梨己糖激酶基因PbHXK1及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了梨己糖激酶基因PbHXK1及其应用。该基因的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO.1所示，其对应的氨基酸序列如序列表SEQ?ID?NO.2所示。将本发明所述的基因PbHXK1导入到番茄进行功能验证，以野生型番茄植株为对照，获得的转基因番茄植株的PbHXK1基因表达量和己糖激酶活性明显升高，而植株生长受到明显的抑制、可溶性糖含量显著降低，表明本发明所克隆的PbHXK1基因是编码己糖激酶的功能结构基因，具有磷酸化己糖的功能，在果实的糖积累过程中起着负调控的作用，同时还参与调控植株的生长发育。
【专利说明】梨己糖激酶基因PbHXKI及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程领域。具体涉及梨己糖激酶基因PbHXKl及其应用。
【背景技术】
[0002]梨是世界上主栽的果树树种之一。梨果实的品质决定了商品价值，而果实可溶性糖是构成果实品质的一个重要经济性状，糖代谢调控可直接影响糖的含量及组成。果糖的甜度是葡萄糖的2倍，是蔗糖的1.8倍，己糖的磷酸化作用与蔗糖、己糖含量密切相关，因而，己糖代谢是糖代谢的一个重要组成部分。因此，筛选梨果实己糖代谢过程中的关键基因资源，有助于了解植物己糖激酶参与的糖代谢分子生理机制及糖信号转导耦合激素信号转导调控植株生长发育的过程，为利用基因工程的手段改善果实品质的研究提供新的基因资源。
[0003]蔗糖可以转化为贮藏物质，也可以在蔗糖合酶(Sucrose Synthase)或转化酶(Invertase)的作用下水解为果糖和葡萄糖，果糖和葡萄糖经己糖激酶磷酸化，生成果糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸，可作为中间代谢产物参与糖酵解途径、磷酸戊糖途径以及淀粉的合成，为生命活动提供能量和中间代谢产物，也可作为糖信号受体，参与调控植物的生长发育。Dai等(1999)在番茄中过量表达拟南芥AtHXKl基因，转AtHXKl基因番茄植株生长受到抑制的程度与AtHXKl基因的表达水平及AtHXKl的催化活性密切相关，即与AtffiCKl基因的拷贝数有关。嫁接实验表明，当AtHXKl基因在光合组织中表达时，植株的生长受到抑制。AtHXKl催化活性的增加伴随着叶片叶绿素含量减少、光合速率下降以及光系统II反应中心的电子传递效率减低。此外，转基因植株的果实质量、幼果中淀粉含量和成熟果实可溶性糖含量也低于对照。Veramendi等(1999)在马铃薯中分别正义和反义表达马铃薯StHKl基因，结果发现正义表达StHKl基因提高了转基因马铃薯植株叶片和块茎中己糖激酶的催化活性，反义表达抑制了转基因马铃薯植株叶片和块茎中己糖激酶的磷酸化作用，增加了转基因马铃薯植株叶片的淀粉含量，而正义和反义表达转基因马铃薯植株块茎的产量、淀粉含量、糖含量以及代谢水平无显著差异。而Jang等(1997)在拟南芥中过量表达AtHXKl发现，转基因植株中光合相关基因的表达减少、下胚轴伸长被抑制、子叶变黄。分子遗传学、细胞学及生化分析表明拟南芥AtHXKl介导的葡萄糖信号转导与乙稀、脱落酸等多种激素的信号转导密切相关(Cho et al, 2010 ；Karve et al,2012)。Sarowar 等(2008)用甲基紫精和病原菌对超表达拟南芥HXKl和HXK2基因的拟南芥转基因株系进行处理的研究表明，己糖激酶可提高植物对非生物和生物胁迫的抗性。此外，HXK还可调控细胞程序性死亡(Kim et al, 2006)、种子发育(Troncoso-Ponce et al, 2011)、淀粉含量(Giese et al,2005)及花粉萌发(Xu et al，2008)。因此，植物HXK除了具有磷酸化己糖的酶学功能和参与糖信号转导功能，可能还协同营养及激素信号网络共同调控植物的生长发育。
[0004] 根据N端氨基酸序列，植物HXK主要分为2种类型:A型和B型(Olsson et al,2003)。A型HXK包含I个叶绿体运输信号肽，约30个氨基酸，B型HXK的N端共有I个疏水膜锚定结构域，约24个氨基酸，可能与膜有关。目前已经克隆研究的植物HXK基因有:小立豌藓 PpHXKl、PpHXK2 (Olsson et al，2003)，番茄 LeHXKl、LeHXK2、LeHXK3 和 LeHXK4(Daiet al, 2002 ；Menu et al, 2001 ;Kandel_Kfir et al, 2006),向日葵HaHXKl (Troncoso-Ponceet al，2011)，马铃薯 StHKl、ScHK2(Veramendi et al, 1999 ；Claeyssen et al，2006)，菠菜 SoHXKl (Wiese et al, 1999)，水稻 OsHXKl、0sHXK2、0sHXK3、0sHXK4、0sHXK5、0sHXK6、0sHXK7、0sHXK8、0sHXK9、OsHXK 10 (Cho et al,2006),烟草 NtHXKl、NtHXKla、NtHXK2、NtHXK3、NtHXK4a、NtHXK4b、NtHXK5、NtHXK6、NtHXK7 (Kim et al，2013)，拟南芥 AtHXKl、AtHXK2、AtHXK3(Gonzali et al，2002 ;Karve et al，2008)。未见梨己糖激酶基因相关的研究报道，本发明克隆梨果实己糖激酶基因PbHXKl，对了解果实糖代谢调控的分子生理机制及品质育种研究具有重要的意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供了一种从梨(Pyrus bretschneideri)中分离克隆的具有催化己糖磷酸化功能的基因。
[0006]本发明的另一目的是提供该基因的应用。
[0007]为了实现以上目的，本发明采用的技术方案如下:
[0008] 申请人:从梨(Pyrus bretschneideri)中分离克隆得到一个新基因PbHXKl,其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.1所不,包含1497bp的开放阅读框，146_1642bp的核苷酸序列为该基因的编码区；该基因编码498个氨基酸，氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示，等电点为5.89，分子量为53.9kDa。
[0009] 申请人:设计了两对引物，利用巢式PCR技术克隆得到上述基因PbHXKl的cDNA全长序列。
[0010]第一轮普通PCR引物对的核苷酸序列如下所示:
[0011]正向引物PbHXKl-Fl:5’-CGTATCCCTCCCCGAAAGTCC-3’，如序列表SEQ ID N0.3 所示；
[0012]反向引物PbHXKl-Rl:5，-CGAAGGAAATAGTGAGAAGATAGGGT-3，，如序列表 SEQ IDN0.4所示；
[0013]第二轮巢式PCR引物对的核苷酸序列如下:
[0014]正向引物PbHXKl-F2:5’ -CTCACTACCCAAACTTTCTCACTCAT-3’，如序列表 SEQ IDN0.5所示；
[0015]反向引物PbHXKl-R2:5’-CACTTCATTCATCTACCTGGTCTTG-3’，如序列表SEQ ID N0.6所示。
[0016]利用qRT-PCR技术分析了在不同梨品种的果实发育过程中PbHXKl基因的表达模式，并对PbHXKl相对表达量和己糖激酶活性进行了相关性分析，相关性分析结果表明PbHXKl相对表达量与己糖激酶活性成显著的正相关，表明本发明克隆的梨PbHXKl基因是己糖激酶候选基因。
[0017]含有所述的基因PbHXKl的重组表达载体。
[0018]所述的重组表达载体优选将所述的基因PbHXKl插入到pCAMBIA1301的Nco I和BstE II位点之间得到，该重组表达载体命名为‘PbHXKl-pCAMBIA1301。
[0019]含有权利要求1所述的基因PbffiCKl的基因工程菌。
[0020]所述的基因PbHXKl在调节植株生长和可溶性糖含量中的应用。
[0021]所述的应用，构建所述梨己糖激酶基因PbHXKl的植物超表达载体并转化番茄，以野生型番茄植株为对照，获得的转基因番茄植株的PbHXKl基因表达量和己糖激酶活性明显升高，而植株生长受到明显的抑制、可溶性糖含量显著降低。
[0022]所述的应用，抑制所述的基因PbHXKl的表达，可促进植株生长、可溶性糖含量提闻。
[0023]有益效果:本发明构建梨PbHXKl基因的植物超表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法将梨PbHXKl基因转化番茄，获得的转基因植株经生物学功能分析，表明本发明克隆的PbHXKl基因具有磷酸化己糖的功能，在果实的糖积累过程中具有负调控的作用，同时还参与调控植株的生长发育。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为本发明克隆的梨PbHXKl基因的琼脂糖凝胶电泳图。M =Marker ；H:本发明克隆的梨PbHXKl基因。
[0025]图2为本发明克隆的梨PbHXKl基因编码蛋白的系统进化树。Nt:烟草；So:菠菜；Nb:烟草；Le:番爺；Sc:马铃薯；Pb:梨；Ha:向日葵；At:拟南芥；0s:水稻；Pp:小立豌藓；PbHXKl为本发明克隆的梨PbHXKl基因编码的蛋白。
[0026]图3为本发明克隆的梨PbHXKl基因编码蛋白PbHXKl与番茄LeHXK3 (NP_001234710.1)、拟南芥 AtHXKl (AAB49908.1)、AtHXK2 (AAB49911.1)、向日葵HaHXKl (ABI18156.1)的氨基酸序列比对结果。PbHXKl包含4个己糖激酶特征保守结构域(a、b、c、d均用方框标出)，其中a和c为磷酸化作用位点，b为底物结合位点，d为ATP结合位点。
[0027]图4为本发明克隆的梨PbHXKl基因在不同梨品种果实发育过程中的qRT-PCR分析。(a): ‘鸭梨’ (Pyrus bretschneideri Rehd.cv.Yali) ； (b): ‘爱甘水，(Pyrus pyrifoliaNaka1.cv.Aikansui)。以‘鸭梨’和‘爱甘水’为试材,盛花后1d开始采集果实样品，每20d采一次样，果肉样品用液氮处理，_80°C保存。对不同发育时期梨果实的PbHXKl基因相对表达量进行了多重比较(P <0.01) ;*表示盛花后70d的‘爱甘水’果实的PbHXKl基因表达量显著低于盛花后30d的(P ( 0.05)。
[0028]图5为不同梨品种果实发育过程中的己糖激酶活性。(a): ‘鸭梨’ ；(b):‘爱甘水’。以‘鸭梨’和‘爱甘水’为试材，盛花后1d开始采集果实样品，每20d采一次样，果肉样品用液氮处理，_80°C保存。对不同发育时期梨果实的己糖激酶活性进行了多重比较(P ( 0.05)。37 °C，每毫克蛋白Imin增加的A34tl定义为I个酶活单位，即IU =AA34OmirT1.mg_1protein0
[0029]图6为本发明克隆的梨PbHXKl基因的植物超表达载体构建流程图。
[0030]图7为本发明克隆的梨PbHXKl基因在番茄植株不同组织中的相对表达量。(a):番茄叶片;(b):番茄幼嫩果实；(c)番茄成熟果实。WT:野生型番茄植株；#93、#95、#98:阳性转PbHXKl基因番茄株系。**表示转PbHXKl基因株系与野生对照的差异达极显著水平(P ( 0.01) ;*表示转PbHXKl基因株系与野生对照的差异达显著水平(P ( 0.05)。
[0031]图8为本发明克隆的梨PbHXKl基因在番茄植株中过量表达对植株生长的影响。WT:野生型番茄植株；#93、#95、#98:阳性转PbHXKl基因番茄株系。
[0032]图9为本发明克隆的梨PbHXKl基因在番茄植株过量表达对己糖激酶活性的影响。(a):番茄叶片；(b):番茄幼嫩果实；(c)番茄成熟果实。WT:野生型番茄植株；#93、#95、#98:阳性转PbHXKl基因番茄株系。**表示转PbHXKl基因株系与野生对照的差异达极显著水平(P ( 0.01) ;*表示转PbHXKl基因株系与野生对照的差异达显著水平(P ( 0.05)；ns表示转PbHXKl基因株系与野生对照的差异不显著(P>0.05)。37°C，每克鲜样Imin A340增加0.001定义为I个酶活单位，即IU = 0.001 AA340Iiiin-1.g^Fffo
[0033]图10为本发明克隆的梨PbHXKl基因在番茄植株中过量表达对可溶性糖含量的影响。(a):蔗糖含量(mg.g^Fff) ； (b):葡萄糖含量(mg.g^Fff) ； (c):果糖含量(mg.g^Fff)。**表示转PbHXKl基因株系与野生对照的差异达极显著水平(P ( 0.01) ;*表示转PbHXKl基因株系与野生对照的差异达显著水平(P ( 0.05)。
【具体实施方式】
[0034]以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下描述和实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
[0035]实施例1，梨PbHXKl基因的克隆
[0036]以盛花后50d 的‘鸭梨’果肉为试材，提取总RNA并反转录，所得的第一链cDNA用于扩增PbHXKl基因。利用CTAB法(CTAB提取缓冲液包括2% CTAB,2% PVP K_30、0.05%亚精胺、1mM Tris.HCl (pH = 8.0)、25mM EDTA、2M NaCl)提取总 RNA，取 Iyg RNA 样品，经 IU DNase I (购自 Fermentas 公司)37°C孵育 30min 后，加入 I μ LEDTA (25mM) 65°C孵育1min0第一链cDNA的合成用Τ0Υ0Β0反转录试剂盒(购自TakaRa公司，按照试剂盒说明书操作。)
[0037]利用巢式PCR技术扩增得到PbHXKl基因的cDNA全长序列，扩增PbHXKl基因的第一轮普通PCR引物对的核苷酸序列如下所示:
[0038]正向引物PbHXKl-Fl:5’ -CGTATCCCTCCCCGAAAGTCC-3’(对应 SEQ ID N0.3)，
[0039]反向引物PbHXKl-Rl:5’-CGAAGGAAATAGTGAGAAGATAGGGT-3’ (对应 SEQ ID N0.4)。
[0040]25 μ L PCR反应体系包括:I X PCR缓冲液(购自TakaRa公司)，2.5mM MgCl2 (购自TakaRa 公司),0.25mM dNTPs (购自 TakaRa 公司),0.32 μ M 正向引物 PbHXKl_Fl，0.32 μ M反向引物PbHXKl-Rl，10ng cDNA, IU Taq DNA聚合酶(购自TakaRa公司)。第一轮普通PCR反应程序为:94°C预变性3min ;94°C变性30s，58°C退火40s，72°C延伸3min，35个循环；循环完成后72°C延伸lOmin。
[0041]扩增PbHXKl基因的第二轮巢式PCR引物对的核苷酸序列如下所示:
[0042]正向引物PbHXKl-F2:5’-CTCACTACCCAAACTTTCTCACTCAT-3’ (SEQ ID N0.5)，
[0043]反向引物PbHXKl-R2:5’-CACTTCATTCATCTACCTGGTCTTG-3’ (SEQ ID N0.6)。
[0044]25 μ L PCR反应体系包括:I X PCR缓冲液(购自TakaRa公司)，2.5mM MgCl2 (购自TakaRa 公司),0.25mM dNTPs (购自 TakaRa 公司),0.32 μ M 正向引物 PbHXKl_F2，0.32 μ M反向引物PbHXKl_R2，lyL第一轮普通PCR的产物，IU Taq DNA聚合酶(购自TakaRa公司)。第二轮巢式PCR反应程序为:94°C预变性3min;94°C变性30s，56°C退火40s，72°C延伸3min，35个循环；循环完成后72°C延伸lOmin。
[0045]第二轮巢式PCR结束后，PCR产物经I %琼脂糖凝胶电泳后，产生一条单一的目的条带(图1)，用Ε.Z.N.A?:DNA凝胶回收试剂盒(购自Omega公司)回收，回收步骤参照使用说明书。回收纯化的PCR产物与pMD19-T Vector(购自TakaRa公司)进行连接反应，连接反应体系包括:4.5μ L回收纯化的PCR产物，0.5μ L pMD19_T Vector和5.0 μ L Solut1nI (购自TakaRa公司)。16°C连接5h。取10 μ L连接产物，采用热击法转化大肠杆菌DH5 α，在含有10mg.171氨苄青霉素的固体LB平板中筛选阳性克隆，挑取5个阳性克隆测序(由英潍捷基公司完成)，测序结果表明，本发明扩增的目的片段长度为1673bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，通过序列比对分析，确定该序列是本发明需要的目的基因，将这个基因命名为PbHXKl。
[0046]PbHXKl基因包括1497bp的开放阅读框，编码498个氨基酸，等电点为5.89，分子量为53.9kDa。构建了 22个植物HXK基因编码蛋白的系统进化树(图2)，分析结果表明PbHXKl属于B型植物己糖激酶，分析预测PbHXKl可能定位在线粒体。氨基酸序列比对结果显示PbHXKl基因编码的蛋白包含4个植物己糖激酶特征的保守结构域(图3)，具体包含2个磷酸化作用位点、I个ATP结合位点和I个底物结合位点，这些结构域是植物己糖激酶生物学功能所必需的，在已研究报道的己糖激酶中高度保守。
[0047]实施例2，梨果实发育过程中PbHXKl基因表达量和己糖激酶活性的相关性分析
[0048]1、梨PbHXKl基因在梨果实发育过程中的qRT-PCR分析
[0049]梨果肉总RNA的提取、cDNA合成的方法同实施例1。用梨tubulin(AB239681)作为内对照，引物的核苷酸序列如下:
[0050]正向引物PbHXK 1-F3:5，-TGGGCTTTGCTCCTCTTAC-3，，
[0051]反向引物PbHXKl-R3:5，-CCTTCGTGCTCATCTTACC-3’(。
[0052]利用Primer Premier 5.0在PbHXKl基因的开放阅读框内设计基因特异的qRT-PCR引物对，引物的核苷酸序列如下:
[0053]正向引物PbHXK 1-F4:5 ’ -TCCTTGAGTTTGCTCCCGAC-3，，
[0054]反向引物PbHXK 1-R4:5 ’ -TGGAGTGGGGTAACTTTCGC-3 ’。
[0055]qRT-PCR采用SYBR Green试剂盒(购自TaKaRa公司，按照试剂盒说明书操作)。20 μ L qRT-PCR 反应体系包括:10 μ L 2X SYBR Premix ExTaq，0.4 μ L 正向引物，0.4 μ L 反向引物，IyL cDNA,8.2 μ L无菌双蒸水。使用96孔qRT-PCR板(购自Roche公司)，运用qRT-PCR 仪(型号=LightCycler 480，Roche 公司)进行 PCR。qRT-PCR 反应程序为:95°C预变性1min ;95°C变性15s，60°C退火15s，72°C延伸20s，40个循环。每个cDNA样品重复3次，计算出每个cDNA样品的平均Ct值，通过计算2_δδμ得出PbHXKl基因的相对表达量。
[0056]2、梨果实发育过程中己糖激酶的活性变化
[0057]取梨果肉样品于预冷的研钵中，加液氮充分研磨成粉末，称取0.500g于2mL离心管，加入ImL预冷的提取缓冲液(缓冲液组成为:200mM磷酸钾，ImM EDTA, 1mM抗坏血酸钠，ImM DTT,0.1% Tween-20, 5% PVPP, ImM MgCl2, 2mM PMSF，pH = 7.8)，充分混匀，冰浴提取。4°C、1000rpm离心15min，上清液即为粗酶液，用于酶活分析。己糖激酶活性的测定采用己糖激酶(HK)测试盒(南京建成生物工程研究所)，按说明书进行操作，用核酸蛋白检测仪(型号:M200，瑞士 TECAN公司)测定340nm处的吸光值。
[0058]测定了不同梨品种果实发育过程中果实的己糖激酶活性(图5)，并利用qRT-PCR技术分析了梨果实中PbHXKl基因的相对表达量(图4)。相关性分析结果表明PbHXKl基因的相对表达量与己糖激酶活性成显著的正相关(表1)，表明本发明克隆的梨PbHXKl基因是一种己糖激酶候选基因。
[0059]表1梨果实发育过程中PbHXKl基因的相对表达量与己糖激酶活性的相关性分析
[0060]
【权利要求】
1.一种分离自梨的具有催化己糖磷酸化功能的基因PbHXKl，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示，cDNA全长序列为1673bp，包含1497bp的开放阅读框。
2.权利要求1所述的基因PbHXKl编码的蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQID N0.2所示，编码498个氨基酸，等电点为5.89，分子量为53.9kDa。
3.一种克隆权利要求1或2所述基因cDNA序列的两对引物，第一轮普通PCR引物对的核苷酸序列如下所示: 正向引物PbHXKl-Fl:如SEQ ID N0.3所示； 反向引物PbHXKl-Rl:如SEQ ID N0.4所示； 第二轮巢式PCR引物对的核苷酸序列如下: 正向引物PbHXK1-F2:如SEQ ID N0.5所示； 反向引物PbHXK1-R2:如SEQ ID N0.6所示。
4.含有权利要求1所述的基因PbHXKl的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于将所述的基因PbHXKl插入到PCAMBIA1301的Nco I和BstE II位点之间得到重组表达载体‘PbHXKl_pCAMBIA1301。
6.含有权利要求1所述的基因PbHXKl的基因工程菌。
7.权利要求1所述的基因PbHXKl在调节植株生长和可溶性糖含量中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，构建所述梨己糖激酶基因PbHXKl的植物超表达载体并转化番茄，以野生型番茄植株为对照，获得的转基因番茄植株的PbHXKl基因表达量和己糖激酶活性明显升高，而植株生长受到明显的抑制、可溶性糖含量显著降低。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于抑制权利要求1所述的基因的表达，可促进植株生长、可溶性糖含量提高。
【文档编号】C12N9/12GK104178502SQ201410439245
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年8月29日 优先权日:2014年8月29日
【发明者】张绍铃, 赵碧英, 黄小三, 齐开杰 申请人:南京农业大学