一种克隆番鸭小鹅瘟病毒基因组编码区全序列的方法
【专利摘要】本发明公开了一种克隆番鸭小鹅瘟病毒基因组编码区全序列的方法，通过从含有番鸭小鹅瘟病毒番鸭胚尿囊液中提取病毒基因组DNA，通过设计的特定引物，以病毒基因组DNA为模板扩增包含编码区全序列的基因片段，将目的基因片段与载体连接，挑取阳性菌落进行测序直接获取番鸭小鹅瘟病毒基因组编码区段全序列。与传统方法相比，本发明的方法具有扩增的目的片段长度长，实验工作量小、成本低、效率高的特点。
【专利说明】-种克隆番鸭小鹅瘟病毒基因组编码区全序列的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种克隆番鸭小鹅癌病毒（Muscovy duck origin goose parvovirus, MDGPV)基因组编码区全序列的方法。
【背景技术】
[0002] 小鹅癌（Gosling Plague, GP)又称鹅细小病毒（Goose Parvovirus, GPV)感染或 Derzsy' s病，是由GPV引起的一种主要侵害小鹅和雏番鸭的高度接触性传染病，临床上以 渗出性肠炎、小肠黏膜表层坏死脱落、肠道栓塞为特征性病变。临床上番鸭小鹅瘟与番鸭细 小病毒（Muscovy duck Parvovirus，MDPV)病(俗称"三周病"）常在同一地区同一番鸭群中 流行，雏番鸭对GPV和MDPV均易感，而小鹅仅对GPV易感。番鸭小鹅瘟是1997年以来引 起福建莆田等地番鸭饲养区内雏番鸭发生不同程度腹泻、部分病鸭粘膜脱落形成栓塞为主 要特征的疫病，经病原分离和鉴定确认该病病原为一种新基因型番鸭鹅细小病毒（Muscovy duck origin goose parvovirus, MDGPV),〇
[0003] 水禽细小病毒（GPV、MDPV与MDGPV)在分类学上均为细小病毒科细小病毒属成员， 是无囊膜、线性、单链DNA病毒，基因组长约5 kb，两端由相同的回文ITR序列折叠形成发卡 结构，中间为编码区含有两个主要开放阅读框架（Open Read Frame，0RF)，两个0RF之间间 隔18 bp。左侧ORF(LORF)长1884 bp，编码2种非结构蛋白（R印），即调节蛋白NS1、NS2;右 侦^ORF(RORF)长2199 bp，编码3种结构蛋白（VP)，即￥?1、￥?2、￥?3。各编码区内基因相互 重叠，非结构基因和结构基因分别终止于同一个终止密码子，右侧ITR前有一个多聚Poly (A)，在报道的水禽细小病毒全基因中，所有的NS和VP基因的长度均相同。MDGPV-PT株为 新基因型番鸭小鹅瘟病毒福建代表株，（1) NS蛋白编码区：MDGPV-PT与GPV-B，MDPV-FM核 苷酸同源性分别为82. 9%，99. 4% ; (2)VP蛋白主要免疫功能区：MDGPV-PT与GPV-B，MDPV-FM 核苷酸同源性分别为92. 1%，85. 9%。
[0004] 目前对于如何有效地得到MDGPV基因组编码区全序列本领域研究甚少，做为传统 方法的分段PCR克隆法在MDGPV基因组编码区扩增上存在诸多缺陷，必须将目的基因分成 若干段分别克隆，分成几段就需做几次亚克隆，然后做亚克隆测序拼接，造成成本高，工作 量大，且有序列喊基错读的可能。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的缺陷，本发明公开了一种克隆方法，能够简单、快捷的获取MDGPV 基因组完整编码区序列，本发明公开的方法具有目的片段长度明确，实验工作量小，实验成 本小的特点。
[0006] 本发明采用以下技术方案： 一种克隆MDGPV基因组编码区全序列的方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 提取MDGPV基因组DNA ; (2) 以步骤（1)的DNA作为模板，用引物P1和P2对MDGPV进行PCR扩增，得到相应的 编码区全长基因； (3) 回收和纯化上述PCR产物，获得目的基因片段； (4) 将上述PCR获得的目的基因片段与pcDNA3. lD/V5-His-T0P0载体连接加入到JM109 感受态细胞中进行转化培养，筛选其中的阳性菌落进行培养，以菌液为模板进行PCR即得 MDGPV编码区基因全序列。
[0007] 在本发明中，为了保持病毒基因组DNA的完整性和纯度，步骤（1)采用血液/细胞 /组织基因组DNA提取试剂盒提取并纯化病毒DNA。市场上已有多种此类试剂盒在销售，具 体的操作方法按照其说明书即可。
[0008] 在本发明中，PCR引物需满足如下要求： 1) 设计一对简并引物，上游引物在起始密码子的上游区域设计，下游引物在终止密码 子的下游区域设计，设计的引物以便能一个PCR反应对MDGPV基因组DNA编码区全序列进 行阳性扩增； 2) 设计PCR引物时按pcDNA3. lD/V5-His-T0P0载体的要求，在上游引物5'端加上CACC 四个碱基。
[0009] 根据以上要求，所述的步骤（2)的扩增引物P1和P2的序列为： 上游引物 P1 :5' -CACCCGCATGCGCCCGATCTGCC-3' ； 下游引物 P2 :5' -GCATGCGCCCGATCAGCCTTGACAACCG-3' ； 其中，所述的步骤（2) PCR扩增产物经胶回收大小为4693 bp。
[0010] 在本发明中，按PCDNA3. lD/V5-His-T0P0载体的要求，步骤（2)采用具有3' 一 5' 核酸外切酶活性的高保真酶做为针对MDGPV编码区全基因的DNA扩增酶。市场上已有多种 此类3' 一 5'核酸外切酶活性的高保真PCR酶在销售，具体的操作方法按照其说明书即可。
[0011] 在本发明中，为了提高回收和纯化速度，步骤（3 )采用纯化回收试剂盒回收PCR产 物。市场上已有多种此类试剂盒在销售，具体的操作方法按照其说明书即可。
[0012] 在本发明中，为了提高长片段外源基因的连接效率，步骤（4)采用的pcDNA3. 1D/ V5-His-T0P0载体可接纳长片段的DNA，在该载体上插入长片段的外源DNA时，不会破坏载 体的自我复制性质。
[0013] 在本发明中，目的基因片段与pcDNA3. lD/V5-His-T0P0的连接参照pcDNA3. 1D/ V5-His-T0P0载体试剂盒使用说明书操作即可，市场上有多家供应商供应成熟稳定的 pcDNA3. lD/V5-His-T0P0 载体试剂盒。
[0014] 在本发明中，JM109感受态细胞既可以从试剂公司购买，也可以采用本领域常见方 法，例如氯化钙法制备。
[0015] 在本发明中，还包括步骤（4)所得MDGPV编码区基因全序列进行同源性比对的步 骤，用来验证所得序列的准确性。
[0016] 本发明的有益效果：整个克隆过程工作量小，效率高，准确率高，可以简单、快捷的 获取MDGPV基因组的编码区全序列。
[0017]
【具体实施方式】
[0018] 下面实施例对本发明做进一步的描述。
[0019] 实施例1 步骤1、病毒分尚株： 新基因型GPV福建代表株MDGPV-PT由福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离鉴定和 保存。
[0020] 步骤2、病毒DNA提取： MDGPV-PT株基因组DNA由AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒提取，具体操作步骤 为： a.收集200 μ L MDGPV病毒番鸭胚尿囊液，转入1.5 mL离心管中。
[0021] b.加200 μ L Buffer V-L，漩涡振荡混合均匀，静置5 min。
[0022] c.力口 75 μ L Buffer V-N，漩润振荡混合均勻，12, 000Xg 离心 5 min。
[0023] d.将上清转移到新的2 mL离心管(试剂盒内提供冲，加300 μ L异丙醇（1%冰 乙酸)，上下倒置6-8次，混合均匀。
[0024] e.将制备管置于2 mL离心管(试剂盒内提供)中，取步骤d中的混合液移入制备 管中，6,000 Xg 离心 1 min。
[0025] f.弃滤液，将制备管置回到2 mL离心管中，加500 μ L Buffer W1A，室温静置1 min。12, 000Xg 离心 1 min。
[0026] g.弃滤液，将制备管置回到2 mL离心管中，加800 μ L Buffer W2,12, 000Xg 离心1 min。
[0027] h.将制备管置回到2 mL离心管中，12, OOOXg离心1 min。
[0028] i.将制备管置于洁净的1. 5 mL离心管(试剂盒内提供）中，在制备管膜中央加 40-60 yL Buffer TE(nuclease-free)，室温静置 1 min。12, OOOXg 离心 1 min 洗脱病 毒 DNA。
[0029] 步骤3、引物设计及PCR反应： 根据已发表的鹅细小病毒B株全基因序列（登录号为U25749. 1)、番鸭细小病毒FM株 全基因序列（登录号为NC_006147. 2)与番鸭小鹅瘟细小病毒PT株全基因序列（登录号为 JF926695. 1)设计一对简并引物，上游引物在起始密码子的上游区域设计，下游引物在终止 密码子的下游区域设计，设计的引物为： 上游引物 P1 :5' -CACCCGCATGCGCCCGATCTGCC-3' ； 下游引物 P2 :5' -GCATGCGCCCGATCAGCCTTGACAACCG-3' ； 用MDGPV基因组DNA为模板进行高保真PCR操作扩增MDGPV基因组编码区全长基因。 PCR反应体系为50 yL体系（10 yL的5XPrimeSTARGXLBuffer，上下游引物各1 yL，2 uL 的病毒 DNA，4 μ? 的 dNTP Mixture，2 μ? 的 PrimeSTAR GXL DNA Polymerase，32 μ? 的 ddH20)，反应条件为 95°C预变性 5min ;35 个循环（94°C，30s ;59°C，40s ;72°C，2min)，最 后 72°C 10min。
[0030] 反应结束后将约有4693 bp的PCR产物收集到一个EP管中并切胶回收，将回收 的基因片段克隆到质粒载体中，然后挑取阳性菌进行PCR反应，产物送测序公司测序。
[0031] 步骤4、PCR产物的回收和纯化： PCR产物用OMEGA胶回收试剂盒纯化回收，具体操作步骤为： a.电泳足够时间后，在紫外灯下小心地把所需的DNA片段切下来，并尽量去除多余的 凝胶； b. 称取空离心管的重量，切下带目的片段的凝胶装在1. 5ml离心管中并称其重量，求 出凝胶块的重量，近似地确定其体积。加入等倍凝胶体积的Binding Buffer,把混合物置于 55°C?65°C水浴中温浴7min至凝胶完全融化，其间每隔2-3分钟混匀一次； c. 转移700 μ L的DNA-琼脂糖溶液到一个HiBind DNA柱子，并把柱子装在一个干净 的2mL收集管内，室温下10, 000 X g离心lmin，弃去液体； d. 将柱子重新套回收集管中，加300 μ L Binding Buffer至HiBind DNA柱子中，室 温下l〇,〇〇〇Xg离心lmin，去弃滤出液； e. 将柱子重新套回收集管中，加入700 μ L SPW Wash buffer至HiBind DNA柱子中， 室温下10, OOOXg离心lmin，去弃滤出液； f. 将柱子重新套回收集管中，重复加入700 μ L SPW Wash buffer至HiBind DNA柱 子中，室温下10, 〇〇〇X g离心lmin，弃去滤出液，将空柱子重新套回收集管中，10, 000X g离 心lmin以甩干柱基质残余的液体； g. 把柱子装在一个干净的1.5 mL离心管上，加入3(Γ50 μ L洗脱液或灭菌水上柱子 膜上，10, 〇〇〇 X g离心lmin，离心管中的溶液就是纯化的DNA产物，保存于-20°C。
[0032] 步骤5、克隆： 5. 1目的片段与载体连接：将回收、检测后的目的片段与pcDNA3. lD/V5-His-T0P0载 体连接，操作连接体系(参考Life的pcDNA3. lD/V5-His-T0P0载体试剂盒使用说明书）为：
【权利要求】
1. 一种克隆番鸭小鹅瘟病毒基因组编码区全序列的方法，其特征在于包括下述步 骤： 1) 从含有MDGPV番鸭胚尿囊液中提取病毒基因组DNA ; 2) 以步骤1)的DNA作为模板，采用下述引物进行PCR: 上游引物 P1 :5' -CACCCGCATGCGCCCGATCTGCC-3' ； 下游引物 P2 :5' -GCATGCGCCCGATCAGCCTTGACAACCG-3' ； 3) 回收和纯化上述PCR产物，获得目的基因片段； 4) 将目的基因片段与pcDNA3. lD/V5-His-T0P0 vector载体连接加入到JM109感受态 细胞中进行转化培养，筛选其中的阳性菌落进行培养，以菌液为模板进行PCR即得MDGPV 基因组编码区全序列。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)从含有MDGPV番鸭胚尿囊液中提 取病毒基因组DNA。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试 剂盒提取并纯化病毒DNA。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)采用高保真PCR。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3)采用纯化回收试剂盒回收PCR 产物。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于还包括将步骤4)所得MDGPV-PT株基因 组编码区全序列与其它水禽细小病毒分离株基因组编码区全序列进行同源性比对验证的 步骤。
【文档编号】C12N15/70GK104232672SQ201410416788
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年8月22日 优先权日:2014年8月22日
【发明者】王劭, 陈少莺, 程晓霞, 林锋强, 陈仕龙, 王锦祥 申请人:福建省农业科学院畜牧兽医研究所