安徽麝微卫星位点、引物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了安徽麝微卫星位点、引物及其应用，安徽麝微卫星位点包括9个稳定的多态性微卫星位点，其序列分别如SEQ?ID?NO：1-SEQ?ID?NO：9所示。所述的安徽麝微卫星位点的引物，其序列分别如SEQ?ID?NO：10-SEQ?ID?NO：27所示。应用上述引物，对7个个体的基因分型数据显示，等位基因数为0-4，期望杂合度He为0-0.779，观测杂合度Ho为0-0.714.除了位点MaI75外，其他均表现出多态性，达到了个体识别的要求。
【专利说明】安徽麝微卫星位点、引物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术，尤其涉及的是安徽麝微卫星位点、引物及其应用。
【背景技术】
[0002] 安徽廣隶属于偶蹄目（Artiodactyla)、反刍亚目（Ruminantia)、有角下目 (Pecora)、麝科（Moschidae)，是古北界特有哺乳动物。仅分布在安徽、河南、湖北三省交界 的大别山，是华东地区珍贵的野生动物资源。目前，种群数量总计在500-600只左右。分子 生物信息为建立改物种保护单元提供了一定的理论依据。而该方面的研究上处于空白。因 此，展开安徽麝的遗传学研究已经可不容缓。
[0003] 目前安徽麝种群数量稀少，在野外调查中较难发现，导致样品的采集十分艰难，而 目前最为合适的非损伤采样方法是采集粪便。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供安徽麝微卫星位点、引物 及其应用。本发明是首次提供安徽麝的微卫星位点及引物，并且利用这些位点对采集到的 粪便样品进行遗传学鉴定和个体识别。这些位点在对安徽麝的保护遗传学研究、种质资源 调查、个体识别和辅助育种中起到重要作用。
[0005] 本发明的技术方案如下：
[0006] 安徽麝微卫星位点，包括9个稳定的多态性微卫星位点，其序列分别如SEQ ID N0 : 1-SEQ ID NO :9 所示。
[0007] 所述的安徽麝微卫星位点的引物，其序列分别如SEQ ID NO :10-SEQ ID NO :27所 /_J、1 o
[0008] 所述的安徽麝微卫星位点或者所述的引物的应用，包括分子生态学研究，谱系分 析，种质资源调查，辅助育种和个体识别，所述9个稳定的多态性微卫星位点组合使用，或 者其对应的引物组合使用。
[0009] 应用上述引物，对7个个体的基因分型数据显示，等位基因数为0-4,期望杂合度 He为0-0. 779,观测杂合度Ho为0-0. 714.除了位点MaI75外，其他均表现出多态性，达到 了个体识别的要求。
【专利附图】
【附图说明】
[0010] 图 1 AFLP 扩增结果凝胶电泳检测图；M :Trans 2K Plus II DNA Marker ;L1-L2 : AFLP扩增结果；Y :空白对照；
[0011] 图2安徽麝粪便DNA提取结果凝胶电泳图；M :Trans 2K DNA Marker ;L1-L7 :粪便 DNA抽提结果；
【具体实施方式】
[0012] 以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
[0013] 1、建库DNA抽提
[0014] 由于建库筛选微卫星位点需要高质量的模板，所以我们剪取安徽麝肌肉组织（来 自林业局收缴的偷猎样品），提取DNA作为微卫星富集文库的模板。基因组DNA的抽提采用 SDS/蛋白酶K裂解、酚-氯仿抽提途径（Sambrook et al.，1999)。
[0015] 2、安徽麝微卫星富集文库的构建
[0016] 利用提取基因组DNA，采用AFLP快速分离法（Fast Isolation by AFLP of Sequences Containing repeats, FIASCO)来构建微卫星富集文库，具体过程如下：取基因 组DNA 250ng左右，使用Msel消化，同时与Msel的AFLP受体接头（5, -TAC TCA GGA CTC AT-3' /5' -GAC GAT GAG TCC TGA G-3'）进行连接。将消化产物稀释十倍以后，用AFLP受 体特异的引物（5'_GAT GAG TCC TGA GTAAN-3'，简称Msel-N)做PCR扩增。扩增产物在 1%的琼脂糖凝胶电泳30min后为大于200bp的弥散带（如图1)。
[0017] 使用探针（AC)12或者（AG)12与酶切连接液PCR扩增片段进行杂交后，使用磁珠进 行吸附洗脱，即可获得所需的单链微卫星重复序列。以捕获的DNA为模板，以Msel-N为引物 进行双链DNA恢复。PCR反应体积为50 μ L，反应体系组成为：dNTP 5 μ L，Buffer 5 μ L，rTaq 0.5yL，MseI-N Primer 2yL，磁珠洗脱液5μΙ^ΡΟ?的循环设置为：95°C预变性5min;95°C 变性30sec ;60°C退火30sec ;72°C延伸45sec，进行5个循环；进行另外92°C变性30sec ; 60°C退火 30sec ;72°C延伸 45sec 的 30 个循环，72°C延伸 10min。
[0018] PCR产物经PCR清洁试剂盒（Axygen)纯化，并用2 %琼脂糖-EB凝胶检测，结果为 大于200bp的弥散带则视为成功。将纯化后的双链恢复产物与pEASY-Tl载体（TransGen Biotech)连接后转化于DH5-a感受态细胞（TransGen Biotech)中。将已转化的感受态细 胞涂布于添加0. 5mM IPTG和0. 5 μ g/mLX-Gal的Amp+LB平板上，在37°C下培养13h，得到 包含AC、AG两种重复的微卫星文库。
[0019] 3、阳性克隆的筛选、测序及引物设计
[0020] 挑取白色饱满的菌落置于Amp+LB液体培养基中扩大培养（37°C，5h)。采用三引 物PCR法（Zane et al.，2002)检测含有微卫星片段的阳性重组子。实验中选用M13载体 通用引物（M13-47)和克隆对应的无生物素标记的探针仏〇 12八八6)12进行反应。如果产物 出现两条或两条以上的条带即可认为该单克隆含有目的序列，反之则认为无目的序列。通 过三引物法成功检验出有目的序列的阳性重组子108个，对这些重组子进行测序。
[0021] 4、序列分析、引物设计及微卫星位点的初步筛选
[0022] 检查测序结果，去除M13的载体序列后，使用TRF软件（Tandem Repeats Finder, Version3. 2· 1)寻找其中含有微卫星重复单元的序列（Benson，1999)。使用PRMER5软件 (Lalitha，2000;Singh et al. ,1998)在重复单元序列上、下游的侧翼序列中设计引物，将 目的片段设置为100_400bp之间。共选择18个微卫星重复位点作为备选标记。
[0023] 5、基因分型数据的读取和微卫星位点的获得
[0024] 为检测筛选初筛得到的微卫星位点的多态性在物种鉴定及个体识别方面的实用 性，对初选出的18个微卫星位点的单侧引物5'端进行荧光标记（FAM/HEX/TAMRA)，然后使 用多个安徽麝个体进行扩增筛选。由于安徽麝是国家I级保护动物，数量稀少，只适宜采取 非损伤性采样，我们利用野外拾取的粪便样品进行DNA的抽提，抽提方法如下：将乙醇保存 的粪便破碎并混合均勻后，将lg粪便样品转移到15ml离心管中，10000r/min离心去乙醇。 加入10ml双蒸水振荡洗涤样品10000r/min离心去上清。加入3ml裂解液（1% SDS，0. 5M EDTA，0.01M Tris-HCl)，50y 1 蛋白酶 K(20mg/ml)，混匀后 55°C 水浴 lh。10000r/min 离心 沉淀粪便残渣后，将上层裂解液转入装有2g 土豆粉的离心管中，振荡将淀粉悬浮。lOOOOr/ min离心lOmin沉淀淀粉颗粒，将上清液转入新管。加入0. 25倍体积的NaCl (3. 5M)，0. 3 倍体积的抽提缓冲液（10% CTAB，0. 7M NaCl)，混匀后65°C水浴lOmin，使用等体积酚-氯 仿-异戊醇（25 : 24 : 1)抽提3次。加入等体积的DNA结合液混匀，4000r/min离心通 过DNA结合柱，弃废液，使用75%乙醇，10000r/min离心洗涤DNA结合柱的滤膜2次。加入 100 μ L TE洗脱滤膜上的DNA，并离心洗脱并琼脂糖凝胶电泳检测（如图2)，-20°C保存。
[0025] 扩增过程如下：首先对待选位点的PCR扩增，循环设置为：95°C预变性5 min ;95°C 变性30 sec，Tm温度下退火30sec，72°C延伸60sec，反应30个循环；72°C延伸lOmin。扩 增产物使用Tamara350荧光分子量标准在ABI 377DNA测序仪中使用聚丙烯酰胺凝胶进行 基因分型，基因分析的结果使用Genescan 2. 0软件进行读取。
[0026] 经过筛选后，最终获得9个稳定的多态微卫星位点，微卫星序列如下所示：
[0027] MalOl
[0028] TAACACAACATTGTTGATCAACTACACTCTAAAATAAAATAAATATTTACAAAAAAAGTTACAAAAAAA GGAAAGGATGCCTGGAAATACAAGAACTTGTCATTGGAGTTAGACAATATGGTGGATGGGCCAACTTTCAATAGGCT TATTTTATTTCACTGACTCTATTTTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGATAACCCAAAAATCA GAGCACAAGGGAGTGAAAGTCGGTAGAAGTGGGAGGAGGGAGAGATAAGAGTGGAACGTGGGTGGTCTAAAACAAGC AAGGGCAGTAAGACAGTCCCAGGTTCCTTCTAAGTCCTGATTATTATAAACAGTGTTACAGTGAACACTGGGGTGTA TATATCTTTTCGAATTATGGTTTTCTCCAGAAGCGACCTAAATGTCCAT
[0029] MaI02
[0030] TAAATAAATAACTGCAATATTATGATAAACTCCACAAGTACAATGTTGTATATTAGGAAGTAACCCTTG AAATATTTACAGAGGAAGAAGCTTCTACCCTGTTTATGAATACTGAGAGAGTGTTTGCCAGGTAGACAAGGTCAGGT GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCATGGGGGTGGGGGGGATATTCCAGATAGAAGGAACATGT CAAGGGCACAGAATACCATGATGAGGTTCAGGGGAAGTTCACATTTATCAACTGTGGGCAACAGGGAACCCCAAAGG TGTGAGTAGGCTAGGGAGGAACTGGATTTCTATATTAGAGGGATCTCCTTTGTGTCAGCATAGAGGTCGAATTTAGG GTTGAGAATGGGGGTAGGCATGAAGTCAAAGGCAGAAATACCAATCAAGAGGTCACTGTGATAGTCTAGGAAAGAAA TGATGAGGACCCTTATCACTTTGTCTTTCACTCAAAACTCAAACTCTCCCTGAACTTTTCCATTTCAAACAGCTCAA ATCCAAAATTTTGATAAAGTCACAGATCAGT
[0031] Mai 17
[0032] TAACTATGTTATTTTAGCATTTTTATGCACATGATTTGTATGGATTTGTAGCATTTCTGAAGTTCAGA TTAGCTTTCTAAGTGAAACTGATATGTGAAGTCAGTCATTAGTTTTCAGTCTGTTTCCTCTCCCTCTGTGTGTGTG TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCTTTCTCTCACTCTCAGACACACACAGATACACTTCAAGCTAGGAT AAGTTCTAAATCAAATCTCAAAAACCAATAATAAGAAAAAAGAGTGGTGCTTTCCMACAAACATCGTTTTTCTT CTCTACCCCTTTTTCTTGCTCCCTACACTGTT
[0033] Mai 32
[0034] TAATTATTTTTTCTTATGATGAGAACTTTAGAATCTACTCTCTTAGGAACTTTCAAATAAATTACTCTT TTCTTTCTCTGTGGATCTACTGACATGAGAGCCCAAAGTGCTAGGTAGTAGTTGCAACTTTTTCCTCAGTAGAATCT AGACTGGGGCTTCCCAAGTGGCTTAGTGGGTACAGAACCTGCCTGCCAATGCAGGAGATGTAAGAGATGCAGCTTCA ATCCCTGGGTCAGGAAGATCCCCTGGAGGAGGGCATGGCAACCGACTCCAATATTCTTGCCTAGTGAATCCCATGGA CAGAGGAGCCTGGCGGACTCCTGACAGAGGAGTCCATAGGGTTGCAAAGAGTCAGACACGATTGAGTCACACACACA CACACACACACACACAGAGCTTTACTTTAGTGGAAGCAACCCTCCAGTGTTCATTCAACTTACCTCTGTTGGT
[0035] Mai 48
[0036] TAACCATCACAAGAACTCTTTGAGATGGGTTACTATTATTGCACTTGGGAATATGGCTTACTTTTATAT TTATCTGAACATGCTCACTTTCTTTGCAATGAAAGTTCAATTTCCTTTACATAAGAAACAAGTGTGTGTGTGTATGT GCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAATGATCCCAGTGAGAAAATAATTATGTATTTATAAATGTTAG TCCTTGGCAAGTCTTTGCTGATTGCTCAGTCTATAGTCTTTTAGTTCAACAGCTTTTCAACTCCTTTTCCTGCTGGC TCAGATAAGTTCATATGCAAGCCCCAGTTCCCAGAGTAACACATGGTTCCCGGCATCCTAGTTGTCATGTAACCCTT TTGTTCCTTGACTTTTGAAAACACCAGCATCAGTGACAGAGAAATAAGCACTAAAGGGATAATCTTGAATCTGTTTT ACTTTGCTCATATGAAATTTTGCAGATGGACTACTCTAAACATTACACT
[0037] MaI75
[0038] TAAGGTAAAAAAAGGATTATACTGCAAAGGGAGGTCAAAGAGCAGCAGAGTCTAATTCTTTTTGTTTGG TATAAATGAGGTCCTGTACGGTGGCGTGGTGGTAAAGAATCTGCTTACTGATGCAGGAGATGAAATAGACATGGGTT CCATCTCTGGATTAGGAAGATCCCTTGGAGGAGGAGGAAACAGCAACGCATTCCAGTATTCTTGTCTAGAAAATTCA CGGACAGAGGAGCCTGGCAGGCTACAGTCCATGGGGCTGCAAAGAGTTGGATGCTACTGAGTGACTGAGCATGCACA CACACACACACACAAAAGCACACACACACGCACAGAAACACACACACACACATGCGTATAAGGAAAAGGTCAAAGTA CATGCAGAGAGGGGAAGAAATTGACAGAGTCAAGTATCTTGGT
[0039] Mai 79
[0040] TAAGTCACATTTACTGTTATATTAGAAGAACTACTCGTTAGCACATTTTATGCTACCATGCATGAACCC CAGTGTAACAAAGGCATCCTAGAAAATTCTTTCTCCAGAAACTCAAAACAGCTGGTGCTAGATGGTTGAGAATGCAG GCAGCTGGCTAACAACAGCTGGAGAGTATCAGCTGAGTAGCCAAGATCAGAGACAGCTGAGAGAGGCAGCCAGAGAG AAGGGCTCTCTCAAGATCATTCTGGTTCAGCAGACGGACTGCTTTTTTAGTTCAAAAAAGGAAAAGTTTCATTTTAG ACTGAACCCCAGCAATATAAATCCAAGAGTCACCAATGAGAACTCTCTCTGGAAAGGAAAACTGTTGCCTTCCTGAT TTGATCTTTTCCTGTAGCTCAAACGGTAAAGAATCTGCCTGCCATGCAGGAGACCAGGGTTCGATCCTGGATTGGTA AGTTCCTCTGGAGAAGGGAATGGCAATCCACTCTAGTATTCTTGCCTAGAGAATTCTACAGTCCGTGGGGTGGCAAA GAGTCGGACATGACTAAGCGACACACACACACCCCAGACATGAAAAACACACACACACACACGAAAAACACACACAC GAAACACACACACACACACCCAGACATGAAACACCAACCTCTGCTTCTATGT
[0041] Mai 168
[0042] TAAGGAAATTCTGTCAAATGAAGAATAGGGGTTTTAGGATCACCAGTCTCAGAAATGTTGGAAGAAAGA TAATATTTTAGAAGTAAGGGTTGGGGAAGGTTTGTCAATAGCCTTGGGTACTGAAAGAGGACAGATAATACAAGGAA CAATTGCTATGGGTATTGGGTCAGGGAATCAACAAAACAAGAGAAGGGTTGCTTAGAAGTAAGGAAGGTCAGTAAAA CCTGGATGGCATGAGCTTGCTGTTGCCAAAATCAGCAAGGCATCAAAAAGTGTGTGTCCAAAGTATTACTGGTCAGT TTCATTTATGGAACACTTACCAGAGTTATGCAAGATGGGCCCTCAGTAAGGGGGGCGGACAGAGCTGGAAAGCTGTG TGTATTCACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAGAGTCACATTTATGTTCTGTCAAAGAAGCAG AATTGCTTGCTCAATCTAGTGTTTTGTATACCTGGAAAAGACTTTACAGCTTATGTAGTTCAACCTAGACTTAGATG TGAGAACTGAATGTTACTTGCCAGAAATACTAGGAGGTAGTACGGTATAATGGT
[0043] Mai 199
[0044] TAACTGGTTGCCCTGATTCCATCCTTGCCTTCCCTGCTTTCTGTTCTCCACTCTGGGGTAATCTTTTT CACACGTAAATCAGATTGTGTCAAATTCAGAGTTCTGATCTGGTGGTACCTCTCCTCTTGCAGAAAAATTCTGTTC AATCCCTTTGCTCTCTGGCTGTATCACACTGGCCTTTGTGATGTTCTTAGAACATGCCAAACATTTCCTGCCTTT TAGTGCCAGTATCTGAGATTTCCTCTGCTGGGGATGCACTTGTTCCAGATAGCCAAATGGTCTGGTCCTTCACTG CCTTCGGGTTTCTGCTCAAACATCTCCTCCCTAACCACCCTCTCCATGAAAAATACTCTCTCTCTCTCCCTCCCT CTCTCTCTCTCTCTCTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTTGCTCTGATTTACTTGTCCCAGTTATTTATTATTGTGT ATCAAACCACCCTACACGGACTTCCCTAATGGTCCAGTGGTTAGGACTCTGTGTTTCCACTGCAGGGGGCACGGG TTTGATCCCTGGTGGAGGAAGTAAGATTCTGTGTGCCACGTGGTATGGCCAAAAAATAAAAGAAAACAAATCACC TCACGACTTAGTGGCT
[0045] 各位点的引物序列如下：
[0046] MaI01-F ：ATGGGCCAACTTTCAATAGG
[0047] MalOl-R ：ACCACCCACGTTCCACTCT
[0048] MaI02-F ：GAGAGTGTTTGCCAGGTAGAC
[0049] MaI02-R ：GTTGCCCACAGTTGATAAATG
[0050] MaI17-F ：ATGATTTGTATGGATTTGTAGCA
[0051] Mai17-R ：ATTATTGGTTTTTGAGATTTGATT
[0052] MaI32-F ：AATCTAGACTGGGGCTTCC
[0053] MaI32-R ：GAGGGTTGCTTCCACTAAA
[0054] MaI48-F ：GCACTTGGGAATATGGCTTAC
[0055] MaI48-R ：ATCCCTTTAGTGCTTATTTCTCTG
[0056] MaI75-F ：CGGTGGCGTGGTGGTAA
[0057] MaI75-R ：ACTCTGTCAATTTCTTCCCCTCTC
[0058] Mai79-F ：CTGTAGCTCAAACGGTAAAGAATC
[0059] MaI79-R ：CATAGAAGCAGAGGTTGGTGTT
[0060] MaII68-F ：CCAAAATCAGCAAGGCATCA
[0061] MaiI68-R ：AGTATTTCTGGCAAGTAACATTCA
[0062] MaII99-F ：ACTGCCTTCGGGTTTCTGCTC
[0063] MaiI99-R ；AAGTCCGTGTAGGGTGGTTTGATA
[0064] 7个粪便样品均鉴定为安徽麝所有。这7个个体的基因分型数据如下表1所示：
[0065] 表1 7个个体的基因分型数据
[0066]
【权利要求】
1. 安徽麝微卫星位点，包括9个稳定的多态性微卫星位点，其序列分别如SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO :9 所示。
2. 根据权利要求1所述的安徽麝微卫星位点的引物，其序列分别如SEQ ID NO :10-SEQ ID NO :27 所示。
3. 权利要求1所述的安徽麝微卫星位点或者权利要求2所述的引物的应用，包括分子 生态学研究，谱系分析，种质资源调查，辅助育种和个体识别，所述9个稳定的多态性微卫 星位点组合使用，或者其对应的引物组合使用。
【文档编号】C12Q1/68GK104087583SQ201410345129
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月21日 优先权日:2014年7月21日
【发明者】张保卫, 丁玲, 王慧, 潘涛 申请人:张保卫