一种球孢白僵菌的液体固体培养方法
【专利摘要】本发明涉及一种球孢白僵菌的液体固体培养方法，包括以下步骤：步骤1、液体菌丝阶段：采用液体深层发酵培养；步骤2、固体菌丝培养阶段：步骤1待获得大量菌丝体后，转入固体发酵罐进行培养，固体发酵罐中放有固体培养料；步骤3、开放产孢阶段：待步骤2中固体发酵罐长满菌丝体后，将固体培养料扣出，采用开放式发酵最终得粗粉剂。本发明由于培养白僵菌的固体培养料配方简单，原料主要为农副产品，价廉，成本低，制作简单。同时又促进了农业废弃物得以有效利用。
【专利说明】一种球孢白僵菌的液体固体培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物发酵方法领域，尤其是涉及一种虫生真菌球孢白僵菌Bcauveria Bassiana(以下简称白僵菌）的固体培养方法。
【背景技术】
[0002] 白僵菌是一类对农林害虫寄主范围广且致病性强的昆虫病原真菌，在农林害虫生 物防治研究与应用中占有非常重要的地位。由于白僵菌具有对环境和脊椎动物无害，易培 养、杀虫谱广、致病力强等特点，是目前应用最非常广泛的生物农药，在多种农林害虫的生 物防治中都取得了非常明显的成效。
[0003] 目前，国内外白僵菌生产主要采用液-固双相发酵工艺，即首先经过液体发酵得 到白僵菌芽生孢子或菌丝体，再将其接种于固体料上继续培养，以获得分生孢子。目前我国 固态发酵阶段大多数生产厂家采用浅盘、纱窗等开放式生产模式，生产过程存在着对温、湿 度要求高，发酵过程周期长，易感染染菌，产品质量不稳定等缺点，严重影响了白僵菌生物 农药的生产及防治效果。
【发明内容】
[0004] 本发明设计了一种球孢白僵菌的液体固体培养方法，其解决的技术问题是现有 液-固双相发酵工艺存在着对温度、湿度要求高，发酵过程周期长，易感染染菌，产品质量 不稳定等技术缺陷。
[0005] 为了解决上述存在的技术问题，本发明采用了以下方案：
[0006] -种球孢白僵菌的液体固体培养方法，包括以下步骤：步骤1、液体菌丝阶段：采 用液体深层发酵培养；步骤2、固体菌丝培养阶段：步骤1待获得大量菌丝体后，转入固体发 酵罐进行培养，固体发酵罐中放有固体培养料；步骤3、开放产孢阶段：待步骤2中固体发酵 罐长满菌丝体后，将固体培养料扣出，采用开放式发酵最终得粗粉剂。
[0007] 进一步，所述步骤2固体菌丝培养阶段的培养周期为1-2天，培养温度设定为 24±1°C。
[0008] 进一步，所述步骤3中开放产孢阶段的培养周期为4-5天，培养温度设定为 25±2°C。
[0009] 进一步，所述固体培养料的配方：以重量百分比为单位，其中甘蔗糖液1-5%，稻 糠4-8 %，豆柏2-4%，麦麸26-30 %，余量为水。
[0010] 进一步，所述固体发酵罐在培养前需进行消毒。
[0011] 进一步，开放产孢阶段所用的容器为底部是布满20目小孔的不锈钢盘。
[0012] 该球孢白僵菌的液体固体培养方法与传统的球孢白僵菌的培养方法，具有以下有 益效果：
[0013] (1)本发明由于培养白僵菌的固体培养料配方简单，原料主要为农副产品，价廉， 成本低，制作简单。同时又促进了农业废弃物得以有效利用。
[0014] (2)本发明的分阶段固体培养白僵菌的方法，是针对白僵菌生长的特点而设计， 在菌丝生长阶段，需要较高湿度，使用密闭的培养容器，可始终保证培养料和培养环境的湿 度较高，从而满足菌丝生长需要，这样克服了开放式培养中湿度无法控制的缺点。同时，因 白僵菌生产中，杂菌污染多出现在早期菌丝生长的阶段，密闭式培养，可大大降低污染的概 率，且即使出现污染的情况，亦不会扩散蔓延。白僵菌产孢阶段，对环境湿度要求没有菌丝 生长阶段高，甚至过高的湿度，会使得孢子二次萌发，从而影响产孢的进程。故产孢阶段，采 用开放式培养；且因培养料已经布满白僵菌菌丝，不会出现杂菌污染情况。所以，整个固体 培养过程无需调控环境湿度。
[0015] (3)本发明的白僵菌固体培养方法，工艺简单，发酵周期可缩短到6-8d，极大地提 高了生产效率，同时对环境湿度要求不高，显著减少了杂菌污染概率，生产成本低廉，易控 制，成功率高，产品质量稳定。可应用于实验室生产及作为众多中小白僵菌生产厂家技术升 级的优选方案。具有显著的社会和经济效益。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合实施例，对本发明做进一步说明：
[0017] 本发明的白僵菌的分阶段培养方法：
[0018] 1液体菌种的培养，包括如下步骤：
[0019] 1. 1菌种：白僵菌菌种，以斜面低温保存。
[0020] 1. 2斜面菌种：预先将白僵菌菌种用试管斜面在25土1°C条件下传代培养、活化， 当斜面表面长满孢子时即可使用。斜面培养基为微生物培养中所通用的萨氏培养基。
[0021] 1. 3液体培养基：使用培养基。用500ml三角瓶中装入200ml液体萨氏培养基， 121°C下蒸汽高温灭菌30min，冷却后备用。
[0022] 1.4接种：在无菌操作台中，从菌种斜面上挑取少量孢子及菌苔接入上述液体培 养基中。
[0023] 1. 5摇床培养：25土 1°C恒温振荡培养箱中振荡培养72h，待长成白色粘稠菌丝体 后即可接入液体液体种子发酵罐培养。
[0024] 1. 6液体种子罐培养进行白僵菌菌丝体培养。待液体种子罐温度达到25?27°C 时，即可接种，接种量7%?15%。
[0025] 2固体培养，包括如下步骤：
[0026] 2. 1固体培养料配方及制备：
[0027] 白僵菌固体培养料配方：以重量份为单位，其中甘蔗糖液1-5%，稻糠4-8%，豆柏 2-4%，麦麸26-30 %，余量为水。
[0028] 制备方法：将麦麸和甘蔗渣（或谷壳）分别称量，配方中甘蔗糖液1-3%，稻糠 2-6 %，豆柏1-2%，麦麸24-30 %，装入固体发酵罐中，搅拌均匀，121 °C下蒸汽高温灭菌 60min，冷却后备用。
[0029] 2. 2接种：按10-20%的接种量，将液体菌转入已灭菌的装有固体培养料的固体发 酵罐中，搅拌均匀，随即转入培养实培养，24±1°C培养2d后，待菌丝长满后白色菌丝即可。
[0030] 3开放产孢阶段：倒出长满白色菌丝固体培养料，将其反扣于培养室内放有不锈 钢盘的培养架上，轻拍使长满白色菌丝的固体培养料落下，铺在培养架上不锈钢盘内，然后 保持培养室内温度在25±2°C，继续培养3-4天，待固体料内外长满白色（乳黄色）孢子后， 将固体培养物置于阴凉通风处自然晾干即成粗粉剂（或在30_35°C烘干箱中烘36h，含水率 ^ 10% ) 〇
[0031] 以下为本发明的几个具体实例，进一步描述本发明，但是本发明不仅限于此。
[0032] 实施例一：
[0033] 1液体菌种的培养，包括如下步骤：
[0034] 1. 1菌种：球抱白僵菌Bcauveria Bassiana菌株,为公知菌株。
[0035] 1. 2斜面菌种：预先将白僵菌菌种用试管斜面培养基在25°C条件下传代培养、活 化，当斜面表面长满孢子时即可使用。斜面培养基为萨氏培养基。
[0036] 1. 3液体培养基：配制萨氏培养基1L，用250ml三角瓶中装入，每个装100ml培养 基，121°C下蒸汽高温灭菌30min，冷却后备用。
[0037] 1.4接种：于无菌操作台中，从菌种斜面上挑取少量孢子及菌苔接入上述液体培 养基中。
[0038] 1. 5摇床培养：25土 1°C恒温振荡培养箱中振荡培养72h，待长成白色粘稠菌丝体 即可接入固体培养料，进行白僵菌固体培养。
[0039] 2固体培养，包括如下步骤：
[0040] 2. 1固体培养料配方及制备：
[0041] 白僵菌固体培养料配方：麦麸20kg，甘鹿糖液2kg，稻糠5kg，水15L。
[0042] 制配方法：将麦麸和甘蔗糖液分别称量，加入水后搅拌均匀，50L固体发酵罐中， 121°C下蒸汽高压灭菌60min，冷却后备用。
[0043] 2. 2接种：按15%的液体菌丝接种量，将液体菌种转入固体发酵罐培养料中，搅拌 均匀，25 ± 2 °C培养2天后待固体培养料长满白色菌丝即可。
[0044] 2. 4产孢阶段：将长满白色菌丝固体培养料培养架上的不锈钢盘上，保持温度在 26±2°C，继续培养4天，待固体料内外长满白色（乳黄色）孢子即可，将固体培养物置于阴 凉通风处晾干即成粗粉剂（或在32±3°C烘干箱中烘40h，含水率< 10% )
[0045] 3培养结果：发酵周期为6d，晾干后随机称取粗粉剂5g，用0. 3%。吐温-80溶液进 行稀释，血球计数板计数，结果培养物含孢量为2. 8X1010孢子/克粗粉剂。粗粉剂制作成 粉炮用于农林业害虫防治。
[0046] 实施例二：
[0047] 11液体菌种的培养，包括如下步骤：
[0048] 1. 1菌种：球抱白僵菌Bcauveria Bassiana菌株，为公知菌株。
[0049] 1. 2斜面菌种：同实施例一。
[0050] 1. 3液体培养基：同实施例一，共配制10L。
[0051] 1.4接种：同实施例一。
[0052] 1. 5摇床培养：同实施例一。不同的是摇床培养时间为60h。
[0053] 2固体培养，包括如下步骤：
[0054] 2. 1固体培养料配方及制备：
[0055] 白僵菌固体培养料配方：麦麸50kg，谷壳105kg，甘鹿糖液5kg，水30L。
[0056] 制配方法：同实施例一。
【权利要求】
1. 一种球孢白僵菌的液体固体培养方法，包括以下步骤：步骤1、液体菌丝阶段：采用 液体深层发酵培养；步骤2、固体菌丝培养阶段：步骤1待获得大量菌丝体后，转入固体发酵 罐进行培养，固体发酵罐中放有固体培养料；步骤3、开放产孢阶段：待步骤2中固体发酵罐 长满菌丝体后，将固体培养料扣出，采用开放式发酵最终得粗粉剂。
2. 根据权利要求1所述球孢白僵菌的液体固体培养方法，其特征在于：所述步骤2固 体菌丝培养阶段的培养周期为l-2d，培养温度设定为24±1°C。
3. 根据权利要求1所述球孢白僵菌的液体固体培养方法，其特征在于：所述步骤3中 开放产孢阶段的培养周期为4-5天，培养温度设定为25±2°C。
4. 根据权利要求1所述球孢白僵菌的液体固体培养方法，其特征在于：所述固体培 养料的配方：以重量百分比为单位，其中甘蔗糖液1-5%，稻糠 4-8%，豆柏2-4%，麦麸 26-30%，余量为水。
5. 根据权利要求1-4中任何一项所述球孢白僵菌的液体固体培养方法，其特征在于： 所述固体发酵罐在培养前需进行消毒。
6. 根据权利要求1-5中任何一项所述球孢白僵菌的液体固体培养方法，其特征在于： 开放产孢阶段所用的容器为底部是布满20目小孔的不锈钢盘。
【文档编号】C12R1/645GK104087520SQ201410344638
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月21日 优先权日:2014年7月21日
【发明者】关玉芳 申请人:关玉芳