一种适用于兔精子体外获能方法及培养液配方的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种适用于兔精子体外获能方法及培养液配方。本发明在BO获能液中添加10μmol/L?EGCG，用于精子体外获能处理，且在BO获能液中添加10μmol/L?EGCG，BO获能液配方为：NaCl?6.5453mg/mL，KCl?0.2997mg/mL，NaH2PO4·H2O?0.1145mg/mL，MgCl2·6H2O?0.1057mg/mL，CaCl2·2H2O?0.330mg/mL，葡萄糖2.518mg/mL，0.2％酚红4％，100IU/mL青霉素，100IU/mL链霉素，NaHCO33.1080mg/mL，丙酮酸钠0.1380mg/mL，肝素20μg/mL，BSA20mg/mL。本发明克服了现有的精子体外获能过程中，由于精子密度较大，精子自身代谢产生的氧自由基积累较多的缺陷。本发明利用成年新西兰白兔公免，对其采精后，在BO获能液中添加不同浓度EGCG(0μM、10μM、15μM、20μM、25μM)，研究其对兔精子获能效果的影响，得出最佳EGCG添加浓度，建立一种高效的兔体外获能培养体系。
【专利说明】一种适用于兔精子体外获能方法及培养液配方
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物学领域，特别涉及一种适用于兔精子体外获能方法及培养液配 方。
【背景技术】
[0002] 体外受精技术是体外胚胎生产的重要环节，通过体外受精，能够生产大量优质廉 价的胚胎，以满足胚胎商业化的需求。精子体外获能是体外受精技术必不可少的环节，精子 获能时，精子内部发生着一系列的生理生化反应，包括精子表面精浆蛋白类物质的去除、离 子在胞膜内外之间的运动（Ca 2+、Mg2+、Cr和HCCV内流而K+、Na+外流）、精子获能调控系统 的开放、精子膜电位的超极化等。精子获能的分子机理主要有去能因子的失活、蛋白质酪氨 酸的磷酸化、胆固醇的流失、活性氧的产生等。
[0003] 表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG)是儿茶素中一种主要的酯型儿茶素，其分子 量为：458. 38,分子式：C22H18(VEGCG具有较强的抗氧化作用，能有效地清除氧自由基，能保 护细胞及其DNA免受损伤，EGCG的这些特点，使得其在抗氧化、防治糖尿病、抗癌变和神经 元保护功能等方面具有很强的功效。在精子体外获能过程中，精子会产生多种有害物质，如 细胞脂肪代谢产生的活性氧、氧自由基，过量的活性氧和氧自由基将会大大降低精子体外 荻能效果，进而影响体外受精效果。而EGCG具有很强的抗氧化作用，因此在体外胚胎生产 培养体系中，添加一定浓度EGCG能有效地提高精子获能效果。
[0004] 目前已建立了许多精子获能效果的评价方法，其中考马斯亮蓝染色法是一种常用 的方法。考马斯亮蓝是一类蛋白质染色剂，未获能的精子顶体外膜中含有大量的糖蛋白，经 染色后，精子头部顶端呈深蓝色，而获能后精子的顶体膜破裂，其中的糖蛋白被释放出来， 因此，经过染色后，顶体区不着色。染色后在普通光学显微镜下可以观察到两种类型的精 子：所有精子尾部均染成紫蓝色，头部则呈A型和B型。A型为没有发生顶体反应的精子， 顶体区染成紫蓝色而顶体后区不染色或呈浅紫色，少量精子顶体后区也呈紫蓝色；B型为 已发生顶体反应的精子，顶体区不染色或染浅紫色，其余部位染色与A型相似。考马斯亮蓝 检查结果的稳定性和重复性好、各批次间的差异不大，可以在普通实验室中进行，能有效地 评价精子获能效果。
[0005] 在本发明之前，兔精液体外获能的研究较为成熟，但是在精子体外获能过程中，由 于精子密度较大，精子自身代谢产生的氧自由基积累较多，因此有必要发明一种抗氧化型 精子体外获能液用于提商精子获能效率，为后期胚胎生广奠定一定基础。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的就在于克服上述缺陷，研制建立一种适用于兔精子体外获能方法及 培养液配方。
[0007] 本发明的技术方案是：
[0008] -种适用于兔精子体外获能方法，其主要技术特征是在B0获能液中添加 ΙΟμπιοΙ/L EGCG，用于精子体外获能处理。
[0009] 本发明的另一技术方案是：
[0010] 一种用于兔精子体外获能的获能液，其主要技术特征在于，是在B0获能液中添加 10 μ mol/L EGCG，B0 获能液配方为：NaCl 6. 5453mg/mL，KC1 0· 2997mg/mL，NaH2P04 · H20 0. 1145mg/mL, MgCl2 · 6H20 0. 1057mg/mL, CaCl2 · 2H20 0. 330mg/mL,葡萄糖 2. 518mg/ mL，0. 2% 酚红 4%，100IU/mL 青霉素，lOOIU/mL 链霉素，NaHC033. 1080mg/mL，丙酮酸钠 0· 1380mg/mL，肝素 20μ g/mL，BSA20mg/mL。
[0011] 本发明的效果和优点在于利用成年新西兰白兔公兔，对其采精后，在BO获能液中 添加不同浓度EGCG(0 μ M、10 μ M、15 μ Μ、20 μ Μ、25 μ M)，研究其对兔精子获能效果的影响， 得出最佳EGCG添加浓度，建立一种高效的兔体外获能培养体系。同时可由表1可知，获能液 中添加不同浓度EGCG对活精子百分数具有显著的影响（Ρ < 0.05)，其中0、5和10 μ mol/ L EGCG对活精子百分率的影响差异不显著（P > 0. 05)，但显著的高于其他三组。由图1可 知，在添加0 μ mol/L到10 μ mol/L的EGCG之间，活精子百分率的变化趋势基本不变，但到 10 μ mol/L之后，活精子百分率开始逐渐下降。说明添加0、5和10 μ mol/L EGCG对精子的 活力没有显著影响。
[0012] 在B0获能液中添加不同浓度EGCG对精子顶体反应发生率具有显著影响（P <0.05)，其中获能液添加10 μ Μ浓度的顶体反应发生率显著高于其他各组（P< 0.05)(见 表2)，图2可以看出，在添加0到10 μ Μ浓度区间，精子顶体反应发生率逐渐增加，在添加 10到20 μ Μ浓度区间，精子顶体反应发生率逐渐降低。
[0013] 在精子体外获能过程中，EGCG最佳添加浓度为10 μ Μ。
[0014] 精子获能6h后，活精子的百分数见表1和图1。
[0015] 表1不同浓度EGCG对活精子百分率的影响
[0016]
【权利要求】
1. 一种适用于兔精子体外获能方法，是在BO获能液中添加10 μ mol/L EGCG，用于精子 体外获能处理。
2. -种用于权利1所述方法的获能培养液，其特征在于，是在B0获能液中添加 10 μ mol/L EGCG，B0 获能液配方为：NaCl 6. 5453mg/mL，KC1 0· 2997mg/mL，NaH2P04 · H20 0. 1145mg/mL, MgCl2 · 6H20 0. 1057mg/mL, CaCl2 · 2H20 0. 330mg/mL,葡萄糖 2. 518mg/ mL，0. 2% 酚红 4%，100IU/mL 青霉素，lOOIU/mL 链霉素，NaHC033. 1080mg/mL，丙酮酸钠 0· 1380mg/mL，肝素 20μ g/mL，BSA20mg/mL。
【文档编号】C12N5/076GK104059878SQ201410287368
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年6月23日 优先权日:2014年6月23日
【发明者】李拥军, 张光景, 张佳慧, 杨波, 蔡缪荧 申请人:扬州大学