尖嘴魟微卫星位点、引物及其用途

尖嘴魟微卫星位点、引物及其用途
【专利摘要】本发明公开了尖嘴魟微卫星位点、引物及其用途，尖嘴魟微卫星位点包括10个稳定的多态性微卫星位点，其序列分别如SEQ?ID?NO：1-SEQ?ID?NO：10所示。所述的尖嘴魟微卫星位点的引物，其序列分别如SEQ?ID?NO：11-SEQ?ID?NO：30所示。所述的尖嘴魟微卫星位点或者所述的引物的用途，包括分子生态学研究，谱系分析，种质资源调查，辅助育种和个体识别，所述10对引物在15个尖嘴魟个体中的基因分型结果显示，等位基因数为3-24个，平均等位基因数为13.6个。期望杂合度He为0.5-0.984，观测杂合度Ho为0.429-1，表明这10对引物多态性高，可以满足尖嘴魟的个体识别。
【专利说明】尖嘴魟微卫星位点、引物及其用途

【技术领域】
[0001] 本发明涉及，尤其涉及的是一种尖嘴魟微卫星位点序列、引物及其用途。

【背景技术】
[0002] 尖嘴魟（Dasyatis zugei)隶属鲼形目、魟科，是一种生活在近海区域的软骨鱼。受 到污染、过度捕捞、渔业养殖等影响，目前种群数量日益减少，亟待保护。对其保护需要了解 其种群结构及遗传背景等遗传学信息，目前国内尚没有开展软骨鱼的分子遗传学研究。


【发明内容】

[0003] 本发明针对现有技术的不足，首次提供尖嘴魟的微卫星位点及引物，也是目前国 内首次针对软骨鱼类的分子遗传学研究结果。
[0004] 本发明的技术方案如下：
[0005] 尖嘴魟微卫星位点，包括10个稳定的多态性微卫星位点，其序列分别如SEQ ID NO :1-SEQ ID NO :10 所示。
[0006] 所述的尖嘴魟微卫星位点的引物，其序列分别如SEQ ID NO :11-SEQ ID NO :30所 /_J、1 o
[0007] 所述的尖嘴魟微卫星位点或者所述的引物的用途，包括分子生态学研究，谱系分 析，种质资源调查，辅助育种和个体识别，所述10个稳定的多态性微卫星位点组合使用，或 者其对应的引物组合使用。
[0008] 所述10对引物在15个尖嘴魟个体中的基因分型结果显示，等位基因数为3-24 个，平均等位基因数为13. 6个。期望杂合度He为0. 5-0. 984,观测杂合度Ho为0. 429-1， 表明这10对引物多态性高，可以满足尖嘴魟的个体识别。

【专利附图】

【附图说明】
[0009] 图1尖嘴魟DNA 1 %琼脂糖-EB凝胶电泳结果；M :Trans2K DNA Marker ; 1-4 :尖嘴 魟全基因组DNA ;Y :空白对照；
[0010] 图2 AFLP扩增产物1%琼脂糖-ΕΒ凝胶电泳结果；M :Trans2K DNA Marker ;1-8 : AFLP扩增产物；Y :空白对照；
[0011] 图3菌落PCR 2 %琼脂糖-EB凝胶电泳结果；M :Trans2K DNA Marker (同图2); 1-8 :菌落PCR结果，其中2、6、7和8号为双带，被认为阳性重组子；Y:空白对照；

【具体实施方式】
[0012] 以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
[0013] 1、DNA 抽提
[0014] 利用尖嘴魟肌肉组织，提取基因组DNA。抽提方法采用SDS/蛋白酶K裂解、酚-氯 仿抽提途径（Sambrook et al. ,1999)。DNA抽提效果见图1(展示部分）·
[0015] 2、尖嘴魟微卫星富集文库的构建
[0016] 取基因组DNA 250ng左右，使用限制性内切酶Msel打断，同时与Msel的AFLP受 体接头（5'_TAC TCA GGA CTC AT-3' /5' -GAC GAT GAG TCC TGA G-3'）进行连接。将消 化产物稀释十倍以后，使用AFLP受体特异的引物（5'-GAT GAG TCC TGA GTA AN-3'，简称 Msel-N)进行PCR扩增。扩增产物使用1%琼脂糖-EB凝胶检测，结果为大于200bp的弥散 带，见图2。
[0017] 分别使用带有生物素接头的探针仏〇12和（AG)12与上述PCR扩增片段进行杂交 后，使用链霉亲和素磁珠进行吸附洗脱，以获得所需的单链微卫星重复序列。以捕获的DNA 为模板，以Msel-N为引物进行双链DNA恢复。PCR产物经PCR清洁试剂盒（Axygen)纯化， 并用1%琼脂糖-EB凝胶检测，结果为大于200bp的弥散带则视为成功。
[0018] 将纯化后的双链恢复产物与 pEASY-Tl Simple Cloning Vector (TransGen Biotech)连接后转化于 Trans5 a chemically competent cells (TransGen Biotech) 中。将已转化的感受态细胞涂布于添加 0. 5mM IPTG和0. 5yg/mL X-Gal含0. 06mg/ml氨 苄（Amp)的LB固体培养基平板上，在恒温培养箱中37°C培养13h，得到包含AC、AG两种重 复的微卫星文库。
[0019] 3、阳性克隆的筛选、测序及引物设计
[0020] 挑取白色饱满的菌落置于Amp+LB液体培养基中扩大培养（37°C，5h)。采用三引 物PCR法（Zane et al，2002)检测含有微卫星片段的阳性重组子。实验中选用M13载体通 用引物（M13-47)和克隆对应的无生物素标记的探针仏〇 12八八6)12进行反应。如果产物在 2%琼脂糖-EB凝胶电泳结果中出现两条或两条以上的条带，则认为该单克隆含有目的序 列，见图3 (展示部分）。通过三引物法成功检验出有目的序列的阳性重组子107个，对这些 重组子的质粒使用M13通用引物进行测序。
[0021] 4、序列分析、引物设计及微卫星位点的初步筛选
[0022] 检查测序结果，去除M13的载体序列后，使用TRF软件（Tandem Repeats Finder, Version3. 2· 1)寻找其中含有微卫星重复单元的序列（Benson，1999)。使用PRMER5软件 (Lalitha，2000;Singh et al. ,1998)在重复单元序列上、下游的侧翼序列中设计引物，将 目的片段设置为100_400bp之间。共选择28个微卫星重复位点作为备选标记。
[0023] 5、基因分型数据的读取和微卫星位点的获得
[0024] 对初选出的28个微卫星位点的单侧引物5'端加上荧光基团标记（FAM/HEX/ TAMRA)，然后使用15个尖嘴魟个体的DNA对上述微卫星位点进行扩增筛选。首先对待选位 点的PCR进行扩增条件的优化，循环设置为：95°C预变性5 min;95°C变性30 sec，48°C到 60°C中选择8个温度梯度退火30sec，72°C延伸60sec，反应30个循环；72°C延伸10min。扩 增产物使用2 %琼脂糖-EB凝胶电泳检测，确定出最合适的引物退火温度。排除出现以下情 况的备选位点：在8个温度梯度中均未得到清晰的单一条带；扩增结果不稳定，在不同个体 中不具有重复性。对具有稳定单一条带的扩增产物使用Tamara500荧光分子量标准在ABI 3730DNA测序仪中使用聚丙烯酰胺凝胶进行基因分型，基因分析的结果使用Genescan 2. 0 软件进行读取。基因分型结果经过分析后，去除出现下列情况的备选位点：无基因分型结果 的位点；在任一个体中等位基因数在两个以上的位点；在15个野生尖嘴魟中等位基因在两 个以下的位点。经过筛选后，最终获得10个稳定的多态性微卫星位点，微卫星序列如下所 示：
[0025] DzuI25(291bp)
[0026] ACATTGAATGACATTTAGAAATGGGAACAGAAGTGCTTGTCAGCCAACCATGAGTCTTCTTTAGATAAC AGCAACAACAAACAGCAAAACAGCAAACCAGATCCTTTCCCACACACACACACACACACACACACACACACACACAC ACACACACACACCACACACACACACACTCACACACACACACTCACACACACACACATACACACACACACACACACAC AGGCTATTATTTATACAAAATAGCATAGAAAGAAAGAGGCATTTATTCTCTTTTCACTCCTCACTCCT
[0027] DzuI45(520bp)
[0028] ATGGTGAAACTGAAGGAGCTGGACTTGGTGGGGATCACGCTATTGCCTGTGTTGGAGAGGCCTCGGTGT GCGAAGGTGGTGTGTAGTCCAACAGCGAGTGACTGTCTTAGTTGCTTGTCTTGTGATCACAAGACCCTGTTGGAAGT TGTTGGTGTGGAGCGCTGCAAGTCCAATTCCTGATTTATTGGCGGGGGGCGGGGGAGCTGCGTGGCCTCTGACCTGG CGAGGAGTGGGCCTCAAGCCGCAGTGTTGCCTGTTTACAGACACCCAGGAGAGAGGCATTGGAGTCGGAGGCGGCGT CAGAGCTGAAGCTGGGTGCTGCCATCTAGTGTTTGCCCAGCAGAATACAAGGTGCATGTTCGACTGCAACTGCTGCA GCATTAGCGGACTCACAGCCTTGGACTATTGTGTGTGTGTCTGTGTGTGTGTGTCTGTGTGTGTGTCTGTGTGTGAT TGTCGGTACTGTGTCTTGGCCCCAGTACTAGCAACACTTTTGTTTGTCTGTAAACCTGGATATGGT
[0029] DzuI31(569bp)
[0030] ACTCCACCCTGCCACTTTCCCACTTGGCACAAGCTGCCATCACCCCTCCTCAGTCTGCCTATCATAGTT GCTGCATGTTTTACCTCTCCCGCTCTCCTCTTTACACTGGCCATCTTACCTCTCCAATCCTGGTCGTGACACAGGGT TTTGACCCAAAATGCCAGACCCCAGTTCCTCGATACACACAGATACTGCTTGATCACTGAGTTCATGCATCTGCATT CCGTCATATTGTAATGTGTGCGAGCAATATCTGATAACAGCATCTCCAGTGACATTGGGGGAGTGAGGGAAGTACTA ACTTTCCAATGGGGCATAAATCAAGGGGATTTACAAATACAGTCTTGTGCAAAAGTCTTACACACACACACACACAC ACACACACACACACAGAGAGCTAGGGTTTGTAAGACTTTATCTGGCAGGAGCAAAGGATGTTGGGAATGGTGAGGGT GGAGGACTGTAGGACTGGTGGTAGAGAGGAGTGACAAGACTGGGAGGGTGGTGCAGGTGCAGACACACCCAGCCCTG AGACACCAGGCAAGGTCATTTGATTCTAAACAATTGGT
[0031] DzuI46(472bp)
[0032] CGTTATGTAGGCAGTCCTGGAAACAAAGTTATAGAGAAATATCAGACAGAGGCAAAATACTTAGATGA GTCATTCCTTCAATGTCATCATTTTGCTCTTACTTTGATCGCTGAAATCTCCGGAGAAGTTGGTGAGGTATATTTC ATGTACCACAGTGGCAGAAATCGCTGCTTTCCTTCTCTTTGTGATACAGAATACATCCGTTTGATCCGTCAGAAC CATGCAGGCCCCCGACGGAGGGATTACTTACTCTCCTCACTCTATTTTTTCTGTATCCCTGTAGTTCTGCCCTCT CTCTCTCTCACACACACTCTCTCTCTCTCTCTCACACACACACTCTCTCTCTCTCTCTCACACACACACATCCTA CACACACACACACACACACACACACACACTCACACTCACACAGACACACACACACACACACACAAATATCCATGC CTCTTTGATTGTTTGCTGCTATGGAGAT
[0033] DzuI51(430bp)
[0034] CCCACCATGGGCAATAGAAAAGTCACTGTTGCAAACAGTGCAGCGAGCAACACTGTCATTATTTTTTAC CCCTATTAGGCAGGGGTACACTTCGGTGTAGTCTGGGGTGAAGTATGTTTTATATTTTCATTTTTTGGAACACTTTG CCATGGTTCATGTTTTCTCTCTTACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACCG CATATACTGTAGCAGAGGTCCCAATACAGACTGGTTACAGACCTCCAGCCAGAACCACTACCATTGACAGCTACTTT CTATCTTCTATGGTCTGAGTCCAACATCCAAGTCACTGCAGATTGCATGCATCCTTTTCTCTGCATGAGCCCTCCAT GAGGGACCTGATCGAATAGGTTACTAAAATCCATGTAGACAACATCCTTACCT
[0035] DzuI57(720bp)
[0036] TGCCAAACAAAGTCACCCTCACTTTCCAAAACAAGAGAAAATCTGCAGATGCTCAAAATCCAAGCAACA CACACACACACACACACACACACACACACACACAAAATGCTGCAGGAACTCTGCAGGCTAGGTAGCATCCATGGAAA ATAATAAACAGTCGATGCTTCTGGCCAAGACTCCTTCGGCGCCCTCAGTTTCCCTCTGGATTTCACCCCAAGGGTTC AGGGAGTGATGATGGTTAGAACTGTTGGTCCTGAAACCCAAACCGTTTATACTGAGTAAATGCCTCGTCGCCATTGT CATTACTTTGCTAATGACTGAGGACAGACCAATCAGGTGCTAAATAGGTACATAATGGGTCTGTCATGTTTCTGTGA TCAGAACTTATCTCAGAAGCTTTATGCATGGTTGGGCAAATGTCAGTGCTGTAACTACACTGGACAGCTTGGCTAGA GATGCGACTAATACTGGAATAGAAACCTTCACCACTGCAATGGTTTCCCTTTGCCCTGTCTTATAGCCTTTACTGCA TCCTGCGCCTCTTGGCCGTTTCTTGGAGTGAAATGAGTGAGCTAAATCCTGGATACCAAGACAGCAGCTATCCCCAG GAGAAAGCATTTACTTTGAATGAAGATCGCTGTACATGGACTTATCAAAAGATGTTTGCAAATGCTGGAACAATACA AGTTTCTAACACTTAGATCAAAAGATTTTTTTTGT
[0037] DzuI71 (811bp)
[0038] ACTAACTAATGCCACATAAATACTGCATGATTATTTATCCCCTCGTGTGGCCAGTAGTCATCCGCCATC ATCTACAAATGGCCATTGAGATTCTTTTGACATAGGGAGGCCATTACCTCAAGGATTTGGCAGAGCAAGATCTTGGC AACAAGATCCAAAATGGTCAAACTGGCTCGGCTACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAC ACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAAA TTCCACCTAACTGCCCCCCATCTGTCAGACACTACCCTCTCAACTTCCTCCCCTTTCACTTGACCCCTTCCTTTCTC CCTCTTTCTTCTTCCGAATCCGGCCTCCTCCTCTCCATTTGCCAGGAGCCTGCTCCCTCTGATAATCACAGGTGTTC AGTTTATTAGTGTCTGCTTCCCAACTGCACGATACTTCCCCATTACAACTGGTCCCCAAAGTTACACCACCGCAGAA TTTCTGAAATTTCCCCAGAAAACCACAGGATGTTCTGCAAGTGACTACCCAAAGCCGCTCAACGTTGGCAGATGGTG GTTTCTTGGTGCTCTGTTGGTGGAGGACATGTGGGTTTTGAGGGAAAGGGTAGTGTGTGGAAGGCAGAGTTTAAGAT CATTGTATATGCTGAGCGATCCGATGATGAGCAATGAGGGACCCTCACTCCTGCAGAATGTAATCTCCTTCACAGTT AGGACTTACCAAAACCTTCACAGAGAGCTGAAAGAATGTTTGGTTTTGT
[0039] DzuI82(352bp)
[0040] CAAATAAAGGCGCCCTATACACACAGACAAGCTAAATCACACACACACACACACAATCTATAAATATTC TCTCTCCCTCACTCACTCACTCACACACATACACTACAGACATAGGCAGACTATCTCTCTTTTTCACCCACCTATCC CACCCCCTCTATACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAGTTGGAAGGAGACACA AATGAAATATAACGGGAAGTAACTCAATACAACTCTATCTTCGTTTATCACAGACACAATGGGACGAACCGTCTCCT CTGTGTGCGTCGGATTTCAAATATACAGAGATGCGTACACGATAAACCAGAT
[0041] DzuII15(410bp)
[0042] GGATAGTTCACGATAATACGGTATATATCCTGGAATGTAGAACGCAGCGGTACAACAGGTGGTGCTGCT GCATGACCTCCAGTGTCTAGCATTTGACCCTGACTTTGGATGCAAACTGTCTCCCTGTAGCTGCAAGGGTTTCTGCC AGATGCACTGCATTCCTGCCTTATCCCAAAGTTGTGCTGGCAGGTTAGCTGGCTGTTGTAAATTGCCGAGAGAGAGA GAGAGAGAGAGAGAGAGAGTGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGTGTG TGTGTGTGTTGGCACGTGGCCTAGTGGGCAAGGCATCAGACTAGTAACCTGAAGGTCACAGGTTCAAGCCTCAGCTG AGGCAGCGAGTGTGTGTCCTTGAGCAAGGCAGT
[0043] DzuII64 (649bp)
[0044] CTATTTATGCCTGCCAGCATCTTTTATATCTACTTCTATACATGTAACTGTTCAGTATTTTTCCCAGTG GTCGCAGGATACATATATAAATGTTCTGCATTTCTCCTACTGATTACATTTGTATCATTCTGGAAAGCTCTGGAAGT TTCTCCGGTGTTGCATTATTTGTATAGGGGCTATCTGATTGGTTGACTCTTATCTACAGATTTGAATGAAATGTTCC TCATCTATGGGGGTTCAAAAAGCTCCTTGCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCCCTCTCTCTCTCTCCCTCTCTCTCTCTC TCTCTCTCTCCCTCTGCCCCTCTTACTGCCGGATTTCAATTTTCTTTCTTTCATTAGTGCTCCATAAAATGACAGGG AGGCAAGAAGTTTTGTGCCTCTTCCTGACTTCCGAAAGAATCTTGGATAAAATATATCAGAGTCCACGTGACACTGT CTGAGCGGAGCTTGTGCGTCCCCCCCAGGACCACGACGGTTCCCTCTGGGTTCTCTGGATCGCCCCTACTTCCGAAG ACATACGGATTCAAGTTGGTCCGGTGGCATTGTGAACATTCTTTGCTGTGATTCGCCCTCCGAACAGTCTGTGTCAG TGGTGACTCACCGAGTGCCTCCTCCATTCATCCCTGTCGGT
[0045] 10个位点的引物序列如下表1所示：
[0046] 表110个位点的引物序列
[0047]
[0048]

【权利要求】
1. 一种尖嘴魟微卫星位点，包括10个稳定的多态性微卫星位点，其序列分别如SEQ ID NO :1-SEQ ID NO :10 所示。
2. 根据权利要求1所述的尖嘴魟微卫星位点的引物，其序列分别如SEQ ID NO: 11-SEQID NO :30 所示。
3. 权利要求1所述的尖嘴魟微卫星位点或者权利要求2所述的引物的用途，包括分子 生态学研究，谱系分析，种质资源调查，辅助育种和个体识别，所述10个稳定的多态性微卫 星位点组合使用，或者其对应的引物组合使用。
【文档编号】C12Q1/68GK104087584SQ201410345130
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月21日 优先权日:2014年7月21日
【发明者】张洁, 陈骁, 张保卫, 王慧 申请人:张洁