一种适用于幼龄兔卵母细胞体外受精方法及培养液配方的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种适用于幼龄兔卵母细胞体外受精方法及培养液配方。本发明在BO受精液中添加10μM EGCG，用于幼龄兔卵母细胞体外受精，在BO受精液中添加10μM EGCG，BO受精液为：NaCl 6.5453mg/mL，KCl 0.2997mg/mL，NaH2PO4·H2O 0.1145mg/mL，MgCl2·6H2O 0.1057mg/mL，CaCl2·2H2O 0.330mg/mL，葡萄糖2.518mg/mL，0.2％酚红4％，100IU/mL青霉素，100IU/mL链霉素，NaHCO33.1080mg/mL，丙酮酸钠0.1380mg/mL，肝素20μg/mL，BSA 20mg/mL。克服了现有幼龄家畜体外培养体系的缺陷。本发明在BO受精液中，不同浓度EGCG对幼龄兔卵母细胞体外受精具有显著性的影响(P＜0.05)，受精液中EGCG添加浓度为5μM、10μM、15μM时，受精率显著高于0和20μM(分别为43.26±5.92和46.34±3.57)，而添加5μM、10μM、15μM时，幼龄兔卵母细胞受精率差异不显著，添加10μM时，高于5μM和15μM。
【专利说明】一种适用于幼龄兔卵母细胞体外受精方法及培养液配方
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物学领域，特别涉及一种适用于幼龄兔卵母细胞体外受精方法及培 养液配方。
【背景技术】
[0002] 幼畜体外胚胎生产和移植技术（Juvenile In Vitro Embryo Transfer，JIVET) 包括幼畜超数排卵、卵母细胞体外成熟（In Vitro Maturation，IVM)、体外受精（In Vitro Fertil ization，IVF)、胚胎体外培养（In Vitro Culture, IVC)及胚胎移植等技术。该技 术是通过外源性促性腺激素，诱导幼畜卵巢上卵泡的超数发育，而后通过取卵、卵母细胞体 外成熟、体外受精及受精卵体外培养等技术生产出优质胚胎，并移植母体内从而获得优质 后代。体外受精技术是JIVET技术的一个重要环节，通过提高体外受精培养效果，能显著提 高后期胚胎的生长及发育质量，有效地提高JIVET技术的生产效率。
[0003] 表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG)是儿茶素中一种主要的酯型儿茶素，其分子 量为：458. 38,分子式：C22H18(VEGCG具有较强的抗氧化作用，能有效地清除氧自由基，能保 护细胞及其DNA免受损伤，EGCG的这些特点，使得其在抗氧化、防治糖尿病、抗癌变和神经 元保护功能等方面具有很强的功效。在体外受精过程中，精子在体外获能及受精过程中会 产生多种有害物质，如细胞脂肪代谢产生的活性氧、氧自由基，过量的活性氧和氧自由基将 会大大降低体外胚胎生产效率。而EGCG具有很强的抗氧化作用，因此在体外胚胎生产培养 体系中，添加一定浓度EGCG能有效地提高卵母细胞成熟率、受精率及胚胎发育。
[0004] 在本发明之前，目前幼龄家畜的体外培养体系多参照成年家畜的体外培养体系， 但由于幼龄家畜卵母细胞结构及生长发育模式与成年家畜有所不同，因而需要建立一种适 用于幼龄家畜特有的培养体系及方法，才能有效地提高幼龄家畜胚胎体外生产效率。成年 兔体外受精培养过程中，常采用B0受精液。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的就是要克服上述缺陷，研制一种适用于幼龄兔卵母细胞体外受精方 法及培养液配方。
[0006] 本发明的技术方案是：
[0007] 本发明所述的一种适用于幼龄兔卵母细胞体外受精方法，其主要技术特征在于在 B0受精液中添加10 μ M EGCG，用于幼龄兔卵母细胞体外受精。
[0008] 本发明的另一技术方案是：
[0009] -种用于幼龄兔卵母细胞体外受精的受精培养液，其主要技术特征在于， 在 Β0 受精液中添加 10 μ M EGCG，Β0 受精液为：NaC16. 5453mg/mL，KC10. 2997mg/mL， NaH2P04 · Η200· 1145mg/mL，MgCl2 · 6Η200· 1057mg/mL，CaCl2 · 2Η200· 330mg/mL，葡萄糖 2. 518mg/mL，0. 2%酚红 4%，lOOIU/mL 青霉素，lOOIU/mL 链霉素，NaHC033. 1080mg/mL，丙酮 酸纳 0· 1380mg/mL，肝素 20 μ g/mL，BSA20mg/mL。
[0010] 本发明利用幼龄兔卵母细胞进行体外成熟，将成熟卵母细胞移入含不同浓度EGCG 受精液（0、5、10、15、20μΜ)中，将精子获能后，加入受精液中，研究不同浓度EGCG对幼龄兔 卵母细胞体外受精的影响，选出最优添加浓度，建立一种高效的幼龄兔卵母细胞体外受精 培养体系，优化JIVET的相关技术。
[0011] 本发明的优点和效果在于：
[0012] 在Β0受精液中，不同浓度的EGCG对幼龄兔卵母细胞体外受精具有显著性的影响 (P<0.05)，受精液中EGCG添加浓度为5μM、10μM、15μM时（受精率分别为56.05±5.22、 62. 41 ±3. 09和58. 99±2. 21)，其受精率显著高于0和20 μ Μ(受精率分别为43. 26±5. 92 和46. 34±3. 57)，而添加5 μ Μ、10 μ Μ、15 μ Μ时，幼龄兔卵母细胞受精率差异不显著（Ρ > 0.05)，但可以看出，添加10 μ Μ时，其受精率高于5 μ Μ和15 μ Μ(见表1)。
[0013] 在幼龄兔体外受精过程中，结合本实验室前期对精子获能效果的研究，得出EGCG 最佳添加浓度为10 μ Μ。（注：前期研究已证明添加10 μ Μ浓度EGCG能有效地提高精子获 能效果）
[0014] 表1不同浓度EGCG对幼龄兔卵母细胞体外受精的影响
[0015]
【权利要求】
1. 一种适用于幼龄兔卵母细胞体外受精方法，其特征在于在BO受精液中添加10 μ Μ EGCG，用于幼龄兔卵母细胞体外受精。
2. -种用于权利要求1所述方法的受精培养液，其特征在于，在B0受精液中添加 10 μ M EGCG，B0 受精液为：NaC16. 5453mg/mL，KC10. 2997mg/mL，NaH2P04 · Η200· 1145mg/mL， MgCl2 · 6Η200· 1057mg/mL，CaCl2 · 2Η200· 330mg/mL，葡萄糖 2. 518mg/mL，0. 2 % 酚红 4 %， lOOIU/mL 青霉素，lOOIU/mL 链霉素，NaHC033. 1080mg/mL，丙酮酸钠 0· 1380mg/mL，肝素 20 μ g/mL, BSA20mg/mL。
【文档编号】C12N5/075GK104232569SQ201410287367
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年6月23日 优先权日:2014年6月23日
【发明者】李拥军, 张光景, 张佳慧, 杨波, 蔡缪荧 申请人:扬州大学