乳腺癌干细胞制备方法及其抗原组合物与抗肿瘤应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种制备乳腺癌干细胞的方法，其中，所述方法包括鉴定待测乳腺癌细胞标本中是否存在乳腺癌干细胞的步骤：所述步骤包括检测所述待测乳腺癌细胞标本中是否特异表达以下差异蛋白的至少两种：ATP结合框亚家族G成分2、五次跨膜单链糖蛋白PROM1、乙醛脱氢酶-1和磷酸酶与张力蛋白同源物。本发明还提供了制备所述乳腺癌干细胞抗原组合物及其抗肿瘤应用，该抗原组合物负载树突状细胞获得树突状细胞疫苗、制备所述树突状细胞疫苗的试剂盒、以及所述树突状细胞疫苗的抗肿瘤应用。
【专利说明】乳腺癌干细胞制备方法及其抗原组合物与抗肿瘤应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及制备肿瘤干细胞及其抗原组合物与抗肿瘤应用，所述抗原组合物负载 树突状细胞制备获得树突状细胞疫苗、制备所述树突状细胞疫苗的试剂盒、以及所述树突 状细胞疫苗的抗肿瘤应用。特别地，本发明涉及制备乳腺癌干细胞及其抗原组合物与抗肿 瘤应用、所述抗原组合物负载树突状细胞制备获得树突状细胞疫苗、制备所述树突状细胞 疫苗的试剂盒、以及所述树突状细胞疫苗的抗肿瘤应用。
【背景技术】
[0002] 目前，现有技术已经在乳腺癌瘤中鉴定并分离到了具有干细胞/祖细胞特性的致 瘤乳腺癌细胞。例如，"Isolation and In vitro Propagation of Tumorigenic Breast Cancer Cells with Stem/Progenitor Cell Properties (具有干细胞/祖细胞特性的致瘤 乳腺癌细胞的分离和体外繁殖）"，Dario Ponti等人，Cancer Research (癌症研究），第65 卷第13期，第5506-5511页，2005年7月1日中公开了，其发现⑶44+且⑶24〃ffi的细胞，专 门保持致癌的活性并且显示出了干细胞样特性。即现有技术可以通过检测癌瘤处分离的疑 似乳腺癌干细胞的细胞的CD44和CD24,来鉴定乳腺癌干细胞。
[0003] 但是在正常干细胞中也有同样的⑶44和⑶24的性质，因此现有技术的方法无法 将癌瘤处分离的乳腺癌干细胞和正常干细胞高效准确的区分开，因而无法迅速有效地富集 并体外繁殖乳腺癌干细胞。例如，在乳腺癌干细胞中特异性表达的CD133蛋白，在乳腺癌细 胞中没有表达，但是在正常的造血干细胞中也有表达。
[0004] 综上所述如何高效准确地得到乳腺癌干细胞，并且能否利用所得的乳腺癌干细胞 来制备对抗供体中乳腺癌的疫苗，仍然是亟待解决的问题。
【发明内容】
[0005] 本发明通过研究发现了一种制备乳腺癌干细胞的方法，该方法可以在短时间内高 效准确得到纯度高且富集容易的乳腺癌干细胞，解决现有技术很难在短时间内高效准确得 到纯度高且富集容易的乳腺癌干细胞的问题。
[0006] 本发明的第二个目的是提供一种乳腺癌干细胞抗原组合物及其抗肿瘤应用。
[0007] 本发明的第三个目的是提供使用本发明的乳腺癌干细胞抗原组合物负载树突状 细胞制备获得树突状细胞疫苗及其制备该树突状细胞疫苗的试剂盒。
[0008] 本发明的第四个目的是提供通过本发明所述方法获得的树突细胞疫苗在临床上 抗肿瘤的应用。
[0009] 本发明提供了一种制备乳腺癌干细胞的方法，其中，所述方法包括鉴定待测乳腺 癌细胞标本中是否存在乳腺癌干细胞的步骤：
[0010] 所述步骤包括检测所述待测乳腺癌细胞标本中是否特异表达以下差异蛋白的至 少两种：ATP结合框亚家族G成分2、五次跨膜单链糖蛋白PR0M1、乙醛脱氢酶-1和磷酸酶 与张力蛋白同源物。 toon] 本发明还提供了一种制备乳腺癌干细胞的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：
[0012] 1)乳腺癌干细胞基础培养基；
[0013] 2) ATP结合框亚家族G成分2、五次跨膜单链糖蛋白PR0M1、乙醛脱氢酶-1和磷酸 酶与张力蛋白同源物的至少两种；
[0014] 3)消化细胞的酶；
[0015] 4)细胞因子以及；
[0016] 5)使用说明书；
[0017] 其中，所述使用说明书包括本发明所述制备乳腺癌干细胞的方法。
[0018] 本发明还提供了一种上述乳腺癌干细胞抗原组合物的制备方法，其中，该方法包 括以下步骤：
[0019] 1)按照本发明所述的方法制备乳腺癌干细胞，
[0020] 2)用生理盐水洗涤并重悬所述乳腺癌干细胞，
[0021] 3)裂解所述乳腺癌干细胞。
[0022] 本发明还提供了一种乳腺癌干细胞抗原负载的树突状细胞的制备方法，其中，该 方法包括：通过裂解乳腺癌干细胞得到乳腺癌干细胞抗原组合物，将正常树突状细胞与乳 腺癌干细胞抗原组合物接触得到负载肿瘤抗原的抗乳腺癌树突状细胞，其中，所述方法包 括使用本发明所述的方法制备乳腺癌干细胞，或者使用本发明的方法制备乳腺癌干细胞抗 原组合物。
[0023] 本发明还提供了一种由上述的方法得到的乳腺癌干细胞抗原负载的树突状细胞 疫苗，所述树突状细胞疫苗包括树突状细胞，其中，所述树突状细胞为本发明所述的乳腺癌 干细胞抗原负载的树突状细胞。
[0024] 本发明还提供了一种制备乳腺癌干细胞抗原负载的树突状细胞的试剂盒，其中， 所述试剂盒包括：
[0025] 1)乳腺癌干细胞基础培养基；
[0026] 2) ATP结合框亚家族G成分2、五次跨膜单链糖蛋白PR0M1、乙醛脱氢酶-1和磷酸 酶与张力蛋白同源物的至少两种；
[0027] 3)消化细胞的酶；
[0028] 4) B27或N2、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素；
[0029] 5)树突状细胞基础培养基；
[0030] 6)巨粒细胞-噬细胞集落刺激因子；
[0031] 7)白介素-4、干扰素 α和肿瘤坏死因子α ;以及
[0032] 6)使用说明书；
[0033] 其中，所述使用说明书包括本发明所述制备乳腺癌干细胞抗原负载的树突状细胞 的方法。
[0034] 通过本发明的方法，仅仅通过检测ΑΤΡ结合框亚家族G成分2、五次跨膜单链糖蛋 白PR0M1、乙醛脱氢酶-1和磷酸酶与张力蛋白同源物的至少两种，就能够高效准确地得到 乳腺癌干细胞，基于所述方法所得乳腺癌干细胞纯度高且富集容易。由本发明提供的方法 得到的乳腺癌干细胞以及由该乳腺癌干细胞得到的抗原组合物、负载该抗原的树突状细胞 制备的药物，能够在体内和体外引发免疫应答来杀死引起乳腺癌复发的乳腺癌干细胞，从 而为克服乳腺癌耐受性、根治乳腺癌的复发和转移提供了可能。
【专利附图】
【附图说明】
[0035] 图1表示为获得的乳腺癌瘤干细胞成球生长图和流式细胞仪检测结果图；
[0036] 图2表示为由实施例6所得ABCG2和PR0M1双阳性，ABCG2、PR0M1和ALDH1三阳 性，ABCG2、PR0M1、ALDH1和PTEN四阳性的乳腺癌干细胞抗原组合物负载树突状细胞得到的 细胞毒性T淋巴细胞（CTL)，分别对实施例3获得的乳腺癌干细胞的应答结果图；
[0037] 图3表示由制备例1、3和对比例4所得三种抗原组合物分别负载树突状细胞，以 及实施例6所得ABCG2和PR0M1双阳性乳腺癌干细胞抗原组合物负载树突状细胞得到的细 胞毒性T淋巴细胞（CTL)，分别对ABCG2和PR0M1双阳性乳腺癌干细胞产生的应答结果对比 图。
[0038] 图4显示由制备例1、3和对比例4所得三种抗原组合物分别负载树突状细胞以及 实施例6所得ABCG2和PR0M1双阳性乳腺癌干细胞抗原组合物负载树突状细胞得到的细胞 毒性T淋巴细胞（CTL)，分别对对比例4获得的乳腺癌干细胞产生的应答结果对比图。
【具体实施方式】
[0039] 本发明提供了一种制备乳腺癌干细胞的方法，其中，所述方法包括鉴定待测乳腺 癌细胞标本中是否存在乳腺癌干细胞的步骤：
[0040] 所述步骤包括检测所述待测乳腺癌细胞标本中是否特异表达以下差异蛋 白的至少两种：ATP结合框亚家族G成分2 (ATP-binding cassette superfamily G member2, ABCG2)、五次跨膜单链糖蛋白（Promininl，PR0M1)、乙醒脱氢酶-1 (Aldehyde dehydrogenase_l，ALDHl)、憐酸酶与张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog， PTEN)。其中，Prominin-1是5跨膜蛋白家族的首个成员，含865个氨基酸，有胞外N端，胞 内C端，两个大的胞外环含8个糖基化的位点。
[0041] 优选地，所述特异表达差异蛋白是指使用双色双融合探针间期荧光原位杂交技术 检测所述乳腺癌细胞标本中的所述四种差异蛋白至少两种的结果为阳性；
[0042] 其中，以已知纯乳腺癌细胞为阴性对照，用双色双融合探针间期荧光原位杂交技 术检测100份所述阴性对照，每份含1〇 3个细胞，测得每种差异蛋白假阳性信号细胞个数占 每份细胞总数的百分率为所测该种差异蛋白的假阳性率，将所测该种差异蛋白假阳性率的 平均值与标准方差之和定义为分界值；
[0043] 取100份待测乳腺癌细胞标本，每份标本含103个细胞，测得与阴性对照所测同种 差异蛋白阳性信号细胞个数占每份细胞总数的百分率为所测差异蛋白的阳性率的平均值， 该阳性率平均值大于等于所述分界值，即该待测乳腺癌细胞标本的该种差异蛋白的双色双 融合探针间期荧光原位杂交技术检测结果为阳性。
[0044] 进一步优选地，所述特异表达差异蛋白是指使用双色双融合探针间期荧光原位杂 交技术检测所述乳腺癌细胞标本中的所述四种差异蛋白的结果均为阳性。
[0045] 优选地，当鉴定所述待测乳腺癌细胞标本中存在乳腺癌干细胞时，该方法还包 括：
[0046] 所述获得的乳腺癌瘤干细胞成球生长，经流式细胞仪检测⑶44+且⑶24V1?的乳 腺癌瘤干细胞占总细胞数的30%以上；
[0047] 使用免疫磁珠法和/或流式细胞仪分选法富集所述待测细胞中的乳腺癌干细胞 的步骤；
[0048] 其中，利用针对得到特异表达的ATP结合框亚家族G成分2、五次跨膜单链糖蛋白 PR0M1、乙醛脱氢酶-1和磷酸酶与张力蛋白同源物的至少两种的抗体。
[0049] 所述方法还可以包括从离体乳腺癌肿瘤组织和/或乳腺癌细胞系中分离乳腺癌 干细胞。手术从患者体内取出的乳腺癌肿瘤组织，属于废弃的离体乳腺癌肿瘤组织。本发 明可以适用常规的方法得到乳腺癌细胞。此外，由现有商业上能够买到的细胞系培养物也 能从中分离出相应的乳腺癌干细胞。例如，MCF-7人乳腺腺癌细胞就是可以从美国典型物 保藏中心（ATCC)买到、并且能够从中分离出相应的乳腺癌干细胞的细胞株系。
[0050] 本发明还提供了一种制备乳腺癌干细胞的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：
[0051] 1)乳腺癌干细胞基础培养基；
[0052] 2) ATP结合框亚家族G成分2、五次跨膜单链糖蛋白PR0M1、乙醛脱氢酶-1和磷酸 酶与张力蛋白同源物的至少两种；优选包括所述四种蛋白。
[0053] 3)消化细胞的酶；
[0054] 4)细胞因子以及；
[0055] 5)使用说明书；
[0056] 其中，所述使用说明书包括本发明所述制备乳腺癌干细胞的方法。
[0057] 优选地，所述试剂盒还包括针对所述ATP结合框亚家族G成分2、五次跨膜单链糖 蛋白PR0M1、乙醛脱氢酶-1和磷酸酶与张力蛋白同源物的至少两种的抗体；所述使用说明 书包括本发明所述的制备乳腺癌干细胞的方法。
[0058] 其中，所述乳腺癌干细胞基础培养基可以是NS-basal、DMEM/F12(1 : 1)等。所 述乳腺癌干细胞培养体系包括乳腺癌干细胞和5mL-50mL的乳腺癌干细胞基础培养基，在 37°C、5% C02培养箱中培养。
[0059] 所述消化细胞的酶优选为胰酶和/或阿欧替斯酶（Accutase)。其中，在乳腺 癌干细胞基础培养基达5mL-50mL的时，所述胰酶和/或Accutase优选作为肿瘤组织分 离乳腺癌干细胞所使用试剂，可以使用本领域常规的用量，例如一般用量为1倍浓度的 0. 5mL-10mL来消化细胞。
[0060] 所述细胞因子为B27或N2、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胰 岛素。其中，所述B27或N2在培养乳腺癌干细胞时，向乳腺癌干细胞基础培养基（例如 NS-basal)中添加，达终浓度为1倍。其中所述B27和N2是商业上可供的细胞培养添加剂 (即细胞因子），例如，美国Gibco公司生产的50倍的B27和N2。所述表皮细胞生长因子 (EGF)在培养乳腺癌干细胞时，向乳腺癌干细胞基础培养基（例如NS-basal)中添加，达终 浓度为10ng/mL-50ng/mL。所述碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)在培养乳腺癌干细胞时， 向乳腺癌干细胞基础培养基（例如NS-basal)中添加，达终浓度为10ng/mL-50ng/mL。所述 胰岛素在培养乳腺癌干细胞时，向乳腺癌干细胞基础培养基（例如NS-basal)中添加，达终 浓度为 〇. 5mg/mL-10mg/mL。
[0061] 本发明还提供了一种上述乳腺癌干细胞抗原组合物的制备方法，其中，该方法包 括以下步骤：
[0062] 1)按照本发明所述的方法制备乳腺癌干细胞，
[0063] 2)用生理盐水洗涤并重悬所述乳腺癌干细胞，
[0064] 3)裂解所述乳腺癌干细胞。
[0065] 其中，将本发明的方法制得的乳腺癌干细胞抗原组合物在注射给患者时残留的培 养基组分以及可能残留的化疗药物不会引起患者不适。
[0066] 出于不在裂解乳腺癌干细胞后增加新的物质的考虑，优选所述裂解乳腺癌干细 胞的步骤包括超声裂解和/或反复冻融；所述超声裂解的条件包括在冰上或者冰水混合 物浴中，45瓦，lmin，5s ec/l次，然后取超声后悬液在镜下观察细胞破碎的效率。在4°C 下保持lh-6h，优选包括在38?43°C下保持2h-4h ;所述反复冻融的次数为3-5次，每两 次的间隔时间是l〇min-2h，优选为30min-lh，所述冷冻的温度范围是零下120°C -零下 196°C (可以使用液氮、干冰等来实现），优选零下150°C -零下196°C，所述融化的温度范围 是 10°C -37°C，优选为 20°C -37°C。
[0067] 裂解完成后，通常通过离心和过滤的步骤除去裂解液中过大的细胞碎片，例如，通 过800rpm离心lmin除去，然后上清用0. 45 μ m滤膜过滤。所述组合物的基本成分包括生 理盐水。裂解得到的本发明的抗原组合物可以在-80°C中保存。
[0068] 优选地，所述步骤1)中制备所得的乳腺癌干细胞的浓度为1X106到5X10 7细胞 /mL,作为一次免疫治疗，足以在体内引起免疫应答作用。
[0069] 进一步优选地，所述方法还包括步骤4)添加人血白蛋白；其中，以所述乳腺癌干 细胞抗原组合物为基准，所述人血白蛋白的含量为1-5重量体积％。
[0070] 本发明还提供了一种乳腺癌干细胞抗原负载树突状细胞制备的方法，其中，该方 法包括：通过裂解乳腺癌干细胞得到乳腺癌干细胞抗原组合物，将未成熟树突状细胞与乳 腺癌干细胞抗原组合物接触得到负载肿瘤抗原的抗乳腺癌树突状细胞，其中，所述方法包 括使用本发明所述的方法制备乳腺癌干细胞抗原组合物。优选所述未成熟树突状细胞与制 备乳腺癌干细胞抗原组合物的乳腺癌干细胞来自同一个体。这样可以最大限度地避免由于 免疫排斥反应而引起的副作用。当然，如果所述未成熟树突状细胞与制备乳腺癌干细胞抗 原组合物的乳腺癌干细胞并非来自同一个体，仍然可以使用本领域常用的抗免疫排斥反应 的药物来减小副作用。所述抗免疫排斥反应的药物例如地塞米松等。
[0071] 本发明还提供了一种由上述的方法得到的乳腺癌干细胞抗原组合物负载的树突 状细胞疫苗，所述树突状细胞疫苗包括树突状细胞，可来源于外周血、骨髓和脐带血等，其 中，所述树突状细胞为本发明所述的乳腺癌干细胞抗原组合物负载的树突状细胞。
[0072] 在制备树突状细胞疫苗之前，用生理盐水洗涤并重悬所述乳腺癌干细胞抗原组合 物负载的树突状细胞。将本发明的树突状细胞疫苗在注射给患者时残留的培养基组分以及 可能残留的化疗药物不会引起患者不适。所述疫苗包括1X 1〇6到5X 107个/mL本发明的 乳腺癌干细胞抗原组合物负载的树突状细胞，作为一次免疫治疗。所述疫苗还包括人血白 蛋白；其中，以所述疫苗为基准，所述人血白蛋白的含量为2-3重量体积％。
[0073] 本发明还提供了一种制备乳腺癌干细胞抗原负载的树突状细胞的试剂盒，其中， 所述试剂盒包括：
[0074] 1)乳腺癌干细胞基础培养基；
[0075] 2) ATP结合框亚家族G成分2、五次跨膜单链糖蛋白PR0M1、乙醛脱氢酶-1和磷酸 酶与张力蛋白同源物的至少两种；优选包括所述四种蛋白。
[0076] 3)消化细胞的酶；
[0077] 4) B27或N2、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素；
[0078] 5)树突状细胞基础培养基；
[0079] 6)巨粒细胞-噬细胞集落刺激因子和白介素-4 ;
[0080] 7)肿瘤坏死因子α ;以及
[0081] 6)使用说明书；
[0082] 其中，所述使用说明书包括本发明所述的乳腺癌干细胞抗原负载的树突状细胞的 制备方法。
[0083] 优选地，所述试剂盒还包括针对所述ΑΤΡ结合框亚家族G成分2、五次跨膜单链糖 蛋白PR0M1、乙醛脱氢酶-1和磷酸酶与张力蛋白同源物的至少两种的抗体。利用所述抗体， 使用免疫磁珠法和/或流式细胞仪可以分选法富集所述待测细胞中的乳腺癌干细胞。
[0084] 其中，所述乳腺癌干细胞基础培养基可以是NS-basal、DMEM/F12(1 : 1)等。所 述乳腺癌干细胞培养体系包括乳腺癌干细胞和5mL-50mL的乳腺癌干细胞基础培养基，在 37°C、5% C02培养箱中培养。
[0085] 所述消化细胞的酶优选为胰酶和/或Accutase。其中，在乳腺癌干细胞基础培养 基达5mL-50mL的时，所述胰酶和/或Accutase优选作为肿瘤组织分离乳腺癌干细胞所使 用试剂，可以使用本领域常规的用量，例如一般用量为1倍浓度的〇. 5mL-10mL来消化细胞。
[0086] 其中，所述B27或N2在培养乳腺癌干细胞时，向乳腺癌干细胞基础培养基（例如 NS-basal)中添加，达终浓度为1倍。所述EGF在培养乳腺癌干细胞时，向乳腺癌干细胞基础 培养基（例如NS-basal)中添加，达终浓度为10ng/mL-50ng/mL。所述bFGF在培养乳腺癌干 细胞时，向乳腺癌干细胞基础培养基（例如NS-basal)中添加，达终浓度为10ng/mL-50ng/ mL。所述胰岛素在培养乳腺癌干细胞时，向乳腺癌干细胞基础培养基（例如NS-basal)中 添加，达终浓度为0. 5mg/mL-10mg/mL。
[0087] 由本发明制备乳腺癌干细胞抗原组合物的方法所得到的乳腺癌干细胞抗原组合 物来自细胞浓度为1X 1〇6到5X 107细胞/mL由本发明制备乳腺癌干细胞的方法所得到的 乳腺癌干细胞，作为一次免疫治疗。所述细胞浓度过大造成浪费，反之细胞浓度过小，则不 足以引起树突状细胞抗肿瘤的免疫应答作用。
[0088] 所述树突状细胞基础培养基可以是X-VIV015、X-VIV020、AM-V、RPMI/1640等。 所述树突状细胞培养体系包括乳腺癌干细胞和lmL-100mL、优选30-80mL的树突状细胞 基础培养基，在37°C、5% C02培养箱中培养。其中，所述巨粒细胞-噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)在乳腺癌干细胞抗原组合物负载树突状细胞时添加到树突状细胞基础培养基中， 终浓度5001U/mL-2000IU/mL。所述白介素-4在乳腺癌干细胞抗原组合物负载树突状细胞 时添加到树突状细胞基础培养基中，终浓度100IU/mL-1000IU/mL。所述肿瘤坏死因子α在 乳腺癌干细胞抗原组合物负载树突状细胞时添加到树突状细胞基础培养基中，终浓度5ng/ ml ,~100ng/mT,n
[0089] 本发明还提供了一种治疗癌症的方法，其包括给患者施用选自由本发明方法制备 的乳腺癌干细胞抗原组合物、本发明的抗癌树突状细胞以及本发明的树突状细胞疫苗所组 成的组中的药物。
[0090] 优选所述施用的方式为注射。具体地，施用乳腺癌干细胞抗原组合物的方式选自 由肿瘤组织内注射、静脉注射、皮下注射和皮内注射中的一种或几种；施用所述树突状细胞 疫苗的方式为在淋巴结部位皮下或皮内注射。优选施用所述树突状细胞疫苗的方式为在腹 部沟或腋下进行皮下或皮内注射。
[0091] 所述乳腺癌干细胞抗原组合物优选来自细胞浓度为1X 1〇6到5X 107细胞/mL 的本发明的乳腺癌干细胞，其有效量为〇. lmL-5mL/个体；所述树突状细胞疫苗优选包括 1 X 106到5 X 107个/mL本发明的抗癌树突状细胞，其有效量为0. lmL-2mL/个体。更优选所 述乳腺癌干细胞抗原组合物优选来自细胞浓度为1X 1〇6到1X 1〇7细胞/mL的本发明的乳 腺癌干细胞，其有效量为〇. 5mL-lmL/个体；所述树突状细胞疫苗优选包括5 X 106到5 X 107 个/mL本发明的抗癌树突状细胞，其有效量为lmL-2mL/个体。以上所述乳腺癌干细胞抗原 组合物和所述树突状细胞疫苗都是一次注射的剂量，一个疗程四次注射，间隔一周。
[0092] 所述乳腺癌干细胞和/或所述树突状细胞来自于同一患者，这样可以最大限度地 避免免疫排斥反应造成的副作用。本发明提及的手术从患者体内取出的乳腺癌瘤组织，属 于废弃的离体乳腺癌瘤组织，并非为实现本发明而特意从患者体内取出的乳腺癌瘤组织。 此外，本发明提及的细胞可以是商业上可供的细胞系。并且现有长期冷冻保藏细胞的技术 已经非常成熟，比如在液氮（零下196°C )下冻存细胞，例如脐带血来源造血干细胞保藏。 本领域技术人员完全可以利用上述技术保藏本发明涉及的乳腺癌瘤组织、肿瘤细胞、肿瘤 干细胞和树突状细胞，树突状细胞可以来源外周血、骨髓和脐带血等。
[0093] 以下，对本发明的具体实施例进行说明，但本发明的技术范围不限于这些示例。
[0094] 实施例1人乳腺癌细胞中肿瘤干细胞的检测
[0095] 将购自美国ATCC公司的人乳腺癌细胞（MCF-7)，在10mLRPMI1640培养基（含体积 比10%胎牛血清，美国Gibco公司和IX青霉素与链霉素混合液，美国Hyclone公司）中， 75cm 2培养瓶中，放置37°C、5% C02培养箱中培养，当细胞生长达到培养瓶底面的90%汇合 时，用2mL胰酶（美国Hyclone公司）消化后，苔盼兰计数，用新鲜RPMI1640培养基（含体 积比10%胎牛血清和IX青霉素与链霉素混合液）进行传代培养。
[0096] MCF-7细胞传代长到瓶底90 %汇合时，消化后取1份50 μ L (2 X 106个）细胞悬液 分别添加到一支含有20 μ L FITC-CD44 (美国BD公司）和20 μ LPE-CD24 (美国BD公司）， 另一支含有20 μ L FITC-IgGl (美国BD公司）和20 μ L PE-IgGl (美国BD公司）的lml离 心管中。混匀后置于4°C冰箱染色30分钟，然后用lmL的IX磷酸盐缓冲液（PBS)洗涤三 次，最后用〇. 5mL的1 XPBS重悬洗涤后的细胞，所得流式抗体染色后的细胞用FACSCalibur 基本型流式细胞仪检测（美国BD公司），结果未检出CD44+且CD24V1?的乳腺癌干细胞。 [0097] 实施例2正常乳腺来源的干细胞中肿瘤干细胞的检测
[0098] 将购自加拿大Stemcell公司的人乳腺干细胞（MaSC)，在10mL NS-basal培养基 (加拿大 Stemcell 公司，NeuroCult?)(含 10ng/mL 人表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF)、10ng/mL喊性成纤维细胞生长因子（bEGF)，美国peprotech公司）中，75cm 2 培养瓶中，放置37°C、5%C02培养箱中培养，当细胞成球生长达到ΙΟμπι时，用10ml移液 管取细胞培养液到15ml离心管中，lOOOrpm离心5min，弃上清用2mL胰酶（美国Hyclone 公司）消化细胞沉淀后，苔盼兰计数，用新鲜NS-basal培养基（含10ng/mL EGF)、10ng/mL bEGF)进行传代培养。
[0099] MaSC消化后取1份50 μ L(2X 106个）细胞悬液分别添加到一支含有 20μ LFITC-CD44(美国BD公司）和20μ L PE-CD24(美国BD公司），另一支含有20μ L FITC-IgGl (美国BD公司）和20 μ L PE-IgGl (美国BD公司）的lml离心管中。混匀后置 于4°C冰箱染色30分钟，然后用lmL的1 X磷酸盐缓冲液（PBS)洗涤三次，最后用0. 5mL的 1 X PBS重悬洗涤后的细胞，所得流式抗体染色后的细胞用FACSCalibur基本型流式细胞仪 检测（美国BD公司），结果未检出⑶44+且⑶24 V1?的乳腺癌干细胞。
[0100] 制备例3乳腺癌患者组织来源乳腺癌干细胞中肿瘤干细胞的检测
[0101] 乳腺癌组织来自在患者进行手术时采集的，患者经病理检查确诊为乳腺癌癌，并 与患者签署知情同意书，患者信息如下表一。
[0102]
【权利要求】
1. 一种制备乳腺癌干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括鉴定待测乳腺癌细胞标 本中是否存在乳腺癌干细胞的步骤： 所述步骤包括检测所述待测乳腺癌细胞标本中是否特异表达以下差异蛋白的至少两 种：ATP结合框亚家族G成分2、五次跨膜单链糖蛋白PR0M1、乙醛脱氢酶-1和磷酸酶与张 力蛋白同源物； 当鉴定所述待测乳腺癌细胞标本中存在乳腺癌干细胞时，该方法还包括：使用免疫磁 珠法和/或流式细胞仪分选法富集所述待测细胞中的乳腺癌干细胞的步骤； 所述获得的乳腺癌瘤干细胞成球生长，经流式细胞仪检测CD44+且CD24V1°W的乳腺癌 瘤干细胞占总细胞数的30%以上。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述特异表达差异蛋白是指使用双色双融合探 针间期荧光原位杂交技术检测所述乳腺癌细胞标本中的所述四种差异蛋白至少两种的结 果为阳性； 其中，以已知纯乳腺癌细胞为阴性对照，用双色双融合探针间期荧光原位杂交技术检 测100份所述阴性对照，每份含1〇3个细胞，测得每种差异蛋白假阳性信号细胞个数占每份 细胞总数的百分率为所测该种差异蛋白的假阳性率，将所测该种差异蛋白假阳性率的平均 值与标准方差之和定义为分界值； 取100份待测乳腺癌细胞标本，每份标本含1〇3个细胞，测得与阴性对照所测同种差异 蛋白阳性信号细胞个数占每份细胞总数的百分率为所测差异蛋白的阳性率的平均值，该阳 性率平均值大于等于所述分界值，则表明该待测乳腺癌细胞标本的该种差异蛋白的双色双 融合探针间期荧光原位杂交技术检测结果为阳性。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，当鉴定所述待测乳腺癌细胞标本中存在乳腺癌干 细胞时，该方法还包括： 使用免疫磁珠法和/或流式细胞仪分选法富集所述待测细胞中的乳腺癌干细胞的步 骤； 其中，利用针对得到特异表达的ATP结合框亚家族G成分2、五次跨膜单链糖蛋白 PROM1、乙醛脱氢酶-1和磷酸酶与张力蛋白同源物等四种差异蛋白的至少两种的抗体。
4. 一种制备乳腺癌干细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括： 1) 乳腺癌干细胞基础培养基； 2. ATP结合框亚家族G成分2、五次跨膜单链糖蛋白PROM1、乙醛脱氢酶-1、磷酸酶与张 力蛋白同源物的至少两种； 3) 消化细胞的酶； 4) 细胞因子以及； 5) 使用说明书； 其中，所述使用说明书包括权利要求1或2所述的方法。
5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括针对所述ATP结合框亚家族 G成分2、五次跨膜单链糖蛋白PROM1、乙醛脱氢酶-1和磷酸酶与张力蛋白同源物的至少两 种的抗体；所述使用说明书包括权利要求3所述的方法。
6. -种乳腺癌干细胞抗原组合物的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： 1)权利要求1-3中任意一项所述的乳腺癌干细胞； 2) 用生理盐水洗涤并重悬所述1 X 105到1 X 108细胞/mL乳腺癌干细胞； 3) 裂解所述乳腺癌干细胞； 其中，所述步骤3)包括通过热休克和/或反复冻融来裂解乳腺癌干细胞；所述热休克 裂解的条件包括在37?45°C下保持lh-6h ;所述反复冻融的次数为3-5次，两次的间隔时 间是10min-2h，所述冷冻的温度范围是零下120°C -零下196°C，所述融化的温度范围是 1(TC -37。。。
7. -种乳腺癌干细胞抗原组合物负载的树突状细胞的制备方法，其特征在于，该方法 包括：通过裂解乳腺癌干细胞得到乳腺癌干细胞抗原组合物，将正常树突状细胞与乳腺癌 干细胞抗原组合物接触得到负载肿瘤抗原的抗乳腺癌树突状细胞，其特征在于，所述乳腺 癌干细胞为权利要求1-4中任意一项所述的乳腺癌干细胞；所述乳腺癌干细胞抗原组合物 为权利要求6所述的乳腺癌干细胞抗原组合物。
8. -种制备乳腺癌干细胞抗原负载的树突状细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒 包括： 1) 乳腺癌干细胞基础培养基； 2. ATP结合框亚家族G成分2、五次跨膜单链糖蛋白PROM1、乙醛脱氢酶-1和磷酸酶与 张力蛋白同源物的至少两种； 3) 消化细胞的酶； 4. B27或N2、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素； 5) 树突状细胞基础培养基； 6) 巨粒细胞-噬细胞集落刺激因子； 7) 白介素_4、干扰素 α和肿瘤坏死因子α ;以及 6)使用说明书； 其中，所述使用说明书包括权利要求7所述的方法。
9. 根据权利要求8所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括针对所述ΑΤΡ结合框亚家族 G成分2、五次跨膜单链糖蛋白PROM1、乙醛脱氢酶-1和磷酸酶与张力蛋白同源物的至少两 种的抗体。
10. 权利要求6所述乳腺癌干细胞抗原组合物或权利要求7-9所述树突状细胞的应用。
【文档编号】C12N5/095GK104087556SQ201410300288
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】沈丽, 郝丽敏 申请人:北京弘润源生物技术有限公司