基于共区域化触发链式杂交反应的适体传感器检测腺苷的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于共区域化触发链式杂交反应的适体传感器用于检测腺苷，由生物素化的适体链-1、适体链-2、发卡探针和链霉亲和素修饰的磁性纳米球组成，本发明的适体传感器用于检测腺苷，检测方法为：(1)链酶亲和素化修饰磁球的活化；(2)生物素化适体链-1的固定；(3)腺苷诱导的双适体的共区域化；(4)共区域化触发的链式杂交反应；(5)加入染料SYBR?Green?I和荧光检测；(6)计算：根据所测得的荧光值计算含有腺苷的待检测物中腺苷的浓度。本发明的适体传感器，通过共区域化诱导的链式杂交反应，降低了传统链式杂交反应的非特异性反应，具有检测灵敏度高、样品使用量小、无需酶放大等优势，可实现对低浓度腺苷的分析检测。
【专利说明】基于共区域化触发链式杂交反应的适体传感器检测腺苷
【技术领域】
[0001] 本发明涉及构建一种基于共区域化触发链式杂交反应的腺苷适体传感器检测腺 苷。
【背景技术】
[0002] 腺苷是一种重要的生物药物小分子，参与机体多种生命活动的调节，具有重要的 生理和药理作用，如舒张血管、收缩平滑肌以及对神经系统和免疫系统的调节作用。此外， 生物样本中腺苷的检测可用于疾病诊断、病程的监测以及癌症的早期诊断。因此对腺苷的 定量检测，尤其是生物样本中腺苷的检测在临床研究、疾病的诊断和预防以及癌症的早期 诊断等方面有重要的生物学意义。
[0003] 虽然大量的腺苷适体传感体系已成功实现了腺苷的分析检测，但是能够直接用于 生物样本中腺苷检测的适体传感器却很少，这主要是以下两个原因造成的：1、生物样本中 复杂体系的干扰，复杂的环境会对检测体系尤其含有蛋白酶的体系造成较大的影响；2、方 法灵敏度不够，不能达到生物样本的检测标准，正常人尿液中腺苷的含量是2 μ mol Γ1? 7 μ mol L'而生物样本中腺苷的检测在疾病的诊断和预防以及临床研究方面具有较高的 临床应用意义，例如生理状态下腺苷含量的波动可用于心、脑生理功能的研究，尿液中腺苷 含量的升高可用于肿瘤的早期诊断。因此，建立一个高灵敏度、高选择性，能实现生物样本 中腺苷直接检测的传感体系是十分必要的。
[0004] 目前，为了实现高灵敏度的分析检测，多种信号放大技术如滚环扩增、外切酶辅助 的信号扩增、核酸酶辅助的信号扩增以及基于聚合切刻酶等已被广泛用于腺苷的分析中。 这些方法虽然能大大提高腺苷的检测灵敏度，但是均需酶的辅助作用。而蛋白酶和核酸酶 的一些固有缺点（如易变性失活、高成本、需要特别的识别位点等），大大限制了这些放大 技术的广泛应用。近年来，粘性末端介导的链置换反应由于原理简单（碱基配对的基本原 理）、无酶、反应快速和无需特别设计的优势而得以快速发展，基于发卡结构自组装的HCR 和CHA反应是其中最为典型的两类方法。然而，非特异性反应的发生常常会造成较大的背 景信号，影响方法的灵敏度，因此我们构建了一种基于共区域化触发的链式杂交反应的适 体传感器，可以避免非特异性反应的发生，实现腺苷的高灵敏检测，同时实现生物样本中腺 苷的直接分析检测。
【发明内容】
[0005] 针对现有腺苷分析技术不能实现生物样本中腺苷的直接检测的问题，本发明的目 的是提供一种基于共区域化触发链式杂交反应的适体传感器，将该适体传感器用于腺苷的 分析检测，具有灵敏度高、选择性强和重现性好等优点，并且可以直接用于人尿液中腺苷的 含量测定，无需任何前处理过程。该适体传感器的工作原理是：首先，通过链酶亲和素和生 物素之间的特异性作用，将生物素化的适体链-1 (Bio-Apt-Ι)固定在磁球表面；然后加入 腺苷和适体链-2 (Apt-2)，通过腺苷的"粘合"作用，使得Bio-Apt-Ι和Apt-2结合在一起， 从而使得Bio-Apt-1连接的粘性末端区域和Apt-2连接的链置换区域发生共区域化，形成 完整的引物链，可以触发发卡结构H1和H2发生链式杂交反应（HCR);反应完成后，加入内 插染料SYBR Green I，产生荧光信号的输出。
[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0007] -种基于共区域化触发链式杂交反应的适体传感器，由生物素化的适体链-1、 适体链-2、发卡探针和链霉亲和素修饰的磁性纳米球组成，其中，所述生物素化的适体 链-1(Bio-Apt-1)为：
[0008] 5' -biotin-TTTTTTTTTTTT GTG CAA GTA CCA TT TAG ACC ACC TGG GGG AGT AT-3'（核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示）；
[0009] 所述适体链-2 (Apt-2)的序列为：
[0010] Apt-2 :5, -ΑΤΑ CTC CCC C AGGTGG TGT CTA GGA TTC GGC GTG-3，，（如 SEQ ID NO. 2所示）；
[0011] (注：Apt-2中斜体加粗序列是与Apt-1杂交的碱基）；
[0012] 所述发卡探针由发卡探针H1和发卡探针H2组成，其中，发卡探针H1的核苷酸序 列为：
[0013] 5'-TGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TM CAC GCC GAA TCC TAG ACA TGG TAC TTG CAC-3'（如 SEQ ID NO. 3 所示）；
[0014] 发卡探针H2的核苷酸序列为：
[0015] δ^ΤΤΑ ACC CAC GCC GAA TCC TAG ACA GTG CAA GTA CCA TGT CTA GGA TTC GGC GTG-3'（如 SEQ ID NO. 4 所示）。
[0016] 所述链霉亲和素修饰的磁性纳米球（链酶亲和素化修饰的磁性微球），下述简 称磁球，为现有技术中已有的常规产品，本发明所用的磁球购自Bangs Laboratories, Carmel，IN，USA，lmL 包装，密度为 1.343g mL1，直径为 350nm。
[0017] 所述基于共区域化触发链式杂交反应的适体传感器，用于检测腺苷的过程如下：
[0018] (1)链酶亲和素化修饰磁球的活化：为了防止磁球的聚集，磁球储备液中含有大 量的表面活性剂，在使用前，需要先将这些表面活性剂洗去，以活化磁球的功能，活化方式 为：
[0019] ①在离心管中加入200 μ L的TTL缓冲液和1 μ L链霉亲和素修饰的磁性纳米球， 经充分震荡洗涤后（震荡约5min)，将离心管置于磁球分离架上静置7min，移除溶液部分 (用移液枪小心吸出溶液，弃去）；
[0020] ②重复上述①的操作5次，最后得到活化的链酶亲和素化修饰的磁性微球 (1 μ L)，待用；
[0021] 所述TTL缓冲液的组成为：由Tris-HCl、Tween20、LiCl和水组成，其中，各组分的 浓度为：1〇〇臟〇1 L-1Tris-HCl ;0· 1% Tween20 ;lmol L-1LiCl ;ρΗ8· 0 ;
[0022] (2)生物素化适体链-1 (Bio-Apt-1)的固定：向上述活化好的1 μ L活化的链酶亲 和素化修饰的磁性微球中加入50 μ L的浓度为2. 0 X 10 _6mol Γ1的Bio-Apt-Ι，充分震荡混 匀后，放于37°C恒温箱中孵育2h ;反应完后，放于磁球分离架上，静置7min，移除溶液部分 (用移液枪小心吸出溶液，弃去）；然后用200 μ L的Tris-HCl杂交缓冲液清洗两次，最后获 得表面固定生物素化Apt-Ι的磁球；
[0023] 所述Tris-HCl杂交缓冲液的组成为：由Tris-HCl、NaCl、MgCldP水组成，其中，各 组分的浓度为：10mmol L Iris-HCl，ρΗ7· 4 ;300mmol L WaCl ；1mmo1 L ^gCl^。
[0024] 本发明的基于共区域化触发链式杂交反应的适体传感器，可以用于腺苷的分析检 测，具体应用时，应用方法如下：
[0025] (3)腺苷诱导的双适体的共区域化：向上述步骤（2)制备得到的表面固定生物素 化Apt-Ι的磁球中加入40 μ L的浓度为1. 0X 10 _6mol Γ1的Apt-2和10 μ L的含有腺苷的 待检测物，充分震荡混匀后，放于37°C恒温箱中孵育2h ;反应完后，放于磁球分离架上，静 置7min，移除溶液部分（用移液枪小心吸出溶液，弃去）；然后用200 μ L的Tris-HCl杂交 缓冲液清洗两次，最后获得腺苷诱导共区域化的Apt-l/Apt-2复合物；
[0026] 进一步地，所述含有腺苷的待检测物为人的尿液；
[0027] (4)共区域化触发的链式杂交反应：在上述腺苷诱导共区域化的Apt-l/Apt-2复 合物中加入50yL的发卡探针H1、H2的混合物（优选的，所述混合物中，发卡探针H1和H2 的浓度相同，均为3. OX l(T6m〇l Γ1)。充分震荡混匀后，放于37°C恒温箱中孵育3h ;反应 完后，放于磁球分离架上，静置7min，移除溶液部分（用移液枪小心吸出溶液，弃去）；然后 用200 μ L的PBS缓冲液清洗两次（以除去未反应的发卡探针），最后获得表面固定有长的 DNA双链的磁球；
[0028] 进一步地，发卡探针Η1和Η2在使用之前进行退火，目的是保证发卡的稳定性；退 火的步骤是：在90°C加热5min，然后缓慢冷却到室温；
[0029] (5)加入染料SYBR Green I和荧光检测：用PBS缓冲液将SYBR Green I稀释成 浓度为2. 0X10_6mol Γ1，然后加入到上述得到的表面固定有长的DNA双链的磁球中，室温 静置lOmin，然后进行荧光检测，得荧光值；
[0030] 进一步地，所述荧光光度计的基本设置为：激发波长为477nm，扫描范围为500? 600nm，激发狭缝宽度2. 5nm，发射狭缝宽度2. 5nm，PMT电压700V ;
[0031] (6)计算：根据上述所测得的荧光值计算含有腺苷的待检测物中腺苷的浓度；
[0032] 进一步地，利用下述线性方程计算得到腺苷的浓度：
[0033] Δ F = 14. 55+1769. 72 X 104C, (r = 0. 998)；
[0034] 其中，AF表示荧光净信号值，C表示腺苷的浓度，单位为mol Γ1 ;该线性方程的线 性范围是 1. OX l〇_6mol Γ1 ?1. 2Χ 10_4mol Γ1 之间。
[0035] 本发明的基于共区域化触发链式杂交反应的适体传感器的设计思路以及用于腺 苷的检测的原理为：杂交链反应（HCR)是一组利用粘性末端介导的链迁移反应来实现信号 放大的方法，整个反应是由碱基对形成是产生的自由能来驱动的。HCR反应是在等温、无酶 的条件下进行的。与其它以酶为基础构建的放大方法相比，HCR更稳定，更价廉。但是，HCR 反应中的非特异性反应是造成其背景信号的主要原因，也是限制其灵敏度的主要原因。因 此，本发明将粘性末端区域与链迁移区域分开，利用目标物诱导两个区域发生共区域化，创 造性的解决了传统HCR这种非特异性反应问题，构建了一种全新的、高灵敏的腺苷分析检 测方法。
[0036] 共区域化的发生会催化发卡探针H1和H2进行自组装，形成一条长的双螺旋聚合 物，SYBRGreen I是本设计中使用到的荧光信号标记分子，这种分子的特性是，在溶液中或 是遇到单链DNA时几乎不发荧光，而当插入到双链DNA的股沟中之后，会产生明显增强的荧 光信号，从而实现荧光检测。
[0037] 本发明具有如下有益效果：
[0038] (1)本发明的适体传感器具有检测灵敏度高、样品使用量小、无需酶放大等优势， 可实现对低浓度腺苷的分析检测。
[0039] (2)通过共区域化诱导的链式杂交反应，降低了传统链式杂交反应的非特异性反 应，提1? 了实验的灵敏度。
[0040] (3)通过磁性微球的分离作用，消除了复杂基质的干扰，可用于生物样本中腺苷的 分析检测，无需任何前处理过程。
[0041] (4)本发明的适体传感器用于腺苷定量检测的检测方法具有较好的重现性和精密 度，对腺苷具有良好的选择性，可实现在人尿样中对腺苷的检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0042] 图1 :生物素化适体链-1 (Bio-Apt-Ι)的固定示意简图。
[0043] 图2 :腺苷诱导的共区域化示意简图。
[0044] 图3 :共区域化触发的HCR反应示意简图。
[0045] 图4 :插入SYBR Green I产生突光不意简图。
[0046] 图5 :腺苷诱导共区域化的适体传感器的工作原理示意图。
[0047] 图6 :腺苷诱导共区域化的适体传感器的荧光图谱，其中，1 :Bi〇-Apt-l+Apt_2 ;2 : Bi〇-Apt-l+Apt-2+Adenosine ;3 :Bi〇-Apt-l+Apt_2+Adenosine+Hl+H2。F:体系突光强度； Wavelength:扫描的体系发射波长；
[0048] 图7 :腺苷浓度对体系荧光强度的影响示意图。
[0049] 图8 : AF与腺苷浓度的线性关系示意图。
[0050] 图9 :腺苷与其类似物的选择性实验结果示意图。
[0051] 图10 :尿样中腺苷浓度对体系荧光强度的影响示意图（曲线）。
[0052] 图11 :尿样中腺苷浓度对体系荧光强度的影响示意图（线性）。
[0053] 图12 :尿样中的选择性考察示意图。
【具体实施方式】
[0054] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0055] 下述实施例中，未详尽描述的试剂、方法均为所属领域的常规试剂、方法。
[0056] 实施例1构建基于共区域化触发链式杂交反应的适体传感器，进行腺苷的检测 [0057](一）仪器和试剂
[0058] (1)仪器装置
[0059] 荧光分光光度计（F-2500型号，日本Hitachi);电热恒稳培养箱（DNP-9052， 上海精宏实验设备有限公司）；干式恒温器（K30,杭州奥盛仪器有限公司）；旋涡混合器 (VDRTEX-5,海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；天平（H-101，上海康乐光电仪器有限公 司）；电子天平（ME型号，梅特勒-托利多仪器有限公司）。
[0060] (2)试剂
[0061] 本实验所使用的核酸探针均由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成和提纯，如下 所示：
[0062] 生物素化的适体链-1 (Bio-Apt-1)为：
[0063] 5' -biotin-TTTTTTTTTTTT GTG CAA GTA CCA TT TAG ACC ACC TGG GGG AGT AT-3'（核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示）；
[0064] 适体链-2 (Apt-2)序列为：
[0065] Apt-2 :5, -ΑΤΑ CTC CCC C AGGTGG TGT CTA GGA TTC GGC GTG-3，，（如 SEQ ID NO. 2所示）；
[0066] (注：Apt-2中斜体加粗序列是与Apt-1杂交的碱基）；
[0067] 发卡探针由发卡探针HI和发卡探针H2组成，其中，发卡探针HI的核苷酸序列为：
[0068] 5'-TGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TM CAC GCC GAA TCC TAG ACA TGG TAC TTG CAC-3'（如 SEQ ID NO. 3 所示）；
[0069] 发卡探针H2的核苷酸序列为：
[0070] δ^ΤΤΑ ACC CAC GCC GAA TCC TAG ACA GTG CAA GTA CCA TGT CTA GGA TTC GGC GTG-3'（如 SEQ ID NO. 4 所示）。
[0071] DNA粉末先经高速离心（8000rpm，6min)，然后用适当体积的超纯水溶解混勻，配 成浓度为100 μ Μ的储备液，最后分装成10 μ L的小体积置于-20°C保存备用。
[0072] 腺苷（Adenosine, ^ 99 % )购于 Sigma-Aldrich(上海，中国）。 灿11〇^-]^1:117]^68〇口〇印115^;[11]^)购于？1'〇111:丨61'。40(%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺，过硫酰 胺（APS)，四甲基乙二胺（TEMED)，溴化乙锭（EB)均购于上海生物工程有限公司（上海，中 国）。6X上样缓冲液和DNA marker购于大连宝生物有限公司（大连，中国）。SYBR Green I购于百泰克生物技术有限公司（北京，中国）。人血清和人尿样均取自于山东大学校医院， 肝癌病人尿样取自于山东省省立医院。
[0073] 试验中所有试剂均为分析纯，所用水均由Millipore Milli Q water (18. 25ΜΩ . cm)制备。10XTAE/Mg(0.4mol I^TrisJJmol Γ1 醋酸，2.0Xl(T2mol I^EDTAJNa， 0.125111011^(0130)0)21^.440)0
[0074] TTL 缓冲液：100mmol I^Tris-HCl，。· 1% Tween20, lmol L-1LiCl，ρΗ8· 0。
[0075] PBS 缓冲液：0· 15mol Γ1 的 NaCl，7. 6 X l(T3mol Γ1 的 Na2HP04, 2. 4 X l(T3mol Γ1 的 NaH2P04, pH = 7. 4。
[0076] Tris-HCl 杂交缓冲液：10mmol PTris-HCl，pH7. 4, 300mmol L_1NaCl, lmmol L-1MgCl2。
[0077] 链霉亲和素修饰的磁性纳米球（简称磁球，lmL包装，密度为1. 343g πι?Λ直径为 350nm, Bangs Laboratories, Carmel, IN, USA) 〇
[0078] lmL的链酶亲和素化的磁球按照每份100 μ L的体积进行分装，放在-4°C冰箱保存 备用。
[0079] (二）实验步骤
[0080] (1)链酶亲和素化修饰磁球的活化：为了防止磁球的聚集，磁球储备液中含有大 量的表面活性剂，在使用前，需要先将这些表面活性剂洗去，以活化磁球的功能。活化方式 为：
[0081] ①在离心管中加入200 μ L的TTL缓冲液和1 μ L链霉亲和素修饰的磁性纳米球， 经充分震荡洗涤后（震荡5min)，将离心管置于磁球分离架上静置7min，移除溶液部分（用 移液枪小心吸出溶液，弃去）；
[0082] ②重复上述①的操作5次，最后得到活化的链酶亲和素化修饰的磁性微球 (1 μ L)，待用。
[0083] (2)生物素化适体链-1 (Bio-Apt-Ι)的固定（示意简图如图1所示）：向上述活化 好的1 μ L活化的链酶亲和素化修饰的磁性微球中加入50 μ L的浓度为2. 0X 10_6mol Γ1 的Bio-Apt-1，充分震荡混匀后，放于37°C恒温箱中孵育2h ;反应完后，放于磁球分离架上， 静置7min，移除溶液部分（用移液枪小心吸出溶液，弃去）；然后用200 μ L的Tris-HCl杂 交缓冲液清洗两次，最后获得表面固定生物素化Apt-Ι的磁球。
[0084] (3)腺苷诱导的双适体的共区域化（示意简图如图2所示）：向上述步骤⑵制备 得到的表面固定生物素化Apt-Ι的磁球中加入40 μ L的浓度为1. 0Xl(T6mol Γ1的Apt-2 和10yL不同浓度的腺苷（浓度 5mol ?Λ5·0Χ1(Γ5πιο1 ?Λ?·0Χ1(Γ4πιο1 ?Λ?·2Χ1(Γ4πιο1 ΙΛ共7组），充分震荡混匀后， 放于37°C恒温箱中孵育2h ;反应完后，放于磁球分离架上，静置7min，移除溶液部分（用移 液枪小心吸出溶液，弃去）；然后用200 μ L的Tris-HCl杂交缓冲液清洗两次，最后获得腺 苷诱导共区域化的Apt-l/Apt-2复合物；
[0085] (4)共区域化触发的链式杂交反应（HCR反应）（示意简图如图3所示）：在上述腺 苷诱导共区域化的Apt-l/Apt-2复合物中加入发卡探针HI、H2的混合物（混合物中，发卡 探针H1和H2的浓度相同，均为3.0X10_ 6mol Γ1 ;)，总体积为50yL，充分震荡混匀后，放 于37°C恒温箱中孵育3h ;反应完后，放于磁球分离架上，静置7min，移除溶液部分（用移液 枪小心吸出溶液，弃去）；然后用200μ L的PBS缓冲液清洗两次（以除去未反应的发卡探 针），最后获得表面固定有长的DNA双链的磁球；
[0086] 发卡探针Η1和Η2在使用之前进行退火，目的是保证发卡的稳定性；退火的步骤 是：在90°C加热5min，然后缓慢冷却到室温；
[0087] (5)加入染料SYBR Green I和荧光检测（示意简图如图4所示）：用PBS缓冲液 将SYBRGreen I稀释成浓度为2.0Xl(T6m〇l Γ1，然后加入到上述得到的表面固定有长的 DNA双链的磁球中，室温静置lOmin，然后进行荧光检测，得荧光值；
[0088] 同时，设置两组对照，也加入染料SYBR Green I，进行荧光检测，一组对照为没有 添加腺苷的Bi〇-Apt-l+Apt-2(即步骤3中，只添加 Apt-2、不添加腺苷而得到的复合物，直 接加入染料进行突光检测），另一组对照为Bi〇-Apt-l+Apt-2+Adenosine(即步骤3中的腺 苷诱导共区域化的Apt-l/Apt-2复合物，直接加入染料进行荧光检测）；
[0089] 荧光光度计的基本设置为：激发波长为477nm，扫描范围为500?600nm，激发狭缝 宽度2. 5nm，发射狭缝宽度2. 5nm，PMT电压700V。
[0090] (三）结果与讨论
[0091] (1)腺苷诱导共区域化的适体传感器的工作原理
[0092] 基于腺苷诱导共区域化触发HCR的适体传感器工作原理如图5所示：首先，通过链 酶亲和素和生物素之间的特异性作用，将生物素化的适体链1 (Apt-ι)固定在磁球表面；然 后加入腺苷和适体链2 (Apt-2)，通过腺苷的"粘合"作用，使得Apt-Ι和Apt-2结合在一起， 从而使得Apt-Ι连接的粘性末端区域和Apt-2连接的链置换区域发生共区域化，形成完整 的引物链，可以进一步触发发卡结构HI和H2发生HCR反应；反应完后，加入内插染料SYBR GreenI，产生突光信号。
[0093] (2)荧光实验验证
[0094] 图 6 的实验条件：CAdenQSine = 1. OX 10_4m〇l ΙΛ(：Αρη = 2. OX 10_6m〇l L_l，CApt_2 = 1. 0 X l(T6mol ΙΛ CH1 = 3. 0 X l(T6mol ΙΛ CH2 = 3. 0 X l(T6mol ΙΛ CSYBK Green ! = 2. 0 X 1(Γ 6mol L-1，反应时间HCR2h，反应温度37°C。
[0095] 图6为体系的突光光谱图，从图中可以看出，体系中没有腺苷时，Bio-Apt-l+Apt-2 的荧光强度很低；加入腺苷后，Bio-Apt-l+Apt-2的荧光强度有所增加，说明腺苷可以诱导 Apt-Ι和Apt-2发生共区域化，与电泳结果是一致的；在腺苷、Bio-Apt-Ι和Apt-2体系中加 入H1和H2后，可以检测到很强的荧光信号，说明Apt-Ι和Apt-2的共区域化可以触发HCR 反应，生成较长的DNA双链。该实验现象说明腺苷可以成功的诱导双适体发生共区域化，从 而进一步触发HCR反应。
[0096] (3)系统条件优化
[0097] 为了获得较好的传感性能，对可能造成影响的实验条件进行了逐个优化，主要包 括Apt-Ι的浓度、Apt-2的浓度、发卡H1和H2的浓度、HCR的反应时间和染料的浓度。最终 选择的实验条件为：Apt-Ι的浓度为2. OX 10_6mol ΙΛ Apt-2的浓度为1. OX 10_6mol ΙΛ 发卡 Η1、Η2 的浓度为 3.0Xl(T6mol L'SYBRGreen I 的浓度为 2.0Xl(T6mol L'HCR 的 反应时间为2h。
[0098] (4)腺苷的分析检测
[0099] 在最优实验条件（上述确定的）下，该体系对腺苷浓度的响应情况如图7所示， 随着腺苷浓度的增加，体系的净荧光信号逐渐增大。所建立的适体传感系统的线性范围为 1.0Xl(T6mol Γ1 ?1.2Xl(T4mol Γ1，线性回归方程为八？= 14.55+1769.72父104(：(如图 8所示），相关系数1'为0.998，方法对腺苷的检测限为2.0\10^ 111〇1171。证明了本发明所 构建的无酶、免标记和双重信号扩增的适体传感器可以成功用于腺苷的灵敏检测。
[0100] 图 7 的实验条件：Caph = 2. OX l(T6mol I71，CApt_2 = 1. OX l(T6mol I71，CH1 = 3. OX l(T6mol ΙΛ CH2 = 3. OX l(T6mol ΙΛ CSYBK Green ! = 2. OX l(T6mol ΙΛ HCR 反应时间 2h，反应温度37°C。
[0101] 图 8 的实验条件：(3Αρη = 2. OX l(T6mol I71，CApt_2 = 1. OX l(T6mol I71，CH1 = 3. OX l(T6mol ΙΛ CH2 = 3. OX l(T6mol ΙΛ CSYBK Green ! = 2. OX l(T6mol ΙΛ HCR 反应时间 211，温度37°〇。
[0102] (5)建立适体传感器的方法学验证
[0103] 为了验证基于发卡结构自组装的适体传感方法的精密度，本发明进行了日内实验 和日间实验的相对标准偏差（RSD)的考察（N = 3)。最优实验条件下，选择1. OX l(T5m〇l L'S.OXlO - ^iol L-1和1.0X10_4mol L-1三个浓度的三个样本进行实验。实验结果表明三 个样本的RSD分别为1. 7%、1. 2%和0. 7%，如表1所示。同样在上述三个浓度下，连续三 次实验之间的RSD分别为3. 9%、2. 9%和1. 9% (表2所示），说明该适体传感方法具有良 好的精密度。
[0104] 表1日内精密度考察
[0105]
【权利要求】
1. 一种基于共区域化触发链式杂交反应的适体传感器检测腺苷，其特征在于：由生物 素化的适体链-1、适体链-2、发卡探针和链霉亲和素修饰的磁性纳米球组成，其中，所述生 物素化的适体链-1为： 5，-biotin-TTTTTTTTTTTT GTG CAA GTA CCA TT TAG ACC ACC TGG GGG AGT AT-3，，核 苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示； 所述适体链-2的序列为： Apt-2 :5，-ATA CTC CCC C AGGTGG TGT CTA GGA TTC GGC GTG-3，，如 SEQ ID NO. 2 所 示； 所述发卡探针由发卡探针HI和发卡探针H2组成，其中，发卡探针HI的核苷酸序列为： 5' -TGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TAA CAC GCC GAA TCC TAG ACA TGG TAC TTG CAC-3'，如 SEQ ID NO. 3 所示； 发卡探针H2的核苷酸序列为： 5' -TTA ACC CAC GCC GAA TCC TAG ACA GTG CAA GTA CCA TGT CTA GGA TTC GGC GTG-3'，如 SEQ ID NO. 4 所示。
2. 根据权利要求1所述的基于共区域化触发链式杂交反应的适体传感器，其特征在 于：所述链霉亲和素修饰的磁性纳米球，密度为1. 343g πι?Λ直径为350nm。
3. 权利要求1所述的基于共区域化触发链式杂交反应的适体传感器在检测腺苷中的 应用。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于：应用方式如下： (1) 链酶亲和素化修饰磁球的活化： ① 在离心管中加入200 μ L的TTL缓冲液和1 μ L链霉亲和素修饰的磁性纳米球，经充 分震荡洗涤后，将离心管置于磁球分离架上静置7min，移除溶液部分； ② 重复上述①的操作5次，最后得到1 μ L活化的链酶亲和素化修饰的磁性微球，待 用； (2) 生物素化适体链-1的固定：向上述活化好的lyL活化的链酶亲和素化修饰的 磁性微球中加入50 μ L的浓度为2. OX 10_6mol Γ1的Bio-Apt-Ι，充分震荡混匀后，放于 37°C恒温箱中孵育2h ;反应完后，放于磁球分离架上，静置7min，移除溶液部分；然后用 Tris-HCl杂交缓冲液清洗两次，最后获得表面固定生物素化Apt-Ι的磁球； (3) 腺苷诱导的双适体的共区域化：向上述步骤（2)制备得到的表面固定生物素化 Apt-Ι的磁球中加入40 μ L的浓度为1. OX 10_6mol Γ1的Apt-2和10 μ L的含有腺苷的待 检测物，充分震荡混匀后，放于37°C恒温箱中孵育2h ;反应完后，放于磁球分离架上，静置 7min，移除溶液部分；然后用Tris-HCl杂交缓冲液清洗两次，最后获得腺苷诱导共区域化 的Apt-l/Apt-2复合物； (4) 共区域化触发的链式杂交反应：在上述腺苷诱导共区域化的Apt-l/Apt-2复合物 中加入50 μ L的发卡探针HI、H2的混合物。充分震荡混匀后，放于37°C恒温箱中孵育3h ; 反应完后，放于磁球分离架上，静置7min，移除溶液部分；然后用PBS缓冲液清洗两次，最后 获得表面固定有长的DNA双链的磁球； (5) 加入染料SYBR Green I和荧光检测：用PBS缓冲液将SYBR Green I稀释成浓度 为2. 0X10_6mol Γ1，然后加入到上述得到的表面固定有长的DNA双链的磁球中，室温静置 lOmin,然后进行荧光检测，得荧光值； (6)计算：根据上述所测得的荧光值计算含有腺苷的待检测物中腺苷的浓度。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述TTL缓冲液的组成为：由Tris-HCl、 Tween20、LiCl 和水组成，其中，各组分的浓度为：100mmol PTris-HCl ;0· 1% Tween20 ; lmol L_1LiCl ；pH8. 0 ； 所述Tris-HCl杂交缓冲液的组成为：由1^8-!1(：1、似(：1、1%(：12和水组成，其中，各组分 的浓度为：10mmol L iTris-HCl，ρΗ7· 4 ;300mmol L WaCl ；1mmo1 L ^gCl^。
6. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述含有腺苷的待检测物为人的尿液。
7. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述发卡探针HI、H2的混合物中，发卡探 针H1和H2的浓度相同，均为3. 0Xl(T6mol L'
8. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述发卡探针HI和H2在使用之前进行 退火，退火的步骤是：在90°C加热5min，然后冷却到室温。
9. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述步骤（5)中，进行荧光检测时，荧光 光度计的基本设置为：激发波长为477nm，扫描范围为500?600nm，激发狭缝宽度2. 5nm， 发射狭缝宽度2. 5nm，PMT电压700V。
10. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述步骤（6)中，利用下述线性方程计 算得到腺苷的浓度： Δ F = 14. 55+1769 . 72 X 104C, r = 0. 998 ； 其中，Λ F表示荧光净信号值，C表示腺苷的浓度，单位为mol Γ1 ;该线性方程的线性范 围是 1. OX l(T6mol Γ1 ?1. 2Χ l(T4mol Γ1 之间。
【文档编号】C12Q1/68GK104152552SQ201410344669
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月18日 优先权日:2014年7月18日
【发明者】王磊, 姜玮, 冯春景, 富波 申请人:山东大学