Timp-1基因在制备治疗糖尿病皮肤创面产品中的应用的制作方法

Timp-1基因在制备治疗糖尿病皮肤创面产品中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因【技术领域】，具体涉及TIMP-1基因在制备治疗糖尿病皮肤创面产品中的应用。用TIMP-1基因和腺病毒载体或慢病毒载体构建携带TIMP-1基因的重组表达载体；将携带TIMP-1基因的重组表达载体和腺病毒载体穿梭质粒共转染HEK293细胞，获得携带TIMP-1基因的重组腺病毒；将携带TIMP-1基因的重组腺病毒转染到糖尿病人或动物模型皮肤细胞，提高TIMP-1表达水平；本发明证明TIMP-1可以抑制由于高糖导致糖尿病人皮肤中成纤维细胞过多凋亡，从而加速糖尿病皮肤创面的愈合，也为发明TIMP-1基因作为防治糖尿病足部慢性溃疡新的治疗靶点和药物提供依据。
【专利说明】TIMP-1基因在制备治疗糖尿病皮肤创面产品中的应用

【技术领域】
[0001] 本发明属于基因【技术领域】，具体涉及--ΜΡ-1基因在制备治疗糖尿病皮肤创面产 品中的应用。

【背景技术】
[0002] 随着人们生活方式的改变以及人均寿命的延长，糖尿病发病率急剧增加。在我们 国家，糖尿病已经成为慢性皮肤伤口的主要病因。糖尿病足溃疡是糖尿病足的主要表现，也 是导致糖尿病患者截肢的重要原因。糖尿病患者皮肤易损伤，且足溃疡一旦发生，治疗非常 困难，很难愈合，而且治疗周期长，医疗费用高，严重影响患者的生活质量。因此，糖尿病皮 肤病变的防治研宄是临床急待探讨的重要课题之一。
[0003] 生物因子失调是糖尿病创面愈合延迟的重要原因之一。多种细胞因子被证明可 以局部应用在糖尿病创面，加速创面愈合，达到预防或者治疗糖尿病足的作用。组织金属 蛋白酶抑制剂 _1 (tissue inhibitor of metalloproteinase-l，TIMP-l)基因 （Genbank No. NC_000023. 11)编码的--ΜΡ-1因具有广泛地抑制金属蛋白酶活性的作用而得到大家的 关注，但未见其本身作为一种蛋白因子作用于皮肤成纤维细胞，发挥抗凋亡作用而促进糖 尿病皮肤慢性溃疡愈合的报道。


【发明内容】

[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的缺点和不足，提供--ΜΡ-1基因在制备治疗糖 尿病皮肤创面产品中的应用，该--ΜΡ-1基因编码的--ΜΡ-1蛋白可以作为糖尿病足治疗的 生物因子之一，加速糖尿病皮肤创面愈合，降低糖尿病足导致的截肢率减少医疗费用和提 高患者生活质量。
[0005] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0006] --ΜΡ-1基因在制备治疗糖尿病皮肤创面产品中的应用，所述的--ΜΡ-1基因作为 糖尿病足治疗的生物因子之一，抑制由于高糖（糖基化终末产物）导致糖尿病人皮肤中成 纤维细胞过多凋亡，从而加速糖尿病皮肤创面的愈合。
[0007] 所述的治疗糖尿病皮肤创面产品包括：用--ΜΡ-1基因和腺病毒载体或慢病毒 (HIV)载体构建携带--ΜΡ-1基因的重组表达载体；将携带--ΜΡ-1基因的重组表达载体（骨 架质粒）和腺病毒载体穿梭质粒共转染ΗΕΚ293细胞，获得携带--ΜΡ-1基因的重组腺病毒； 将携带--ΜΡ-1基因的重组腺病毒转染到糖尿病人或动物模型皮肤细胞，提高--ΜΡ-1表达 水平；
[0008] 所述的携带--ΜΡ-1基因的重组表达载体，是将--ΜΡ-1基因序列与腺病毒载体或 慢病毒（HIV)载体连接得到的；
[0009] 所述的腺病毒载体优选为pDC316-mCMV-EGFP ;
[0010] 所述的携带--ΜΡ-1基因的重组表达载体的制备方法，包含如下步骤：
[0011] ⑴引物设计：
[0012] 根据NCBI数据库中--ΜΡ-1基因的⑶S序列信息，设计带有Not I、EcoRV酶切位 点的扩增引物，引物序列如下：
[0013] TIMP-INotIF ：
[0014] 5'-ATAAGAATGCGGCCGCGCCACCATGGCCCCCTTTGAGCCCCTG-3' ；
[0015] TIMP-lEcoRVIR ：
[0016] 5'-ACGGATATCTCAGGCTATCTGGGACCGCAGG-3' ；
[0017] (2)--ΜΡ-1基因 CDS片段的获得：
[0018] 以人cDNA为模板，使用步骤（1)设计的引物--ΜΡ-lNotIF和HMPlEcoRVIR扩增 回收--ΜΡ-1基因⑶S片段；
[0019] (3)携带--ΜΡ-1基因的重组表达载体的构建
[0020] 将步骤（2)中回收后的--ΜΡ-1基因⑶S片段与载体pDC316-mCMV-EGFP分别用 Not I、EcoR酶切并连接，得到携带--ΜΡ-1基因的重组表达载体；
[0021] 所述的携带--ΜΡ-1基因的重组腺病毒的制备方法，包含如下步骤：
[0022] 1)重组腺病毒AD---ΜΡ-Ι的包装
[0023] 采用Ad5腺病毒改建的AdMaxTM重组腺病毒包装系统，腺病毒载体穿梭质粒和携 带--ΜΡ-1基因的重组表达载体（骨架质粒）共转染HEK293细胞，在Cre-Ioxp重组酶作 用下包装形成E1/E3缺失的复制型腺病毒；当大部分细胞（80%以上细胞）收缩变圆、脱落 时，离心收集细胞，反复冻融裂解细胞后收集上清，得到第一代重组腺病毒；
[0024] 2)重组腺病毒AD---ΜΡ-Ι的扩增
[0025] 培养扩增HEK293细胞，当细胞汇合度达到80?90 %时加入第一代重组腺病毒； 感染48h后收集细胞，反复冻融裂解细胞，离心、收集病毒上清，得到第二代重组腺病毒；
[0026] 3)高滴度重组腺病毒的获得
[0027] 重复步骤2)，反复感染HEK293细胞，获得高滴度重组腺病毒；
[0028] 步骤1)中所述的共转染优选采用脂质体法进行共转染；
[0029] 步骤1)和步骤2)中所述的反复冻融裂解细胞的具体操作优选为-80°C /37°C反 复冻融3次；
[0030] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0031] 本发明证明--ΜΡ-1可以抑制由于高糖（糖基化终末产物）导致糖尿病人皮肤中 成纤维细胞过多凋亡，从而加速糖尿病皮肤创面的愈合，也为发明--ΜΡ-1基因作为防治糖 尿病足部慢性溃疡新的治疗靶点和药物提供依据。

【专利附图】

【附图说明】
[0032] 图1是实施例1中两组足部伤口皮肤Cleaved Caspase-3免疫组化染色后免疫反 应评分结果分析图，其中，对照组为非糖尿病组；* :与对照组对比，P〈〇. 05。
[0033] 图2是实施例1中两组足部伤口皮肤TUNEL-P0D细胞凋亡染色后凋亡指数结果分 析图，其中，对照组为非糖尿病组；* :与对照组对比，P〈〇. 05。
[0034] 图3是实施例1中两组足部伤口皮肤--ΜΡ-1免疫组化染色后免疫反应评分结果 分析图，其中，对照组为非糖尿病组；* :与对照组对比，Ρ〈〇. 05。
[0035] 图4是实施例2中不同因素作用72h对人皮肤成纤维细胞凋亡率影响比较分析 图，* :与正常浓度糖组对比，P〈〇. Ol :与持续高糖组对比，P〈〇. 05。
[0036] 图5是实施例2中糖基化终末产物（AGEs)对人皮肤成纤维细胞--ΜΡ-1表达影响 的结果分析图，* :与对照组对比，P〈〇. 05。
[0037] 图6是实施例3中TUNEL法检测rhHMP-l作用72h对糖基化终末产物诱导的原 代皮肤成纤维细胞凋亡的影响结果分析图，其中，* :与对照组对比，P〈〇. 05 :与糖基化终 末产物组对比，p〈0. 05。
[0038] 图7是实施例3中Western Blot检测rhUMP-l (10ng/mL)作用72h对糖基化终 末产物诱导的Cleaved Caspase-3表达水平的影响结果分析图，其中，* :与对照组对比， p〈0. 05 :与糖基化终末产物组对比，p〈0. 05。
[0039] 图8是实施例4中扩增--ΜΡ-1基因片段PCR产物以及重组质粒酶切鉴定琼脂糖 凝胶电泳图，Α，--ΜΡ-1基因片段PCR产物鉴定结果，M :DL2000DNAMarker，泳道1 :--ΜΡ-1基 因片段PCR产物；Β，重组质粒酶切鉴定结果，M :DL2000DNA Marker ;泳道1?2 :分别为空 载酶切前后；泳道3?4 :分别为pDC316-mCMV-EGFP-TMP-l酶切前后。
[0040] 图9是实施例4中AD---ΜΡ-Ι和AD-EGFP转染后到获得Pl代病毒的绿色荧光图 (X40) 〇
[0041] 图10是实施例4中AD---ΜΡ-Ι和AD-EGFP感染HEK293细胞扩增病毒图（X 40)。
[0042] 图11是实施例4中AD---ΜΡ-Ι作用48h对人皮肤成纤维细胞的转染率比较分析 图，其中，A :转染率平均值和标准差；B :转染流式细胞计数图例。
[0043] 图12是实施例4中人皮肤成纤维细胞感染AD---ΜΡ-Ι不同时间的存活率比较分 析图，* :与 MOI = 0 对比，ρ〈0· 05。
[0044] 图13是实施例4中EGFP在人皮肤成纤维细胞的表达的荧光图（X 100)。
[0045] 图14是实施例4中--ΜΡ-1在人皮肤成纤维细胞的表达分析图，其中，* :与无感染 组（CON)对比，ρ〈0· 05 :与 AD-EGFP 组对比，ρ〈0· 05。
[0046] 图15是实施例4中AD---ΜΡ-Ι转染逆转AGEs诱导的人皮肤成纤维细胞凋亡结果 分析图，A :凋亡率比较；B :TUNEL检测图例（Χ100)。与CON组对比，ρ〈0. 05 ;Λ :与AGEs对 比，ρ〈0· 05 :与 AGEs+AD-EGFP 对比，ρ〈0· 05。
[0047] 图16是实施例5中糖尿病大鼠创面边缘点状注射药物示意图。
[0048] 图17是实施例5中4组心肝肾组织HE染色图（X400)。
[0049] 图18是实施例5中不同时间4组--ΜΡ-1蛋白表达水平的比较分析图，其中，A : PBS 对照组；B :rh-HMP-l 组；C !AD-EGFP 组；D :AD-HMP-1 组；* 与 PBS 组对比，ρ〈0· 05 ;# 与 rhUMP-l 组对比，ρ〈0· 05 ;Λ与 AD-EGFP 组对比，ρ〈0· 05。
[0050] 图19是实施例5中不同时间4组伤口愈合情况的比较分析图。
[0051] 图20是实施例5中4组伤口形成第7天和14天细胞凋亡TUNEL染色分析图 (X200)〇

【具体实施方式】
[0052] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0053] 实施例1糖尿病患者伤口皮肤细胞凋亡及--ΜΡ-1表达的检测
[0054] 实验对象与取材：皮肤标本
[0055] 糖尿病足组：自2011年6月至2013年4月于我科因糖尿病足住院的2型糖尿病患 者18例，平均年龄为62± 13. 14岁；非糖尿病组：自2011年6月至2013年4月于我院骨科 因足部外伤行外科手术治疗的住院的非糖尿病患者18例，平均年龄为55± 15. 45岁。所取 标本经患者知情同意。所有皮肤标本均在局部感染控制后取材，距离足部伤口边缘0. 5cm。 剪取皮肤标本后以质量分数为4%的多聚甲醛溶液固定，制作厚度5 μ m石蜡切片；
[0056] (1)糖尿病患者伤口皮肤细胞凋亡检测
[0057] ①活化的Caspase-3 (Cleaved Caspase-3)免疫组织化学染色：
[0058] Caspase家族是细胞凋亡的介导者和执行者，在引起凋亡中起关键作用，Cleaved Caspase-3表达增高时提示依赖Caspase途径的细胞凋亡增加。
[0059] 采用SABC(链霉亲和素-生物素复合物）法染色：即用型SABC试剂盒购自武 汉博士德生物工程有限公司，一抗为兔抗人的Cleaved Caspase-3单克隆抗体（CST公 司），二抗为生物素标记的山羊抗兔第二抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；具体的 实验方法和步骤按照试剂盒中的说明进行，染色过程中均设有阴性对照。结果判断标准： 细胞浆有棕色着色的细胞为阳性细胞，无棕色着色的为阴性细胞。免疫组化染色结果按 照 IRS 标准（参考文献：Remmele ff, Stegner. Recommendation for uniform definition of an immunoreactive score (IRS)for immunohistochemical estrogen receptor detection (ER-ICA) in breast cancer tissue. Pathologe, 1987, 8 (3) :138-140.)进行评 分，IRS = P*I。P为阳性细胞百分比：没有阳性细胞，P = 0 ;阳性细胞占 I?24%，P = I ; 阳性细胞占25?49%，P = 2 ;阳性细胞占50?74%，P = 3 ;阳性细胞占75?100%，P =4。I为染色强度：没有染色，I = 0 ;染色浅，I = 1 ;染色中等强度，I = 2 ;染色深，I = 3。每个标本随机选取5个高倍视野评分，取平均值。
[0060] ② TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)检测：
[0061] 米用 In situ cell death detection kit-POD 法，试剂盒购自罗氏公司（Cat. NO. 11684817910)，方法和步骤按照试剂盒中的说明进行。实验过程设有阴性对照。每个标 本随机选取10个高倍视野，计数>1000个细胞，细胞核中有棕黄色者即为凋亡细胞，计算凋 亡指数（Al)，AI =凋亡细胞数/细胞总数X 100%。
[0062] (2)糖尿病患者伤口皮肤--ΜΡ-1检测
[0063] --ΜΡ-1主要定位于细胞膜和细胞浆，为多功能蛋白，广泛表达于创面皮肤角质细 胞、成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞。
[0064] 采用SABC法染色：即用型SABC试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，一抗为 兔抗人的TIMP-I单克隆抗体（EPITOMICS公司），方法和步骤按照试剂盒中的说明进行。
[0065] 结果分析：
[0066] (1)糖尿病患者足部伤口皮肤细胞凋亡情况
[0067] 本实施例通过Cleaved Caspase-3免疫组织化学染色法和TUNEL两种方法检测非 糖尿病患者和糖尿病患者足部伤口皮肤细胞凋亡情况；结果表明：糖尿病患者皮肤创面细 胞凋亡明显增加，发生凋亡的细胞以真皮层中的成纤维细胞为主，有少量角质形成细胞发 生；Cleaved Caspase-3在非糖尿病组和糖尿病组的表达（IRS评分）分别为I. 04±0. 23 和3. 04±0. 31 (图1)，差异具有统计学意义（p〈0. 05);两组TUNEL检测凋亡率分别为 3. 8±0. 8%和8. 4±1.5% (图2)，差异具有统计学意义（p〈0. 05)。
[0068] (2)糖尿病患者足部伤口皮肤TIMP-I的蛋白表达情况
[0069] --ΜΡ-1蛋白主要定位在细胞浆和胞膜，在糖尿病患者和非糖尿病患者皮肤创面 的表皮层和真皮层成纤维细胞、巨细胞和内皮细胞均有表达，但两者分布不同，强弱不 等。在非糖尿病皮肤创面，--ΜΡ-1在表皮靠近基底层的角质细胞呈强阳性表达，在真皮层 呈中等强度阳性表达。在糖尿病患者皮肤创面，--ΜΡ-1在巨噬细胞呈强阳性表达，在角质 细胞和成纤维细胞呈弱阳性表达。糖尿病组和非糖尿病组IRS评分分别为6. 2±1. 76和 3. 5± I. 01 (图3)，差异具有统计学意义（p〈0. 05)，表明较之非糖尿病组，糖尿病组皮肤创 面--ΜΡ-1的蛋白表达水平下降。
[0070] 实施例2糖基化终末产物（AGEs)对人皮肤成纤维细胞凋亡和--ΜΡ-1表达的影响
[0071] (1)细胞来源本院泌尿外科或小儿外科正常儿童包皮环切术后的手术标本，均经 患者家属同意后留取标本。实验对象为第4?6代细胞；
[0072] 人皮肤成纤维细胞培养：通过原代培养获得人皮肤成纤维细胞，按IX IO4/孔的密 度接种至6孔板，细胞长至对数生长期60 %融合，更换体积分数为0. 5%的胎牛血清的正 糖培养基进行饥饿24h，使细胞进入同步化状态；细胞分为2组：一组为正常对照组（含NG 5. 6mmo/L，此处的NG是指正常浓度葡萄糖，以下细胞培养的所有的组都含NG的，因为NG是 正常培养基的成份），一组为糖基化终末产物（AGEs)组（含NG 5. 6mmo/L和AGEs 150ug/ mL)，按实验分组更换含或不含糖基化终末产物的培养基；继续培养72h ;
[0073] (2)采用流式细胞仪Annexion-FITC联合PI双染法检测细胞凋亡情况；
[0074] ①用不含EDTA的胰酶消化细胞并用PBS洗涤；
[0075] ②重悬细胞并计数（数量不少于1〇5)，然后IOOOg离心5min，收集细胞；
[0076] ③加入400 μ L I X Binding Buf fer轻轻重悬细胞；
[0077] ④加入5 μ L AnnexinV-FITC (中山大学孙逸仙纪念医院医研中心提供），轻轻混 匀，室温避光孵育15min ;
[0078] ⑤加入10 μ L PI (中山大学孙逸仙纪念医院医研中心提供）染色液，轻轻混匀，冰 浴避光放置5min ;
[0079] ⑥在30min内进行流式细胞仪检测；
[0080] (3)采用ELISA法测定上清中--ΜΡ-1蛋白水平，测定方法如下（--ΜΡ-IELISA试剂 盒，BLUE GENE 公司）：
[0081] ①收集步骤⑵细胞培养后的细胞上清液后4 °C 3000rpm离心30min，上清液 于-80°C以下保存，待酶联免疫法测定；
[0082] ②同步胰酶-EDTA消化步骤（2)培养的细胞，收集于离心管后进行细胞计数；
[0083] ③建立标准曲线：取出酶标板，按照标准品的次序（浓度分别为0、0.5、1.0、2.5、 5. 0、10ng/mL)分别加入IOOuL的标准品溶液于空白微孔中；
[0084] ④加样：待测品孔每孔各加入步骤①制备的待测样品100yL，空白对照加入 IOOuL的蒸馏水；
[0085] ⑤在各孔中加入50uL的酶标记溶液（不含空白对照孔），将酶标板用封口胶密封 后，37°C孵育反应Ih ;
[0086] ⑥充分清洗酶标板5次，保持各孔有充足的水压（浓缩洗涤液以1:100的比例与 蒸馏水稀释）。酶标板洗涤后用吸水纸彻底拍干；
[0087] ⑦各孔分别加入显色剂A 50uL和显色剂B 50uL ;
[0088] ⑧37°C下避光反应15min ;
[0089] ⑨各孔加入50uL终止液，终止反应，在酶标仪450nm波长测定光密度和浓度。
[0090] 结果分析：
[0091] (1)糖基化终末产物（AGEs)对人皮肤成纤维细胞凋亡的影响
[0092] 流式细胞仪Annexion-FITC联合PI双染法检测结果提示：人原代皮肤成纤维细胞 在正常对照和含AGEs培养基中分别培养72h，凋亡率分别为2. 43±0. 19%、6. 83±0. 36% (图4)，差异具有统计学意义（p〈0. 05)。
[0093] (2)糖基化终末产物（AGEs)对人皮肤成纤维细胞--ΜΡ-1表达的影响
[0094] 在正常对照的培养基，人皮肤成纤维细胞上清液中--ΜΡ-1的浓度4. 84± I. 63ng/ mL;而在AGEs(150ug/mL)作用72h后的人皮肤成纤维细胞上清液中--ΜΡ-1的浓度是 2. 64±0. 98ng/mL，较之正常对照组下降45. 5% (图5)。实验结果表明AGEs抑制人皮肤成 纤维细胞--ΜΡ-1蛋白表达，与实施例1中糖尿病患者足部伤口皮肤--ΜΡ-1的蛋白表达水 平下降一致。
[0095] 实施例3外源rhHMP-l对AGEs诱导的人皮肤成纤维细胞凋亡的影响
[0096] (1)细胞来源：同实施例2 ;
[0097] (2)流式细胞术细胞凋亡检测：
[0098] 人皮肤成纤维细胞培养：通过原代培养获得人皮肤成纤维细胞，按I X IO4/孔的 密度接种至6孔板；细胞长至对数生长期60 %融合，更换体积分数为0. 5%的胎牛血清的 正糖培养基进行饥饿24h，使细胞进入同步化状态；细胞分为3组：正常对照组、AGEs组和 AGEs+rhTMP-1组，按实验分组更换上述不同处理的培养基，其中，正常对照组的培养基中 含 NG 5. 6mmo/L ;AGEs 组的培养基含 NG 5. 6mmo/L+AGEs 150ug/mL ;AGEs+rhHMP-l 组培养 基含 NG 5. 6mmo/L+AGEs 150ug/mL+rhHMP-l (浓度分别为 l、10、50、100ng/mL，CYTOLAB/ PEPROTECH ASIA公司）；分别继续培养48h、72h、96h和120h，用不含EDTA的胰酶消化细胞 并用PBS洗涤后，送流式细胞仪进行Annexion-FITC联合PI双染法检测细胞凋亡，具体方 法参照实施例2 ;
[0099] (3) TUNEL细胞凋亡检测：
[0100] 人皮肤成纤维细胞培养：通过原代培养获得人皮肤成纤维细胞，按IX 1〇4/孔的 密度接种至96孔板；细胞长至对数生长期60%融合，更换0. 5% (体积分数）胎牛血清 的正糖培养基进行饥饿24h，使细胞进入同步化状态；细胞分为3组：正常对照组、AGEs 组和AGEs+rhHMP-Ι组，按实验分组更换上述不同处理的培养基，继续培养72h，其中正 常对照组的培养基中含NG 5. 6mmo/L ;AGEs组的培养基含NG 5. 6mmo/L+AGEs 150ug/mL ; AGEs+rhHMP-1 组培养基含 NG 5. 6mmo/L+AGEs 150ug/mL+rhHMP-110ng/mL(CYT0LAB/ PEPROTECH ASIA公司）；TUNEL法检测细胞凋亡情况，细胞TUNEL方法步骤如下：
[0101] ①去培养基，PBS洗1次；
[0102] ②吸干，加入质量分数为4%的聚甲醛固定Ih，PBS洗5minX2次；
[0103] ③加入体积分数为0· 1 %的Triton，冰上破膜2min，PBS洗5minX 2次；
[0104] ④配置 TUNEL 反应液（Enzyme Solution :Label Solution = 1 :9)，冰上操作，即 用即配；
[0105] ⑤加入 TUNEL 反应液 50uL，避光，37°C孵育 60min，PBS 洗 5minX3 次；
[0106] ⑥加入 Hochast (10ug/mL) 50uL，复染 6min，PBS 洗 5minX 3 次；
[0107] ⑦吸干，荧光显微镜下观察；高倍镜下随机选取10个视野，计算凋亡率。
[0108] 细胞核呈红色者即为凋亡细胞。凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数X 100%。
[0109] (4) Cleaved Caspase-3Western blot 检测：
[0110] Western blot检测步骤（3)中3种不同处理的细胞中Cleaved Caspase-3的表达 水平；
[0111] a)总蛋白提取（以下步骤均在冰上完成）：
[0112] ①吸弃细胞培养液，冷PBS轻轻冲洗2次。
[0113] ②加入0. ImL预冷的细胞裂解缓冲液（200mM Tris-HCl，600mM NaCl，质量分数为 1 % 的 NaN3,质量分数为 1 % 的 SDS，5mg/mL PMSF，100 μ g/mLaprotinin，质量分数为 4% 的 即-40，质量分数为5%的脱氧胆酸，均为终浓度）加入细胞单层中，冰上放置3〇11^11;
[0114] ③用细胞刮将贴壁细胞刮落，把细胞碎片连同裂解液一起转移到微量离心管， 4°C HOOOrpm 离心 30min ;
[0115] ④将上清小心转移到干净无菌离心管中，-80°C保存；
[0116] b)MiniBCA法测定提取物中蛋白质浓度：
[0117] ①用 0· 5mg/mL 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA)制备 0 ?500 μ g/mL 系列浓度的标准蛋白液；
[0118] ②步骤①系列浓度的标准蛋白液（25yL)与蛋白染色液（A+B)200 yL混匀后，测 定其在562nm波长处的光密度值并绘制标准曲线；其中染色液A的组成成份（终浓度）：质 量分数为1 %的BCA二钠盐，质量分数为2%的无水碳酸钠，质量分数为0. 16%的酒石酸钠， 质量分数为〇. 4%的氢氧化钠，质量分数为0. 95%的碳酸氢钠，pH值11. 25 ;染色液B的组 成成份（终浓度）：质量分数为4%的硫酸铜；染色液A与染色液B按照体积50 :1混匀即 得到染色液（A+B);
[0119] ③每个蛋白样品取5 μ L，用20 μ L的三蒸水稀释至25 μ L，再与蛋白染色液 (Α+Β) 200 μ L混匀，测定其在562nm波长处的光密度值，在标准曲线上得到对应的浓度值， 该浓度值X5即为待测蛋白的浓度；
[0120] c)蛋白质印迹
[0121] ①制胶：制备质量分数为5%的变性聚丙烯酰胺浓缩胶和8%的变性聚丙烯酰胺 分离胶；
[0122] ②上样：10 μ L样品或预染蛋白Marker与10 μ L 2X变性聚丙稀酰胺凝胶电泳上 样缓冲液混匀，煮沸5min后上样于浓缩胶；
[0123] ③电泳：以200V电泳至溴芬兰迀移至凝胶底部，电泳槽中放置冰袋以保持凝胶温 度不超过20°C，单面胶电泳开始时电流应小于60mA，结束时电流应小于30mA ;
[0124] ④转膜：取出分离胶，在转膜缓冲液中与PVDF膜装配成湿转体系，以100V电转 120min，湿转槽中放置冰袋以保持转移体系温度不超过20°C，单面胶电转开始时电流应小 于250mA，结束时电流应小于350mA ;
[0125] ⑤小心地取出PVDF膜，可见预染marker已从凝胶转移至膜上；以20mL洗膜缓冲 液洗绦5minX 3次，不断摇晃；
[0126] ⑥封闭：封闭液15mL浸膜，常温摇晃2h ;
[0127] ⑦加入15mL兔抗人Cleaved Caspase-3单克隆抗体（1 :1000,封闭液稀释，CST公 司），4°C摇晃过夜；
[0128] ⑧20mL洗膜缓冲液洗涤15min X 1次及5min X 2次，不断摇晃；
[0129] ⑨加入15mL辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(l :2000，封闭液稀释，武汉博士 德生物工程有限公司），室温摇晃Ih ;
[0130] ⑩20mL洗膜缓冲液洗涤15min X 1次及5min X 4次，不断摇晃；
[0131] ?显色：取ECL溶液1和溶液2 (Thermo公司）各50 μ L，与蒸馏水ImL混匀即配 成发光工作液；将发光液滴于膜上显色1?IOmin ;
[0132] ?i曝光：在暗室中用镊子小心地取出膜，用塑料膜包裹，将膜的蛋白面对着X光 片曝光5min，立即冲洗；
[0133] ?冼膜：曝光后，用洗膜缓冲液摇晃冲洗5minX4次；将膜置于50°C洗脱缓冲液 中摇晃30min ;再次置于洗膜缓冲液摇晃5minX6次；将一抗换成内参照小鼠抗人单克隆 GAPDH，二抗换成辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG (武汉博士德生物工程有限公司）。
[0134] ?,用BandScan 4. 3软件对条带进行灰度扫描，以总灰度代表蛋白的表达量，以 目的蛋白与GAPDH的比值代表目的蛋白水平。
[0135] 结果分析：
[0136] (l)rhHMP-l对AGEs诱导的人皮肤成纤维细胞凋亡的影响
[0137] 通过流式细胞仪Annexion-FITC联合PI双染法检测，结果发现：rhHMP-l作用 72h后，抗凋亡作用逐渐呈现，随着作用时间的延长，不同浓度rhTMP-l对AGEs (150ug/mL) 诱导的细胞凋亡的影响不同，低浓度1?10ng/mL对细胞凋亡有保护作用，中等浓度50ng/ mL对凋亡无影响，而高浓度100ng/mL促进细胞凋亡（表1)。
[0138] 表1不同浓度rhTMP-l对AGEs诱导的细胞凋亡率比较（x±s, % )

【权利要求】
1. TMP-1基因在制备治疗糖尿病皮肤创面产品中的应用，其特征在于：所述的TMP-l 基因作为糖尿病足治疗的生物因子之一，抑制由于高糖导致糖尿病人皮肤中成纤维细胞过 多凋亡，从而加速糖尿病皮肤创面的愈合。
2. 根据权利要求1所述的TIMP-1基因在制备治疗糖尿病皮肤创面产品中的应用，其特 征在于所述的治疗糖尿病皮肤创面产品包括：用TIMP-1基因和腺病毒载体或慢病毒载体 构建携带TMP-1基因的重组表达载体；将携带TMP-1基因的重组表达载体和腺病毒载体 穿梭质粒共转染J1EK293细胞，获得携带TMP-1基因的重组腺病毒；将携带TMP-1基因的 重组腺病毒转染到糖尿病人或动物模型皮肤细胞。
3. 根据权利要求2所述的TIMP-1基因在制备治疗糖尿病皮肤创面产品中的应用，其特 征在于： 所述的携带TMP-1基因的重组表达载体，是将TMP-1基因序列与腺病毒载体或慢病 毒载体连接得到的。
4. 根据权利要求3所述的TMP-1基因在制备治疗糖尿病皮肤创面产品中的应用，其特 征在于： 所述的腺病毒载体为pDC316-mCMV-EGFP。
5. 根据权利要求4所述的TIMP-1基因在制备治疗糖尿病皮肤创面产品中的应用，其特 征在于： 所述的携带TMP-1基因的重组表达载体的制备方法，包含如下步骤： (1) 引物设计： 根据NCBI数据库中TMP-1基因的⑶S序列信息，设计带有Not I、EcoRV酶切位点的 扩增引物，引物序列如下： TIMP-lNotIF ： 5'-ATAAGAATGCGGCCGCGCCACCATGGCCCCCTTTGAGCCCCTG~3,； TIMP-lEcoRVIR ： 5'-ACGGATATCTCAGGCTATCTGGGACCGCAGG~3,； (2) TMP-1基因⑶S片段的获得： 以人cDNA为模板，使用步骤（1)设计的引物TMP-lNotIF和TMPlEcoRVIR扩增回收 TMP-1基因⑶S片段； (3) 携带TMP-1基因的重组表达载体的构建 将步骤（2)中回收后的TMP-1基因⑶S片段与载体pDC316-mCMV-EGFP分别用Not I、 EcoR酶切并连接，得到携带TMP-1基因的重组表达载体。
6. 根据权利要求2所述的TMP-1基因在制备治疗糖尿病皮肤创面产品中的应用，其特 征在于： 所述的携带TMP-1基因的重组腺病毒的制备方法，包含如下步骤： 1)重组腺病毒AD-TMP-1的包装 采用Ad5腺病毒改建的AdMaxTM重组腺病毒包装系统，腺病毒载体穿梭质粒和携带 TMP-1基因的重组表达载体共转染HEK293细胞，在Cre-loxp重组酶作用下包装形成E1/ E3缺失的复制型腺病毒；当大部分细胞收缩变圆、脱落时，离心收集细胞，反复冻融裂解细 胞后收集上清，得到第一代重组腺病毒； 2) 重组腺病毒AD-TMP-1的扩增 培养扩增J1EK293细胞，当细胞汇合度达到80?90%时加入第一代重组腺病毒；感染 48h后收集细胞，反复冻融裂解细胞，离心、收集病毒上清，得到第二代重组腺病毒； 3) 高滴度重组腺病毒的获得 重复步骤2)，反复感染HEK293细胞，获得高滴度重组腺病毒。
7. 根据权利要求6所述的TIMP-1基因在制备治疗糖尿病皮肤创面产品中的应用，其特 征在于： 步骤1)中所述的共转染采用脂质体法进行共转染。
8. 根据权利要求6所述的TIMP-1基因在制备治疗糖尿病皮肤创面产品中的应用，其特 征在于： 所述的反复冻融裂解细胞的具体操作为_80°C /37°C反复冻融3次。
【文档编号】C12N15/74GK104436214SQ201410438853
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年8月29日 优先权日:2014年8月29日
【发明者】劳国娟, 严励, 任萌, 罗恒聪, 梁颖, 杨川 申请人:中山大学孙逸仙纪念医院