道疾病的主要原因。病毒性细支气管炎儿童可发展成慢性喘鸣和哮喘，这些病可用本发明的方法进行治疗。还包括某些哮喘患者在运动和/或遇冷空气时会导致的哮喘。这些方法可用于吸烟暴露相关哮喘(例如香烟诱发的和工业烟雾)，以及工业和职业暴露，例如烟雾；臭氧；有害气体；二氧化硫；一氧化二氮；烟尘，包括异氰酸盐，来自油漆、塑料、聚氨酯、清漆等；木头、植物或其它有机灰尘等。所述方法也可用于食品添加剂、防腐剂或药理学试剂相关的哮喘。也包括治疗、抑制或缓解无症状哮喘(silent asthma)或咳嗽变体哮喘(cough variant asthma)等哮喘类型的方法。
本文公开的方法也可用于治疗和缓解胃食管反流(GERD)相关哮喘，这样的反流可刺激支气管收缩。GERD(伴随持续体液分泌、镇咳和暴露给卧室内的变应原和刺激物)能导致哮喘性病症，统称为夜间哮喘。在治疗、抑制或缓解GERD相关哮喘的方法中，可按本文所述将药用有效量的IL-21/TL-21R拮抗剂与药用有效量的GERD治疗药联用。这些药物包括但不限于质子泵抑制药，例如PROTONIX牌延迟释放的泮托拉唑钠片剂、PRILOSEC牌奥美拉唑(omeprazole)延迟释放胶囊剂、ACIPHEX牌雷贝拉唑钠(rebeprazolesodium)延迟释放片剂或PREVACID牌延迟释放的兰索拉唑(lansoprazole)胶囊剂。
特应性疾病及其症状 “特应性”是指具有发展成变态反应的固有趋势的一组疾病。特应性疾病的实例包括变态反应、变应性鼻炎、特应性皮炎和枯草热。可给予IL-21/IL-21R途径拮抗剂，以改善特应性疾病或其一种或多种症状。
变应性鼻炎(枯草热)的症状包括瘙痒、流涕、打喷嚏或鼻塞以及眼睛发痒。可给予IL-21/IL-21R途径拮抗剂，以改善一种或多种这些症状。
特应性皮炎为累及皮肤的慢性疾病。有关特应性皮炎的信息来自例如NIH Publication No.03-4272。在特应性皮炎中，皮肤变得很痒，导致充血、肿胀、皲裂、渗出透明液体，最终导致结痂和鳞屑脱落。在许多情况下，当疾病变坏(称为恶化或突发)一段时间，再一段时间是皮肤改善或完全变好(称为缓解)。特应性皮炎常称为“湿疹”，该术语是几类皮肤炎症的统称。特应性皮炎是多种湿疹中最常见的。特应性皮炎的实例包括变应性接触性湿疹或皮炎(例如有时表现为红、痒、流泪反应，当皮肤接触外源物质例如毒葛或者乳膏和洗剂中的某些防腐剂时)；接触性湿疹(例如包括发红、瘙痒和灼烧感等局部反应，当皮肤接触变应原或刺激物(例如酸、清洁剂或其它化学品)时；出汗障碍性湿疹(例如对手掌和脚底皮肤的刺激，特征是透明的、深的水泡，具有痒感和烧灼感)；神经性皮炎(例如头、小腿、腕部或前臂上因局部发痒(例如虫咬)导致的皮肤鳞屑斑块(当抓挠时更会刺激它们))；钱币状湿疹(例如受刺激的皮肤表现为钱币状斑决，通常在手臂、背、臀部和小腿，可能有硬皮、鳞屑，而且特别痒)；脂溢性湿疹(例如在头皮、脸、偶尔在身体的其它部位表现为黄色、油状、具有鳞屑的皮肤斑块)。其它具体症状还包括淤滞性皮炎、特应性褶皱(例如Dennie-Morgan褶)、唇炎、hyperlinear palms、色素沉着过多眼睑(眼睑因炎症或枯草热所致颜色变深)、鱼鳞病、毛发角化病、苔藓样变、丘疹和荨麻疹。可以给予IL-21/IL-21R途径拮抗剂，以改善一种或多种这些症状。
纤维变性病 尽管胶原的产生是高度受控过程，但是其紊乱会导致组织纤维化发展。纤维状材料的异常积累最终将导致器官衰竭(Border等(1994)New Engl.J.Med.3311286-92)。任何器官损伤都会导致刻板症(stereotypical)生理反应血小板诱发的止血，接着是炎性细胞流入并活化成纤维细胞。来自这些细胞类型的细胞因子驱动形成新的胞外基质和血管(肉芽组织)。肉芽组织的产生是一个谨慎而复杂的过程，其中蛋白酶抑制剂和胞外基质蛋白的表达被上调，而蛋白酶的表达减少会导致胞外基质的积累。
纤维变性症状的发展，无论是诱发的还是自发的，至少都是由成纤维细胞活性刺激而引起的。炎性细胞和活化成纤维细胞流入受损伤器官，依赖于这些细胞类型与间质基质的相互影响的能力，所述间质基质主要含有胶原。纤维组织增殖相关的许多疾病是慢性的，通常使皮肤病例如硬皮病恶化。包括肺纤维化在内的某些纤维化可能致命，这部分因为这一事实该病的现有治疗具有明显副作用，通常对减缓或终止纤维化进程无效(Nagler等(1996)Am.J.Respir.Crit.Care Med.1541082-86)。
纤维变性病包括以纤维化为特征的疾病，例如内脏纤维化、皮肤纤维变性病和眼纤维变性病。内脏(例如肝脏、肺、肾脏、心血管、胃肠道)纤维变性在以下疾病中发生例如肺纤维化、骨髓纤维变性、肝硬化、系膜增殖性肾小球肾炎、新月体性肾小球肾炎、糖尿病性肾病、肾间质纤维化、接受环孢菌素的患者的肾纤维化和HIV相关肾病。
皮肤纤维化疾病包括例如硬皮病、硬斑病、疤痕疙瘩、肥大性疤痕、家族性皮肤胶原瘤和胶原型结缔组织痣。眼纤维变性病包括例如糖尿病性视网膜病、术后疤疤形成(例如青光眼过滤手术后和斜视眼手术后)和增殖性玻璃体视网膜病。
本发明方法可治疗的其它纤维变性疾病包括类风湿性关节炎、延长的关节痛和恶化关节相关疾病、系统性硬化病(包括进行性系统性硬化病)、多肌炎、皮肌炎、嗜酸性粒细胞性筋膜炎、硬斑病(局限性硬皮病)、雷诺综合征(Raynaud′s syndrome)和鼻息肉病。
可给予IL-21/IL-21R途径拮抗剂，以治疗或预防纤维变性病，或改善一种或多种这些疾病的症状。
测定IL-21/IL-21R拮抗剂作为细胞因子产生和细胞增殖/分化调节剂的活性的试验 可以使用任一种常规因子依赖性细胞增殖试验，对包括但不限于以下的细胞系，测定IL-21/IL-21R拮抗剂作为细胞因子产生和细胞增殖/分化调节剂的活性32D、DA2、DA1G、T10、B9、B9/11、BaF3、MC9/G、M+(preB M+)、2E8、RB5、DA1、123、T1165、HT2、CTLL2、TF-1、Mo7e和CMK。
T细胞或胸腺细胞增殖的测定法包括但不限于以下文献中描述的方法Current Protocols in Immunology，J.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach，W Strober(编著)，Pub.Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(第3章，In vitroassays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19；第7章，Immunologicstudies in Humans)；Takai等(1986)J.Immunol.1373494-500；Bertagnolli等(1990)J.Immunol.1451706-12；Bertagnolli等(1991)Cellular Immunology 133327-341；Bertagnolli等(1992)J.Immunol.1493778-3783；Bowman等(1994)J.Immunol.1521756-61。细胞因子产生和/或脾细胞、淋巴结细胞或胸腺细胞增殖的测定方法包括但不限于以下文献中介绍的方法Polyclonal T cell stimulation，Kruisbeek，A.M.和Shevach，E.M.载于Current Protocols in Immunology.J.E.e.a.Coligan(编著)，第1卷，第3.12.1-3.12.14页，John Wiley and Sons，Toronto.1994；和Measurement of mouse and human Interferon gammma，Schreiber，R.D.载于Current Protocols in Immunology.J.E.e.a.Coligan(编著)，第1卷，第6.8.1-6.8.8页，John Wiley and Sons，Toronto.1994。
造血细胞和淋巴细胞生成细胞增殖和分化的测定方法包括但不限于以下文献中描述的方法Measurement of Human andMurine Interleukin 2 and Interleukin 4，Bottomly，K.，Davis，L.S.和Lipsky，P.E.载于Current Protocols in Immunology.J.E.e.a.Coligan(编著)，第1卷，第6.3.1-6.3.12页，John Wiley and Sons，Toronto.1991；deVries等(1991)J.Exp.Med.1731205-11；Moreau等(1988)Nature336690-92；Greenberger等(1983)Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.802931-38；Measurement of mouse and human interleukin 6，Nordan，R.载于Current Protocols in Immunology.J.E.e.a.Coligan(编著)，第1卷，第6.6.1-6.6.5页，John Wiley and Sons，Toronto.1991；Smith等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.831857-61；Measurement of humanInterleukin 11，Bennett，F.，Giannotti，J.，Clark，S.C.和Turner，K.J.载于Current Protocols in Immunology.J.E.e.a.Coligan(编著)，第1卷，第6.15.1页，John Wiley and Sons，Toronto.1991；Measurement of mouseand human interleukin 9，Ciarletta，A.，Giannotti，J.，Clark，S.C.和Turner，K.J.载于Current Protocols in Immunology.J.E.e.a.Coligan(编著)，第1卷，第6.13.1页，John Wiley and Sons，Toronto.1991。
用于响应抗原的T细胞克隆测定法(鉴定其中影响APC-T细胞相互作用的蛋白并通过测定增殖和细胞因子产生而指导T细胞效应)包括但不限于以下文献中描述的方法Current Protocols inImmunology，J.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach，W Strober(编著)，Pub.Greene Publishing Associates和Wiley-Interscience(第3章，In vitro assays for Mouse Lymphocyte Function；第6章，Cytokines and their cellular receptors；第7章，Immunologicstudies in Humans)；Weinberger等(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.776091-95；Weinberger等(1981)Eur.J.Immun.11405-11；Takai等(1986)J.Immunol.1373494-500；Takai等(1988)J.Immunol.140508-12。
实施例 本发明由以下非限制性实施例进一步说明。
实施例1鼠MU-1 cDNA的分离和表征 通过PCR，使用来自人序列的寡核苷酸，分离出MU-1受体鼠同源物的部分片段。从17日龄鼠胸腺和鼠2D6 T细胞系中分离RNA，并由它制备cDNA。通过PCR，从cDNA扩增约300个核苷酸的DNA片段，用以下寡核苷酸分别对应于图1的人cDNA序列(对应于SEQ ID NO1)的584-603和876-896的区域AGCATCAAGCCGGCTCCCCC(5p)(SEQ ID NO11)CTCCATTCACTCCAGGTCCC(3p)(SEQ ID NO12)用Taq聚合酶/1X Taq缓冲液(含有1.5mM氯化镁)进行扩增，30次循环，94℃1分钟，50℃1分钟，72℃1分钟。测定该片段的DNA，两个寡核苷酸都来自该片段的内部，其序列如下TTGAACGTGACTGRGGCCTT(5P)(SEQ ID NO13)TGAATGAAGTGCCTGGCTGA(3P)(SEQ ID NO14) 寡核苷酸用于扩增原PCR产物的内部262个核苷酸的片段(对应于图1的鼠cDNA序列的核苷酸781-1043，以及SEQ ID NO9)，以便用作杂交探针，来筛选从2D6T细胞系分离的cDNA文库。用标准5X SSC杂交条件，在65℃使滤膜(Filters)杂交，并在SSC中在65℃洗涤。在426,000克隆中筛选并分离与探针杂交的20个克隆。用两个单独的克隆测定DNA序列。克隆#6全长序列证实，它确实是人MU-1的全长鼠同源序列(SEQ ID NO9)。
鼠MU-1的全长核苷酸序列见图1(对应于SEQ ID NO9)。该核苷酸序列在核苷酸407-464具有预测的前导序列，在核苷酸407-1993具有编码序列，在核苷酸1994-1996具有终止密码子。核苷酸1-406对应于5′非翻译区，而核苷酸1997-2628对应于3′非翻译区(SEQ ID NO9)。
鼠MU-1的预测蛋白质序列见图2(对应于SEQ ID NO10)。这个鼠MU-1蛋白经SPScan测定含有预测的前导序列(得分＝10.1)(对应于SEQ ID NO10的氨基酸1-19)和预测跨膜域(对应于SEQ IDNO10的氨基酸237-253)。预测信号基序包括图2B中的以下各区盒1SEQ ID NO10的氨基酸265-274；盒2SEQ ID NO10的氨基酸310-324，六个酪氨酸位于SEQ ID NO10的氨基酸位置281、319、361、368、397和510。潜在的STAT泊位包括STAT5EDDGYPA(SEQ ID NO20)；STAT3YLQR。
实施例2人和鼠MU-1的比较 GAP算法用于比较人和鼠MU-1氨基酸。用人IL-5受体的70个氨基酸区(SEQ ID NO3)搜索GenBank数据库，用PCR引物(SEQ ID NO4和5)和杂交寡核苷酸(SEQ ID NO6和7)克隆人MU-1。鼠和人预测蛋白质序列的比较见图4。用GAP算法，其氨基酸具有65.267％同一性。通过BLOSUM62氨基酸取代矩阵产生比对(Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8910915-19)。空位参数＝空位权重8，平均匹配＝2.912，长度权重＝2，平均错配＝-2.003；％相似性＝69.466。
人和鼠cDNA核苷酸序列的比较见图3。DNA序列具有66.116％的同一性，当用GAP进行比对时。空位参数空位权重＝50，平均匹配10.000，长度权重＝3，平均错配＝0.000，％相似性＝66.198。
人和小鼠MU-1蛋白质都是I型细胞因子受体超家族成员。对鼠和人MU-1序列进行评价，揭示出潜在的盒-1和盒-2信号基序的存在。六个酪氨酸残基存在于胞质区，它在MU-1信号传导功能上具有重要作用。将MU-1的序列与该家族其它成员进行比较，表明STAT 5和STAT 3的潜在泊位的存在。
实施例3人MU-1所用的STAT信号传导途径的测定 BAF-3细胞经基因工程改造以表达嵌合细胞因子受体，该受体由人EPO受体胞外域和MU-1受体胞内域组成。表达huEPORJMU-1(cyto)嵌合受体的BAF-3细胞响应人可溶性EPO而增殖。分析这些细胞以确定哪种STAT分子在响应EPO信号传导后发生磷酸化。简而言之，在含有IL-3的生长培养基中，对照未修饰亲代BAF-3细胞和EPOR/MU嵌合BAF-3细胞是静息的，用IL-3或EPO重新刺激0分钟、15分钟、30分钟和60分钟。沉淀细胞，重悬于含有原矾酸盐的冰冷的裂解缓冲液中，以保存磷酸化酪氨酸。等量的细胞裂解液进行SDS-PAGE电泳，再转印到硝酸纤维素膜上，进行蛋白质分析。通过使用对磷酸化和非磷酸化形式的STAT分子具有特异性的抗体，将磷酸化和非磷酸化形式的STAT 1、3、5和6双份印迹进行染色。未活化的和用α-干扰素活化的HELA细胞用作阳性对照。
这些结果表明在这些具体情况下，通过MU-1的信号传导导致所有测试时间点(T＝0′，T＝15′，T＝30′，T＝60′)的STAT 5磷酸化。用IL-3处理对照或嵌合BAF-3细胞，引起STAT 3、而不是STAT1或5的磷酸化。
实施例4鼠和人MU-1的组织表达实施例4.1RNA分析 按照制造商(Clonetech，PaloAlto，CA)推荐的方法，对来自不同组织的polyA+RNA进行RNA印迹。对于鼠印迹，对应于图1的核苷酸781-1043和SEQ ID NO9的262个核苷酸片段用于杂交。
在成年鼠的脾、肺和心脏组织中检测到一种鼠MU-1转录物。在人组织中观察到的更大的转录物在小鼠组织中未见。
在成人淋巴组织、PBL、胸腺、脾和淋巴结以及胎儿肺中检测到人MU-1的两种转录物。
实施例4.2原位杂交 由Phylogency Inc.(Columbus，OH)进行原位杂交研究(按照Lyons等(1990)J.Cell.Biol.1112427-36所述方法)。简而言之，将连续的5-7微米石蜡切片脱蜡，固定，用蛋白酶K消化，用三乙醇胺处理并脱水。从线状cDNA模板制备cRNA，产生反义和有义探针。按照制造商的条件(Ambion)合成cRNA转录物并用35S-UTP标记。将片段杂交过夜，在严格性条件下洗涤，再用RNA酶A处理，然后浸泡在核示踪乳液(nuclear track emulsion)中暴露2-3周。对照片段与有义探针杂交，以标明该过程的背景水平。鼠探针由对应于核苷酸860-1064的186-bp片段(SEQ ID NO9)组成。人探针是来自人MU-1DNA的23-bp PCR产物。
在成年小肠生发中心的淋巴结中观察到鼠MU-1的表达。特化的淋巴结和派氏结(Peyers patches)也显示出鼠MU-1的表达。
在皮层淋巴结生发中心检测到人MU-1的表达。含有巨噬细胞的髓质(medulla)是人MU-1阴性。在人脾脏的白髓区(而不是红髓区)检测到人MU-1的表达。
实施例5人MU-1在细胞和细胞系中的表达 在静息和活化人T细胞和B细胞系Raji和RPMI 8866，以及T细胞系Jurkat上，进行RNA酶保护分析。人T细胞用抗CD3和抗CD28活化。细胞系用佛波醇酯和伊屋诺霉素活化。通过将23-bp PCR产物插入到pGEM3zf(-)(Promega，Madison，WI)载体的BamHI和HindIII位点，构建产生MU-1核糖核酸探针的质粒(用5′引物CACAAAGCTTCAGTATGAGCTGCAGTACAGGAACCGGGGA(SEQ ID NO15)和3′引物CACAGGATCCCTTTAACTCCTCTGACTGGGTCTGAAAGAT(SEQID NO16)，进行PCR)。为了制备核糖核酸探针，将产生核糖核酸的质粒用HindIII线性化。所得DNA经苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀。按照销售商(PharMingen，San Diego，CA)建议的方案，用T7 RNA聚合酶制备核糖核酸探针。用PharMingen的RIBOQUANTTMMulti-ProbeRibonuclease Protection Assay系统进行RNA酶保护测定。每次RPA反应含有2.0μg总RNA，RNA酶消化后，受保护的核糖核酸探针用于QUICKPOINTTM快速核酸分离系统(Novex，San Diego，CA)。按照销售商的说明，干燥凝胶并暴露。
与未刺激的细胞群体相比，在抗CD3+抗CD28刺激的人纯化CD3+细胞中，人MU-1 RNA被上调。在Th1和Th2-skewed T细胞群体中，经再次刺激后，MU-1也被上调。B细胞系RPMI 8866和Raji组成型地表达MU-1，而Jurkat T细胞系却不是这样。
实施例6人MU-1与已知细胞因子的结合 构建人和鼠Ig融合蛋白并固定到Biacore芯片上，试图鉴定MU-1的配体。评价各种细胞培养用条件培养基以及一组已知细胞因子对MU-1的结合能力。也测定了一些细胞因子与该家族的其它受体链的组合，以便考虑MU-1需要第二受体链用于配体结合的可能性。测定了以下细胞因子，发现它们对MU-1结合呈阴性mIL-2、hIL-2、hTL-15、mIL-7、TSLP、TSLP+IL-7、TSLP+IL-7R、TSLP+IL-7g、TSLP+IL-2、TSLP+IL-2+IL-2Rβ、IL2-Rβ、IL-2Rγ、IL-7R、IL-2+IL-2Rβ、IL-2+IL-2Rγ、BL-15+IL-2Rβ、IL-15+IL-2Rγ、IL-7+IL-2Rγ、IL-2+IL-7R、IL-15+IL-7R、IL-7+IL-7R。已知受体也被固定并检测MUFc结合，得到阴性结果。IL-15可与IL-2Rb结合，但不与IL-2Rg或MUFc结合。
实施例7在胶原诱发关节炎(CIA)小鼠中，抑制IL-21/IL-21R活性能改善症状的严重程度 该实施例表明，在CIA鼠模型中，IL-21R拮抗剂，例如IL-21R-Ig融合蛋白(鼠IL-21RFc蛋白或“muIL-21RFc”)或抗IL-21R抗体改善其症状。
所有实验均使用雄性DBA/1(Jackson Laboratories，BarHarbor，ME)小鼠。关节炎是用II型牛胶原(Chondrex，Redmond，WA)诱发的。将II型牛胶原(Chondrex)溶于0.1M乙酸中，且在等体积的含有1mg/ml结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)菌株H37RA的完全弗氏佐剂(Sigma)中乳化。第0天，在尾端部皮下注射100μg牛胶原。第21天，给小鼠的尾端部皮下注射用与等体积的不完全弗氏佐剂(Sigma)混合的含有100μg牛胶原的0.1M乙酸溶液。首次用于实验的动物接受相同组的注射，只是没有胶原。给药方案见图16的示意图。将MuIL-21RFc预防性或治疗性给予DBA小鼠。在治疗方案中，如果连续两天都观察小鼠得病，则开始进行治疗。
每周监控小鼠至少三次，观察疾病进程。根据以下指数，给四肢进行临床评分0＝正常，无肿胀；1＝可见红斑，伴有1-2个肿大趾头，或在踝部有轻度肿胀；2＝明显红斑，特征是脚爪肿胀和/或两个趾头轻度至中度肿胀；3＝整个脚爪大范围肿胀，延伸到踝关节或腕关节；4＝肿胀消退，脚爪关节僵硬；四肢使用困难或关节僵硬。因此，任一给定小鼠四肢评分之和，得出的最大总身体评分为16。
在疾病的不同阶段，给动物实施安乐死，切取组织，将脚爪在10％福尔马林中固定(供组织学分析用)，或者在4％低聚甲醛(pH 7.47)固定，用20％EDTA(pH 8.0)脱钙，然后石蜡包埋(供原位杂交用)。用光学显微镜及5级评分方法(0-4)对脚爪进行评分，以表征关节炎的强度和范围。除了其它炎性相关变化用于评分外，炎性浸润也用于评分，所述炎性相关变化例如关节翳形成、滑膜纤维化、关节软骨侵蚀和/或软骨下骨破坏。组织学分级用每个脚爪的读数来确定NAD＝0或未发现异常；1轻微至中度；2轻度至中度；3明显；4大量。
从胶原再次刺激前一天开始，经腹膜内(IP)隔天给予CIA小鼠muIL-21RFc(100μg或200μg)进行预防性治疗，治疗后，观察到症状的严重程度下降(数据未显示)。
muIL-21RFc(200μg)小鼠，3次/周)对半治疗性CIA小鼠的效果是治疗后天数的函数，见图17。用小鼠Ig(200μg/小鼠，3次/周)作为对照。从治疗后7天开始，可见严重程度评分下降。
这些实验证明，将IL-21R拮抗剂例如IL-21R-Fc融合蛋白给予CIA小鼠，无论是预防性还是半治疗性，都显著改善了关节炎症状。
实施例8IL-21R转录物的原位杂交 测定CIA小鼠的患有关节炎的脚爪中IL-21R mRNA的表达。使用反义鼠IL-21R核糖核酸探针(图18A)；有义探针用作阴性对照(图18B)。按照制造商的说明，使用DIG RNA标记混合物(RocheDiagnostics，Mannheim，Germany)，制备洋地黄毒苷标记的探针。在巨噬细胞、嗜中性粒细胞、成纤维细胞、淋巴细胞亚群、滑膜细胞和表皮中检测到IL-21受体mRNA的表达(图18A)。在对照脚爪中或使用有义探针可观察到染色减少(图18B)。mIL-21R mRNA阳性细胞是嗜中性粒细胞(N)和巨噬细胞(M)。原位杂交表明在关节炎小鼠的脚爪中IL-21R的表达增加。
实施例9在HLA-B27大鼠模型中，对IL-21/IL-21R活性的抑制，改善了IBD样症状的严重程度 该实施例表明，在HLA-B27大鼠模型中，IL-21R拮抗剂，例如IL-21R-Ig融合蛋白(鼠IL-21RFc蛋白或“muIL-21RFc”)或抗IL-21R抗体，改善了IBD样症状。
如本文所述，产生鼠IL-21受体-Fc融合多肽(MuIL-21RFc)，并在HLA-B27大鼠模型中评价其缓解肠道炎症的能力。HLA-B27大鼠模型已广泛用于评价IBD疗法，因为该模型中观察道的肠道炎症的某些临床、组织学和免疫特征与人类IBD的相同(有关综述参见例如Elson等(1995)Gastroenterology，1091344-67；Blanchard等(2001)European Cytokine Network 12111-18；Kim等(1999)Arch.Pharm.Res.22354-60)。例如，HLA-B27大鼠过量表达人类主要组织相容性复合体I等位B27和B2微球蛋白基因产物。这样的基因产物与慢性炎性疾病例如IBD的发展有关。
用于研究的大鼠已经患有慢性胃肠道(GI)炎症，证据是持续腹泻的临床体征。根据以下指数对粪便进行临床评分(0-3)0＝正常，具有成形粪便；1＝软，具有成形粪便；2＝松散，没有成形粪便；和3＝水样腹泻(参见图19)。在疾病进程中评价粪便期间，对大鼠进行监测达18天。临床评分为3表明持续腹泻(显示为IgG对照)。将MuIL-21RFc给予(6mg/kg IP，3次/周)5只HLA-B27转基因大鼠/组，达18天。另一组给予6mg/ml mEnbrel(可溶性TNF-受体Fc融合物)，即阳性对照。按相同的方式和剂量将IgG给予小鼠数目相同的第三组，作为对照。
与IgG对照相比，在用MuIL-21RFc和mEnbrel治疗的各组中，检测到临床评分明显下降(参见图19和图20)。在缓解EBD样症状方面，给予MuIL-21RFc显示出与给予mEnbrel类似功效。该研究结果证明，在HLA-B27大鼠模型中，与给予对照IgG的大鼠相比，给予MuIL-21RFc降低了肠道炎症，其功效类似于mEnbrel(参见图19和图20)。
组织学分析证实了以改善的粪便评分为代表的症状改善。就溃疡、炎症、病灶深度和纤维化而言，经MuIL-21RFc治疗大鼠的评分，比用对照IgG治疗大鼠的评分明显更低(参见图21)。如上所述，进行组织学分析，临床评分0-2或0-3，其中更高评分表明在大鼠IBD模型中严重程度升高。相对于对照而言，在用MuIL-21RFc和mEnbrel治疗的所有组别中，都检测到肠道炎症的明显减少。在改善疾病严重程度的组织学体征方面，MuIL-21RFc表现出与mEnbrel类似的功效。为了支持将以上结果扩大到人类，图19(右图)显示在正常人肠道的淋巴细胞和淋巴结中MU-1 mRNA的原位杂交，表明MU-1 mRNA在与疾病有关的器官中的表达。
实施例10抑制IL-21/IL-21R活性，能延迟小鼠的同种异体皮肤移植排斥 该实施例表明，IL-21R拮抗剂，例如IL-21R-Ig融合蛋白(鼠IL-21RFc蛋白或“muIL-21RFc”)或抗IL-21R抗体，延迟小鼠同种异体皮肤移植排斥，因此延长了移植物的存活期。
在注射了逆转录病毒转导的T细胞的小鼠中，给予MuIL-21RFc可延迟同种异体皮肤移植排斥。图22是线状图，表明移植物存活百分比随过继转移后的天数的变化。在该模型中，裸小鼠显示康复同种异体皮肤移植，因为小鼠没有可检测的T细胞。当给裸小鼠注射活化B6 T细胞(经逆转录病毒工程化以分泌对照GFP或IL-21)，移植物就会被排斥(参见图22)。如果T细胞经基因工程改造以分泌MuIL-21RFc(其可望中和这些细胞产生的IL-21)的话，移植物存活更长时间，见图22(由IL-21R-Fc所示，与GFP和IL-21对照相比)。10只小鼠分别用于GFP和MuIL-21RFc；15只小鼠用于IL-21对照。这些结果证明了IL-21R拮抗剂在延长移植物存活期上的作用。
实施例11在CD45RBhi过继转移模型中，抑制IL-21/TL-21R活性会减少疾病症状 该实施例表明，在银屑病和炎性肠病(IBD)小鼠模型中，IL-21R拮抗剂例如IL-21R-Ig融合蛋白(鼠IL-21RFc蛋白或“muIL-21RFc”)或抗IL-21R抗体能改善症状。
将CD45RBhiCD4+幼稚T细胞转移给重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠，可导致结肠炎和/或皮肤损害类银屑病，这取决于笼养条件。首先，通过在选择CD4+T细胞的柱子上进行阴性选择，从脾细胞中分选出BALBc CD45RBhiCD4+T细胞(幼稚群体)，然后在通过选择高CD45表达的流式细胞术进一步分选。将4×105细胞的该群体转移给雌性C.B-17 SCID小鼠，对小鼠的银屑病和IBD的临床体征进行评分达几周。在静态笼养条件下的小鼠发生炎性肠病；而在带有空气流通变化的常规条件下关养的小鼠也发生银屑病。根据1-6的量表，对小鼠的银屑病进行评分1＝轻中度红斑(通常是眼睑和耳朵)＜2％的身体；2＝轻度鳞屑和中重度红斑(通常是耳朵和脸)2-10％的身体；3＝严重红斑和鳞屑(耳朵、脸和躯干)10-20％的身体；4＝非常严重红斑，占整个身体的20-40％；5＝非常严重红斑，占整个身体的40-60％；6＝非常严重红斑，占整个身体的60-100％。通过体重减轻和粪便评分对小鼠的IBD进行评分0＝正常；1＝软；2＝腹泻；3＝带有血和粘液的腹泻。
用muIL-21RFc进行治疗，对改善银屑病样症状有效。在患有皮肤炎症的小鼠中，与用抗柔嫩艾美耳球虫Ig治疗的对照小鼠相比，在CD45RBhi细胞转移后8周开始，通过腹膜内注射200μgmuIL-21RFc(3次/周)进行治疗，结果红斑、鳞屑和脱发都减少(图23)。与对照相比，在细胞转移的同时，用200μg muIL-21RFc(3次/周)治疗的CD45RBhi受体小鼠，结果在整个实验过程中，银屑病延迟发作而且临床疾病的严重程度降低(图35)。实验结果归纳在图36。
用muIL-21RFc进行治疗，对改善炎性肠到症状也有效。与Ig对照治疗小鼠相比，在细胞转移的同时，用200μg或400μgmuIL-21RFc治疗CD45RBhi受体小鼠，每周3次，结果通过体重减轻(图37)和粪便评分(图38)确定，结肠炎的临床体征明显减少。结果归纳在图39。对对照治疗的CD45RBhi受体的结肠进行肉眼评价，显示严重增厚和肿胀，而这些现象在用muIL-21RFc治疗的小鼠中几乎被完全抑制。从显微上看，与muIL-21RFc治疗的小鼠相比，对照治疗的小鼠的固有层/粘膜下层也显示出更大程度的上皮细胞增生和白细胞浸润。另外，测定对照治疗小鼠和muIL-21RFc治疗小鼠的血清细胞因子。在几种所测细胞因子中，仅可检出血清γ干扰素(IFN-γ)。与Ig对照治疗小鼠相比，用200μg或400μg剂量的muIL-21RFc进行治疗，结果显著降低了IFN-γ的血清水平(图40)。IFN-γ可用作IL-21R拮抗剂在IBD中的功效的生物标记。
通过增殖测定，检测CD45RBhi(幼稚)亚群和CD45RBlo(记忆)亚群对IL-21的响应。在IBD转移模型中，仅幼稚细胞导致疾病，并且疾病可以通过加入记忆群体而得以抑制。在该试验中，用与平板结合的抗CD3刺激纯化群体并测定为响应IL-21而掺入的3H-胸苷。与记忆群体相比，幼稚群体表现出响应IL-21的反应明显增加(图41)。这表明，IL-21对于该群体的体内扩增来说是重要的细胞因子。
将IL-21加入到培养物中的活化CD4+CD45RBhi细胞中，诱导多种细胞因子的分泌。抗CD3刺激的CD45RBhiCD4+T细胞用100单位/ml IL-2或1ng/ml、10ng/ml或100ng/ml IL-21处理。为了响应IL-21，CD45RBhi细胞分泌IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、IL-18、IL-22、IFN-γ和TNFα的水平升高(图42)。与用Ig对照处理的培养物相比，通过加入50μg/ml或100μg/ml muIL-21RFc，阻断内源性IL-21，结果这些培养物中的细胞因子水平下降(图43)。
总之，这些结果表明，IL-21在该模型的炎症响应中具有强效的潜在作用，IL-21R拮抗剂在Th1介导的疾病(例如节段性回肠炎和银屑病)中可起到治疗性益处。
实施例12缺乏IL-21R的小鼠表现出抗原诱发的气道炎症减轻 该实施例表明，缺乏IL-21受体的转基因敲出小鼠(IL-21R-/-)对抗原诱发的气道炎症和气道过度反应具有明显减少的反应。
第0天和第14天，IL-21R-/-和野生型(WT+/+)C57BL/6小鼠(8-12周龄)经腹膜内注射用2.25mg硫酸钾铝(Alum Inject；Pierce)乳化的20μg OVA。第26、27和28天，气道用5％OVA/PBS的气溶胶攻击30分钟。最后一次OVA攻击后48小时，评价气溶胶化的醋甲胆碱对动物在肺阻力和动态顺应性上的变化。与OVA致敏的PBS攻击的WT+/+小鼠相比，在OVA致敏和攻击WT+/+小鼠中，当给予醋甲胆碱气溶胶后，导致气道过度反应明显增加(图24)。然而，OVA-致敏/OVA攻击的IL-21R-/-小鼠与OVA致敏/OVA攻击的WT+/+小鼠相比，对所有剂量范围的气溶胶化的醋甲胆碱的气道过度反应都没有差异(图24)。
然后处死动物，收集血液和支气管肺泡灌洗液(BALF)，用于分析肺部炎症、细胞因子水平以及总效价和抗OVA IgE效价。用3×0.7ml PBS进行支气管肺泡灌洗，收集BALF。与IL-21R-/-动物的PBS-攻击的对照相比，OVA攻击后，WT+/+小鼠的总BALF细胞数增加约36倍，相比之下，PBS-攻击的对照增加3倍(图25A)。此外，OVA致敏/OVA攻击的IL-21R-/-小鼠的BALF内细胞总数，明显低于在OVA致敏/OVA攻击的WT+/+动物中所观察到的细胞总数。OVA致敏/PBS攻击的IL-21R-/-和WT+/+小鼠的BALF细胞总数没有差异(图25A)。与同样致敏但经PBS攻击的对照相比，在WT+/+和IL-21R-/-小鼠中，OVA攻击导致BALF嗜酸性粒细胞明显上升。与OVA致敏/OVA攻击的WT+/+动物相比，在IL-21-/-动物中，BALF嗜酸性粒细胞的绝对数量显著下降(图25B)。缺失IL-21R，在OVA攻击后也会明显减少BALF淋巴细胞数(图25C)和嗜中性粒细胞数(图25D)上的增加。
与PBS-攻击的对照相比，OVA致敏/攻击的WT+/+小鼠的BALF中IL-5、IL-13和TNFα水平明显升高(图26和27)。相比之下，与PBS-攻击的对照相比，OVA致敏和攻击在IL-21R-/-小鼠中诱发BALF内这些细胞因子水平的非常少量的升高，而且其水平要比在OVA致敏/OVA攻击的WT动物中所观察到的水平明显偏低(图26和27)。BALF中TNFα和IL-5水平用细胞计数珠阵列试剂盒(cytometricbead array kit)(小鼠Th1/Th2细胞因子CBA，BD Biosciences，San Diego，CA)定量测定。BALF中的IL-13水平通过ELISA定量测定。
如图28A-B所示，在OVA致敏/OVA攻击后，IL-21R-/-的血清总IgE和抗OVA IgE水平与相同治疗的WT+/+小鼠相比要低很多。然而，当PBS攻击后比较总IgE或OVA特异性IgE水平时，在IL-21R-/-和WT+/+小鼠中却没有显著性差异。
这些结果表明，抑制IL-21介导的反应，在治疗变态反应和哮喘中具有治疗价值。
实施例13在MRL-Faslpr狼疮模型中，抑制IL-21/IL-21R活性能改善症状的严重程度 该实施例表明，在MRL-Faslpr小鼠模型中，IL-21R拮抗剂例如IL-21R-Ig融合蛋白(鼠IL-21RFc蛋白或“muIL-21RFc”)或抗IL-21R抗体能改善系统性红斑狼疮(SLE)样症状。
所有实验都使用雄性MRL-Faslpr小鼠。这些小鼠具有类似于人SLE的多种症状，包括DNA自身抗体，多组织的破坏，以及免疫复合物性肾小球肾炎。在10周龄，开始将400μg MuIL-21RFc或同种型对照经腹膜内注射，每周3次，每周分析小鼠的疾病发展。在第15周处死小鼠用于进一步分析。各治疗组有10只小鼠。
在MRL-Faslpr小鼠中，经ELISA检测，MuIL-21RFc治疗能明显降低循环抗dsDNA自身抗体水平(图29)和血清总IgG水平(图30)。简而言之，对于抗dsDNA自身抗体的检测，将dsDNA包被在滴定板上，加入血清抗体，再用抗小鼠的第二抗体来检测所述抗体。对于总IgG的检测，将血清吸附到滴定板上，再用抗小鼠的第二抗体进行检测。
用MuIL-21RFc进行治疗，也能减少IgG沉积物在MRL-Faslpr小鼠肾脏中的积累。第15周，处死小鼠，将冷冻肾切片(5μm)用山羊抗小鼠IgG-FITC染色。按照从0-3的量表记录荧光强度。图31表明在治疗和对照小鼠肾脏中测定的总荧光强度。
这些结果表明，用IL-21R拮抗剂进行治疗性治疗可缓解狼疮样症状。
实施例14狼疮和GVHD动物模型在移植B6 bm12脾细胞的IL-21R缺陷型小鼠肾脏中，缺乏自身抗体形成和IgG沉积 进行实验，研究IL-21R敲出(KO)小鼠在系统性红斑狼疮(SLE)的慢性移植物抗宿主病(GVHD)模型中的反应(Chen等(1998)J.Immunol.1615880-85)。该模型包括SLE和GVHD的代表性方面。
所用的动物是B6.C-H2<bm12>/KhEG(bm12)，JacksonLabs(脾细胞)；IL-21R-2 KO小鼠，Charles River Labs(CRL)；C57/B6野生型(WT)小鼠，Charles River Labs；和C57/B6野生型小鼠，Taconic(TAC)(Germantown，NY)。
在诱发疾病的当天，通过CO2暴露处死合适的供体小鼠。收获脾脏并盖好。每个脾脏用0.16M NH4Cl∶0.17M TrisCl(9∶1)的1ml裂解液裂解红细胞，共裂解5分钟，偶尔混合一下。用锥虫蓝对细胞悬液计数，并用无菌磷酸缓冲盐溶液调节至终浓度为2×108细胞/ml。再给合适的受体小鼠经腹膜内注射0.5ml合适细胞悬液(见下表2)。然后，每周监测受体小鼠的尿蛋白和体重增减。每隔两周，给每只小鼠通过眼眶窦后(retro-orbital sinus)放血，贮存血清用于进一步分析。对各时间点收集的所有血清进行ELISA测定(如Zouali和Stollar(1986)J.Immunol.Methods 90105-10所述)，测定针对双链DNA的自身抗体。
疾病诱发后的第12周，使每组的半数动物安乐死，收集脾和肾。左肾保存(完整)在10％非缓冲福尔马林中，用H&E染色。按照Chen等(出处同上)所述方法，对染色进行评分。评分参数包括血管周围淋巴细胞性浸润，间质淋巴细胞性浸润，细胞过多(hypercellularity)和基底膜增厚。右肾纵向切片，每一半都将剖面向下放在组织封闭盒中。再用免疫组织化学技术分析右肾中的免疫沉积物，尤其是IgG、IgM和C3的存在。
表2
这些实验结果见图44。在任何IL-21R敲出小鼠的任何时间点，都没有检出抗dsDNA自身抗体(图44A)。另外，图44B表明，疾病诱发后的20周，与GVHD小鼠相比，在IL-21R缺陷型小鼠肾脏中未见IgG沉积。因此，在GVHD-SLE模型中，缺乏IL-21R的小鼠不产生自身抗体，在肾脏中也不形成IgG沉积物。因此，用IL-21/IL-21R拮抗剂治疗个体，对SLE和GVHD都可提供有效疗法。
本说明书全文引用的所有参考文献、待审专利申请(包括2004年8月5日申请的60/599,086和2004年12月23日申请的60/639,176)、已公布的专利申请(包括2002年10月4日申请的2003/0108549)和已公布的专利的内容都通过引用结合到本文中。等同实施方案 本领域技术人员将会理解或者只要使用常规实验就能够确定本文所述发明具体实施方案的许多等同实施方案。所附权利要求书中包括所述等同实施方案。
序列表<110>惠氏公司(Wyeth)<120>拮抗白介素-21受体活性<130>01997.043400<150>US 60/599,086<151>2004-08-05<150>US 60/639,176<151>2004-12-23<160>39<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2665<212>DNA<213>人<400>1gtcgactgga ggcccagctg cccgtcatca gagtgacagg tcttatgaca gcctgattgg60tgactcgggc tgggtgtgga ttctcacccc aggcctctgc ctgctttctc agaccctcat120ctgtcacccc cacgctgaac ccagctgcca cccccagaag cccatcagac tgcccccagc180acacggaatg gatttctgag aaagaagccg aaacagaagg cccgtgggag tcagcatgcc240gcgtggctgg gccgccccct tgctcctgct gctgctccag ggaggctggg gctgccccga300cctcgtctgc tacaccgatt acctccagac ggtcatctgc atcctggaaa tgtggaacct360ccaccccagc acgctcaccc ttacctggca agaccagtat gaagagctga aggacgaggc420cacctcctgc agcctccaca ggtcggccca caatgccacg catgccacct acacctgcca480catggatgta ttccacttca tggccgacga cattttcagt gtcaacatca cagaccagtc540tggcaactac tcccaggagt gtggcagctt tctcctggct gagagcatca agccggctcc600ccctttcaac gtgactgtga ccttctcagg acagtataat atctcctggc gctcagatta660cgaagaccct gccttctaca tgctgaaggg caagcttcag tatgagctgc agtacaggaa720
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Thr Phe Ser Gly Gln Tyr Asn Ile Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu Asp130 135 140Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr145 150 155 160Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu Ile165 170 175Ser Val Asp Ser Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg Lys180 185 190Asp Ser Ser Tyr Glu Leu Gln Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly Ser195 200 205Ser Tyr Gln Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln210 215 220Thr Gln Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Pro His Leu Leu Leu225 230 235 240Leu Leu Leu Leu Val Ile Val Phe Ile Pro Ala Phe Trp Ser Leu Lys245 250 255Thr His Pro Leu Trp Arg Leu Trp Lys Lys Ile Trp Ala Val Pro Ser260 265 270Pro Glu Arg Phe Phe Met Pro Leu Tyr Lys Gly Cys Ser Gly Asp Phe275 280 285Lys Lys Trp Val Gly Ala Pro Phe Thr Gly Ser Ser Leu Glu Leu Gly290 295 300Pro Trp Ser Pro Glu Val Pro Ser Thr Leu Glu Val Tyr Ser Cys His305 310 315 320Pro Pro Arg Ser Pro Ala Lys Arg Leu Gln Leu Thr Glu Leu Gln Glu325 330 335Pro Ala Glu Leu Val Glu Ser Asp Gly Val Pro Lys Pro Ser Phe Trp340 345 350Pro Thr Ala Gln Asn Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg Asp355 360 365Arg Pro Tyr Gly Leu Val Ser Ile Asp Thr Val Thr Val Leu Asp Ala370 375 380
Glu Gly Pro Cys Thr Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro385 390 395 400Ala Leu Asp Leu Asp Ala Gly Leu Glu Pro Ser Pro Gly Leu Glu Asp405 410 415Pro Leu Leu Asp Ala Gly Thr Thr Val Leu Ser Cys Gly Cys Val Ser420 425 430Ala Gly Ser Pro Gly Leu Gly Gly Pro Leu Gly Ser Leu Leu Asp Arg435 440 445Leu Lys Pro Pro Leu Ala Asp Gly Glu Asp Trp Ala Gly Gly Leu Pro450 455 460Trp Gly Gly Arg Ser Pro Gly Gly Val Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser465 470 475 480Pro Leu Ala Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Val Gly485 490 495Ser Asp Cys Ser Ser Pro Val Glu Cys Asp Phe Thr Ser Pro Gly Asp500 505 510Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gln Trp Val Val Ile Pro Pro515 520 525Pro Leu Ser Ser Pro Gly Pro Gln Ala Ser530 535<210>3<211>70<212>PRT<213>人<400>3Leu Met Thr Asn Ala Phe Ile Ser Ile Ile Asp Asp Leu Ser Lys Tyr1 5 10 15Asp Val Gln Val Arg Ala Ala Val Ser Ser Met Cys Arg Glu Ala Gly20 25 30Leu Trp Ser Glu Trp Ser Gln Pro Ile Tyr Val Gly Asn Asp Glu His35 40 45Lys Pro Leu Arg Glu Trp Phe Val Ile Val Ile Met Ala Thr Ile Cys50 55 60
Phe Ile Leu Leu Ile Leu65 70<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>4gagtccgagg agaaagctga tctca 25<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>5gaaagatgac cgggtcactc catt 24<210>6<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述标记的杂交寡核苷酸<400>6actcgagcta tgagctgcag gtgcgggca 29<210>7<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述NN14-1b(MU-1)标记的杂交寡核苷酸
<400>7actcgagcta tgagctgcag gtgcgggca 29<210>8<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述红细胞生成素受体家族的基序特征<220>
<221>其他特征<222>(3)..(3)<223>其中Xaa为任何氨基酸。
<400>8Trp Ser Xaa Trp Ser1 5<210>9<211>2628<212>DNA<213>小鼠<400>9gtcgacgcgg cggtaccagc tgtctgccca cttctcctgt ggtgtgcctc acggtcactt60gcttgtctga ccgcaagtct gcccatccct ggggcagcca actggcctca gcccgtgccc120caggcgtgcc ctgtctctgt ctggctgccc cagccctact gtcttcctct gtgtaggctc180tgcccagatg cccggctggt cctcagcctc aggactatct cagcagtgac tcccctgatt240ctggacttgc acctgactga actcctgccc acctcaaacc ttcacctccc accaccacca300ctccgagtcc cgctgtgact cccacgccca ggagaccacc caagtgcccc agcctaaaga360atggctttct gagaaagacc ctgaaggagt aggtctggga cacagcatgc cccggggccc420actggctgcc ttactcctgc tgattctcca tggagcttgg agctgcctgg acctcacttg480ctacactgac tacctctgga ccatcacctg tgtcctggag acacggagcc ccaaccccag540
catactcagt ctcacctggc aagatgaata tgaggaactt caggaccaag agaccttctg600cagcctacac aggtctggcc acaacaccac acatatatgg tacacgtgcc atatgcgctt660gtctcaattc ctgtccgatg aagttttcat tgtcaatgtg acggaccagt ctggcaacaa720ctcccaagag tgtggcagct ttgtcctggc tgagagcatc aaaccagctc cccccttgaa780cgtgactgtg gccttctcag gacgctatga tatctcctgg gactcagctt atgacgaacc840ctccaactac gtgctgaggg gcaagctaca atatgagctg cagtatcgga acctcagaga900cccctatgct gtgaggccgg tgaccaagct gatctcagtg gactcaagaa acgtctctct960tctccctgaa gagttccaca aagattctag ctaccagctg caggtgcggg cagcgcctca1020gccaggcact tcattcaggg ggacctggag tgagtggagt gaccccgtca tctttcagac1080ccaggctggg gagcccgagg caggctggga ccctcacatg ctgctgctcc tggctgtctt1140gatcattgtc ctggttttca tgggtctgaa gatccacctg ccttggaggc tatggaaaaa1200gatatgggca ccagtgccca cccctgagag tttcttccag cccctgtaca gggagcacag1260cgggaacttc aagaaatggg ttaatacccc tttcacggcc tccagcatag agttggtgcc1320acagagttcc acaacaacat cagccttaca tctgtcattg tatccagcca aggagaagaa1380gttcccgggg ctgccgggtc tggaagagca actggagtgt gatggaatgt ctgagcctgg1440tcactggtgc ataatcccct tggcagctgg ccaagcggtc tcagcctaca gtgaggagag1500agaccggcca tatggtctgg tgtccattga cacagtgact gtgggagatg cagagggcct1560gtgtgtctgg ccctgtagct gtgaggatga tggctatcca gccatgaacc tggatgctgg1620ccgagagtct ggccctaatt cagaggatct gctcttggtc acagaccctg cttttctgtc1680ttgcggctgt gtctcaggta gtggtctcag gcttggaggc tccccaggca gcctactgga1740caggttgagg ctgtcatttg caaaggaagg ggactggaca gcagacccaa cctggagaac1800tgggtcccca ggagggggct ctgagagtga agcaggttcc ccccctggtc tggacatgga1860cacatttgac agtggctttg caggttcaga ctgtggcagc cccgtggaga ctgatgaagg1920accccctcga agctatctcc gccagtgggt ggtcaggacc cctccacctg tggacagtgg1980
agcccagagc agctagcata taataaccag ctatagtgag aagaggcctc tgagcctggc2040atttacagtg tgaacatgta ggggtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg2100tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtcttgggt tgtgtgttag cacatccatg ttgggatttg2160gtctgttgct atgtattgta atgctaaatt ctctacccaa agttctaggc ctacgagtga2220attctcatgt ttacaaactt gctgtgtaaa ccttgttcct taatttaata ccattggtta2280aataaaattg gctgcaacca attactggag ggattagagg tagggggctt ttgagttacc2340tgtttggaga tggagaagga gagaggagag accaagagga gaaggaggaa ggagaggaga2400ggagaggaga ggagaggaga ggagaggaga ggagaggaga ggagaggaga ggctgccgtg2460aggggagagg gaccatgagc ctgtggccag gagaaacagc aagtatctgg ggtacactgg2520tgaggaggtg gccaggccag cagttagaag agtagattag gggtgacctc cagtatttgt2580caaagccaat taaaataaca aaaaaaaaaa aaaagcggcc gctctaga 2628<210>10<211>529<212>PRT<213>小鼠<400>10Met Pro Arg Gly Pro Val Ala Ala Leu Leu Leu Leu Ile Leu His Gly1 5 10 15Ala Trp Ser Cys Leu Asp Leu Thr Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Trp Thr20 25 30Ile Thr Cys Val Leu Glu Thr Arg Ser Pro Asn Pro Ser Ile Leu Ser35 40 45Leu Thr Trp Gln Asp Glu Tyr Glu Glu Leu Gln Asp Gln Glu Thr Phe50 55 60Cys Ser Leu His Arg Ser Gly His Asn Thr Thr His Ile Trp Tyr Thr65 70 75 80Cys His Met Arg Leu Ser Gln Phe Leu Ser Asp Glu Val Phe Ile Val85 90 95Asn Val Thr Asp Gln Ser Gly Asn Asn Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe
100 105 110Val Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Leu Asn Val Thr Val115 120 125Ala Phe Ser Gly Arg Tyr Asp Ile Ser Trp Asp Ser Ala Tyr Asp Glu130 135 140Pro Ser Asn Tyr Val Leu Arg Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr145 150 155 160Arg Asn Leu Arg Asp Pro Tyr Ala Val Arg Pro Val Thr Lys Leu Ile165 170 175Ser Val Asp Ser Arg Asn Val Ser Leu Leu Pro Glu Glu Phe His Lys180 185 190Asp Ser Ser Tyr Gln Leu Gln Val Arg Ala Ala Pro Gln Pro Gly Thr195 200 205Ser Phe Arg Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln210 215 220Thr Gln Ala Gly Glu Pro Glu Ala Gly Trp Asp Pro His Met Leu Leu225 230 235 240Leu Leu Ala Val Leu Ile Ile Val Leu Val Phe Met Gly Leu Lys Ile245 250 255His Leu Pro Trp Arg Leu Trp Lys Lys Ile Trp Ala Pro Val Pro Thr260 265 270Pro Glu Ser Phe Phe Gln Pro Leu Tyr Arg Glu His Ser Gly Asn Phe275 280 285Lys Lys Trp Val Asn Thr Pro Phe Thr Ala Ser Ser Ile Glu Leu Val290 295 300Pro Gln Ser Ser Thr Thr Thr Ser Ala Leu His Leu Ser Leu Tyr Pro305 310 315 320Ala Lys Glu Lys Lys Phe Pro Gly Leu Pro Gly Leu Glu Glu Gln Leu325 330 335Glu Cys Asp Gly Met Ser Glu Pro Gly His Trp Cys Ile Ile Pro Leu340 345 350Ala Ala Gly Gln Ala Val Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg Asp Arg Pro355 360 365
Tyr Gly Leu Val Ser Ile Asp Thr Val Thr Val Gly Asp Ala Glu Gly370 375 380Leu Cys Val Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro Ala Met385 390 395 400Asn Leu Asp Ala Gly Arg Glu Ser Gly Pro Asn Ser Glu Asp Leu Leu405 410 415Leu Val Thr Asp Pro Ala Phe Leu Ser Cys Gly Cys Val Ser Gly Ser420 425 430Gly Leu Arg Leu Gly Gly Ser Pro Gly Ser Leu Leu Asp Arg Leu Arg435 440 445Leu Ser Phe Ala Lys Glu Gly Asp Trp Thr Ala Asp Pro Thr Trp Arg450 455 460Thr Gly Ser Pro Gly Gly Gly Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser Pro Pro465 470 475 480Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Ala Gly Ser Asp Cys485 490 495Gly Ser Pro Val Glu Thr Asp Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg500 505 510Gln Trp Val Val Arg Thr Pro Pro Pro Val Asp Ser Gly Ala Gln Ser515 520 525Ser<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>11agcatcaagc cggctccccc20<210>12<211>20
<212>DNA<213>人工引物<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>12ctccattcac tccaggtccc20<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>13ttgaacgtga ctgrggcctt20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述鼠MU-1 cDNA内部寡核苷酸<400>14tgaatgaagt gcctggctga20<210>15<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述5’PCR引物<400>15cacaaagctt cagtatgagc tgcagtacag gaaccgggga 40<210>16<211>40
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述3’PCR引物<400>16cacaggatcc ctttaactcc tctgactggg tctgaaagat 40<210>17<211>224<212>PRT<213>未知生物<220>
<221>未知生物<222>(1)..(224)<223>未知生物的描述包含Fc区的第二多肽<400>17His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Leu Gly Ala Pro Ser1 5 10 15Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg20 25 30Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro35 40 45Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala50 55 60Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val65 70 75 80Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr85 90 95Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro Ile Glu Lys Thr100 105 110Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu115 120 125Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys130 135 140
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser145 150 155 160Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp165 170 175Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser180 185 190Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala195 200 205Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys210 215 220<210>18<211>617<212>DNA<213>人<400>18gctgaagtga aaacgagacc aaggtctagc tctactgttg gtacttatga gatccagtcc60tggcaacatg gagaggattg tcatctgtct gatggtcatc ttcttgggga cactggtcca120caaatcaagc tcccaaggtc aagatcgcca catgattaga atgcgtcaac ttatagatat180tgttgatcag ctgaaaaatt atgtgaatga cttggtccct gaatttctgc cagctccaga240agatgtagag acaaactgtg agtggtcagc tttttcctgc tttcagaagg cccaactaaa300gtcagcaaat acaggaaaca atgaaaggat aatcaatgta tcaattaaaa agctgaagag360gaaaccacct tccacaaatg cagggagaag acagaaacac agactaacat gcccttcatg420tgattcttat gagaaaaaac cacccaaaga attcctagaa agattcaaat cacttctcca480aaagatgatt catcagcatc tgtcctctag aacacacgga agtgaagatt cctgaggatc540taacttgcag ttggacacta tgttacatac tctaatatag tagtgaaagt catttctttg600tattccaagt ggaggag 617<210>19<211>162<212>PRT
<213>人<400>19Met Arg Ser Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met1 5 10 15Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln20 25 30Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln35 40 45Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro50 55 60Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln65 70 75 80Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile85 90 95Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala100 105 110Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr115 120 125Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu130 135 140Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu145 150 155 160Asp Ser<210>20<211>7<212>PRT<213>人<400>20Glu Asp Asp Gly Tyr Pro Ala1 5
<210>21<211>16<212>PRT<213>人<400>21Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Ser Pro Leu His Pro1 5 10 15<210>22<211>786<212>DNA<213>人<400>22atgaaattct tagtcaacgt tgcccttgtt tttatggtcg tgtacatttc ttacatctat60gccggcagcg gacaccacca tcatcaccac ggtagcggcg actataaaga cgatgacgat120aagggttccg gatgccccga cctcgtctgc tacaccgatt acctccagac ggtcatctgc180atcctggaaa tgtggaacct ccaccccagc acgctcaccc ttacctggca agaccagtat240gaagagctga aggacgaggc cacctcctgc agcctccaca ggtcggccca caatgccacg300catgccacct acacctgcca catggatgta ttccacttca tggccgacga cattttcagt360gtcaacatca cagaccagtc tggcaactac tcccaggagt gtggcagctt tctcctggct420gagagcatca agccggctcc ccctttcaac gtgactgtga ccttctcagg acagtataat480atctcctggc gctcagatta cgaagaccct gccttctaca tgctgaaggg caagcttcag540tatgagctgc agtacaggaa ccggggagac ccctgggctg tgagtccgag gagaaagctg600atctcagtgg actcaagaag tgtctccctc ctccccctgg agttccgcaa agactcgagc660tatgagctgc aggtgcgggc agggcccatg cctggctcct cctaccaggg gacctggagt720gaatggagtg acccggtcat ctttcagacc cagtcagagg agttaaagga aggctggaac780taatga 786<210>23<211>260<212>PRT
<213>人<400>23Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile15 10 15Ser Tyr Ile Tyr Ala Gly Ser Gly His His His His His His Gly Ser20 25 30Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Gly Cys Pro Asp Leu35 40 45Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln Thr Val Ile Cys Ile Leu Glu Met50 55 60Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu Thr Leu Thr Trp Gln Asp Gln Tyr65 70 75 80Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr Ser Cys Ser Leu His Arg Ser Ala85 90 95His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr Thr Cys His Met Asp Val Phe His100 105 110Phe Met Ala Asp Asp Ile Phe Ser Val Asn Ile Thr Asp Gln Ser Gly115 120 125Asn Tyr Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe Leu Leu Ala Glu Ser Ile Lys130 135 140Pro Ala Pro Pro Phe Asn Val Thr Val Thr Phe Ser Gly Gln Tyr Asn145 150 155 160Ile Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu Asp Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys165 170 175Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp180 185 190Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu Ile Ser Val Asp Ser Arg Ser Val195 200 205Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg Lys Asp Ser Ser Tyr Glu Leu Gln210 215 220Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly Ser Ser Tyr Gln Gly Thr Trp Ser225 230 235 240
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1.一种治疗、改善或预防哺乳动物患者的自身免疫性疾病或炎性疾病的方法，所述方法包括给予所述患者选自以下的IL-21/IL-21R拮抗剂抗IL-21R抗体、抗IL-21抗体、抗IL-21R抗体的抗原结合片段、抗IL-21抗体的抗原结合片段和IL-21R可溶性片段，其用量足以治疗、改善或预防所述疾病。
2.一种治疗、改善或预防哺乳动物患者的疾病的方法，所述疾病选自关节炎、特应性疾病、呼吸性疾病、皮肤炎性疾病、肠道炎性疾病、纤维变性病、系统性红斑狼疮、移植排斥和移植排斥相关疾病；所述方法包括给予所述患者选自以下的IL-21/IL-21R拮抗剂抗IL-21R抗体、抗IL-21抗体、抗IL-21R抗体的抗原结合片段、抗IL-21抗体的抗原结合片段和IL-21R可溶性片段，其用量足以治疗、改善或预防所述疾病。
3.权利要求2的方法，其中所述抗IL-21R抗体能够结合IL-21R，并且由与SEQ ID NO2所示序列至少具有90％同一性的氨基酸序列组成，而且其中所述IL-21R能够结合IL-21。
4.权利要求3的方法，其中所述关节炎选自类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病性关节炎和关节强硬性脊椎炎。
5.权利要求4的方法，其中所述关节炎是类风湿性关节炎。
6.权利要求3的方法，其中所述呼吸性疾病是哮喘或慢性阻塞性肺病。
7.权利要求3的方法，其中所述纤维变性病选自内脏纤维化、皮肤纤维变性病、眼纤维变性病、系统性硬化、多肌炎、皮肌炎、嗜酸性粒细胞性筋膜炎、雷诺综合征、肾小球肾炎和鼻息肉病。
8.权利要求3的方法，其中所述肠道炎性疾病选自炎性肠病、溃疡性结肠炎和节段性回肠炎。
9.权利要求3的方法，其中所述皮肤炎性疾病是银屑病。
10.权利要求3的方法，其中所述特应性疾病选自变应性哮喘、特应性皮炎、荨麻疹、湿疹、变应性鼻炎和变应性肠胃炎。
11.权利要求10的方法，其中所述特应性疾病是变应性哮喘。
12.权利要求3的方法，其中所述移植排斥相关疾病是移植物抗宿主病。
13.权利要求3的方法，其中所述疾病是移植排斥。
14.权利要求3的方法，其中所述疾病是系统性红斑狼疮。
15.权利要求2的方法，其中所述哺乳动物患者为人。
16.权利要求2的方法，其中所述IL-21R可溶性片段由IL-21R胞外域和Fc免疫球蛋白片段组成。
17.权利要求16的方法，其中所述IL-21R胞外域包含SEQ ID NO2的约氨基酸1-235。
18.权利要求2的方法，其中所述IL-21R可溶性片段由与SEQ IDNO29所示序列至少具有90％同一性的氨基酸序列组成。
19.权利要求2的方法，其中所述IL-21/IL-21R拮抗剂是抗IL-21R抗体或其抗原结合片段。
20.权利要求2的方法，其中所述IL-21/IL-21R拮抗剂是抗IL-21抗体或其抗原结合片段。
21.一种融合蛋白，它由IL-21R胞外域和Fc免疫球蛋白片段组成，其中所述IL-21R的氨基酸序列与SEQ ID NO2所示序列具有至少90％同一性，而且其中所述融合蛋白能够结合IL-21。
22.权利要求21的融合蛋白，它由与SEQ ID NO29所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列组成。
23.一种载体，它具有编码权利要求21的融合蛋白的核苷酸序列。
24.一种重组宿主细胞，它包含权利要求23的载体。
25.一种制备融合蛋白的方法，所述方法包括(a)在能表达所述融合蛋白的条件下，培养权利要求24的重组宿主细胞；和(b)回收所述融合蛋白。
26.一种药物组合物，它包含IL-21/IL-21R拮抗剂和药学上可接受的载体。
27.权利要求26的药物组合物，其中所述IL-21/IL-21R拮抗剂选自抗IL-21R抗体、抗IL-21抗体、抗IL-21R抗体的抗原结合片段、抗IL-21抗体的抗原结合片段和IL-21R可溶性片段。
28.权利要求27的药物组合物，其中所述IL-21R可溶性片段由IL-21R胞外域和Fc免疫球蛋白片段组成。
29.一种将器官、组织、细胞或细胞群移植给哺乳动物患者的方法，所述方法包括如下步骤(a)给予所述患者选自以下的IL-21/IL-21R拮抗剂抗IL-21R抗体、抗IL-21抗体、抗IL-21R抗体的抗原结合片段、抗IL-21抗体的抗原结合片段和IL-21R可溶性片段，其用量足以降低移植排斥的危险；和(b)将器官、组织、细胞或细胞群移植给所述患者，其中所述移植步骤(b)在给药步骤(a)之前、期间或之后进行。
30.权利要求29的方法，其中所述移植的器官、组织、细胞或细胞群选自心脏、肾脏、肝脏、肺、胰腺、骨髓、软骨、角膜、神经元组织及其细胞。
31.一种治疗、预防或改善哺乳动物移植受体的移植排斥的方法，所述方法包括(a)检测移植受体的移植排斥症状；和(b)给予所述移植受体选自以下的IL-21/IL-21R拮抗剂抗IL-21R抗体、抗IL-21抗体、抗IL-21R抗体的抗原结合片段、抗IL-21抗体的抗原结合片段和IL-21R可溶性片段。
32.权利要求31的方法，其中所述移植排斥症状选自炎症、器官功能减退、活检中的排斥体征和纤维化。
全文摘要
公开了使用白介素－21(IL－21)或IL－21受体(“IL－21R”或“MU－1”)拮抗剂来抑制IL－21/IL－21受体(MU－1)活性的方法和组合物。IL－21/IL－21R拮抗剂可用于在体内诱导免疫抑制，例如用于治疗、改善或预防自身免疫性疾病或炎性疾病，包括例如炎性肠病(IBD)、类风湿性关节炎(RA)、移植排斥、银屑病、哮喘、纤维化和系统性红斑狼疮(SLE)。
文档编号A61K38/17GK101052419SQ200580033595
公开日2007年10月10日 申请日期2005年8月5日 优先权日2004年8月5日
发明者D·A·杨, M·科林斯, K·杜努西－约安诺普洛斯, R·M·小奥哈拉, M·T·卡塞安, M·J·怀特斯 申请人:惠氏公司