一种催化活性提高且最适pH降低的L-阿拉伯糖异构酶的突变体酶D478N的制作方法
【专利摘要】一种催化活性提高且最适pH降低的L-阿拉伯糖异构酶的突变体酶D478N，属于酶的基因工程【技术领域】。本发明公开了由来源于微生物Alicyclobacillushesperidum的L-阿拉伯糖异构酶（简称Alhe-LAI酶）作为亲本，利用基因突变技术，将其478位的天冬氨酸Asp替换为天冬酰胺Asn，获得单突变体酶D478N；酶反应的最适pH由原来的7.0降至6.0；在酸性条件下，酶反应的底物D-半乳糖转化为D-塔格糖的平衡转化率由15%提高至20%；同时突变体酶D478N的催化活性提高，更适于产物D-塔格糖的生成，具有重要的工业应用价值。
【专利说明】一种催化活性提高且最适pH降低的L-阿拉伯糖异构酶的 突变体酶D478N
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种催化活性提高且最适pH降低的L-阿拉伯糖异构酶（Alhe-LAI)的 突变体酶D478N，属于酶的基因工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002] D-塔格糖是近年发现的一种具有特殊保健功能的功能性甜味剂。D-塔格糖属于 天然稀有糖的一种，在许多食品中都发现少量存在，如高温灭菌牛奶、奶酪、酸奶及其它奶 制品等。2000年美国食品与药物管理局（FDA)确定D-塔格糖为普遍公认安全食品（GRAS)， 并正式批准作为甜味剂用于食品饮料业以及医药制剂中；随后联合国粮农组织和世界卫生 组织联合食品添加剂委员会（JECFA)第57次会议批准D-塔格糖作为食品添加剂；欧盟也 于2003年批准D-塔格糖在欧洲上市。
[0003] 目前，国内对于D-塔格糖生产的研究还处于起步阶段，国外对其研究已较为深 入，生产方法主要有两种：化学法和生物法。但目前市售的D-塔格糖都是由化学法生产的。 由于一方面化学法生产存在许多不利因素，如化学污染物多，碱性条件下异构化反应副产 物多，分离困难等；另一方面由于消费者消费观念的转变，天然食品的需求日益增长，因此 近年来对D-塔格糖生产的研究集中在生物法上。研究发现L-阿拉伯糖异构酶可以催化 D-半乳糖转化为D-塔格糖，是目前生物法生产D-塔格糖最为有效的途径。D-半乳糖与 D-塔格糖之间异构反应的平衡受温度影响很大，较高温条件下（60°C以上）更有利于D-塔 格糖的生成，因此耐热性的L-阿拉伯糖异构酶将具有更好的应用前景。
[0004] 目前，已有很多菌属被鉴定具有L-阿拉伯糖异构酶的基因（araA)，例如 Mycobacterium smegmatis (J Bacteriol, 1978, 133 (1) :413 - 414) > Escherichia coli (World J Microbiol Biotechnol, 2003, 19 (1) : 47 - 51) > i?. stearothermophilus US100 (Biochim Biophys Acta, 2006, 1760: \9\-\99) ^ Lactobacillus sakei 23K (Bioresource Technology 101, 2010, 9171 - 9177)及 Bifidobacterium longum (Bioprocess Biosyst Eng, 2013, 36:489 - 497)等菌属均具有L_阿拉伯糖异构酶的基 因，被鉴定出来具有表达L-阿拉伯糖异构酶的功能。近年来，对于L-阿拉伯糖异构酶的研 究热点集中在嗜热及耐酸微生物。因为温度和酸性环境是催化反应的一个重要因素，高温 及酸性环境利于D-塔格糖的合成，并减少副产物的生成。因此，为获得更适合的生物催化 齐U，通过定点突变的方法，对来自嗜热菌的Alhe-LAI酶进行分子改造，进一步提高其催化 活性，并降低了酶反应的最适PH，以期得到酶学性质更适合工业应用的Alhe-LAI酶。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种催化活性提高且最适pH降低的L-阿拉伯糖异构酶的突 变体酶，对D-塔格糖的生产有重要的意义。
[0006] 本发明的技术方案，一种催化活性提高且最适pH降低的L-阿拉伯糖异构酶 Alhe-LAI的突变体酶D478N，将来源于的L-阿拉伯糖异构 酶进行突变得到单突变体酶；将原来Alhe-LAI酶基因中第478位的天冬氨酸Asp替换为天 冬酰胺Asn，获得单突变体酶，命名为D478N。
[0007] 与野生型酶Alhe-LAI相比，所述Alhe-LAI的突变体酶D478N反应的最适pH由原 来的7. 0降低至6. 0 ;在酸性条件下，酶反应的底物D-半乳糖平衡转化率由15%提高至20% ; 突变体酶D478N的催化活性提高。
[0008] 一种重组表达质粒pET-22b(+)-D478N，其中含有所述的Alhe-LAI的突变体酶 D478N基因。
[0009] 一种表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，其被含有Alhe-LAI的突变体酶D478N基因的 重组表达质粒pET-22b (+) -D478N转化。
[0010] 所述来源于微生物的 Alhe-LAI 基因在GenBank 的 编号为NZ_AKZN01000011. 1，基因全长1494个核苷酸，见序列表中SEQ ID No:l;编码498 个氨基酸，见序列表中SEQ ID No:2。
[0011] 所述Alhe-LAI的突变体酶是将其478位氨基酸天冬氨酸Asp突变为天冬酰胺 Asn，命名为D478N，见序列表中SEQ ID No:4。D478N的核苷酸序列见SEQ ID No:3。
[0012] Alhe-LAI酶的突变体酶D478N的制备方法，其具体步骤为： (1) 在的Alhe-LAI酶模拟结构的基础上确定突变位 占. (2) 设计定点突变的突变引物，以携带Alhe-LAI酶基因的载体pET-22b ( + )-Alhe-LAI 为模板进行定点突变构建突变质粒pET-22b (+) -D478N ; 突变引物如下所示，下划线为突变点： 上游外侧引物：5' -TTATCCATAT GGAGGATGCA AACATGCAT-3'， 下游外侧引物：5' -TATATCTCGA GCCGATAACA CACTTCATT-3'， 正向突变引物：5' - GTGATCAATC AGACGACGAA TCC-3'，下划线为突变碱基， 反向突变引物：5' -TCGTCTGATT GATCACGATG C - 3'，下划线为突变碱基； (3) 将突变质粒pET-22b (+) -D478N转化大肠杆菌BL21 (DE3)细胞，挑选验证后的阳性 单克隆进行发酵培养； (4) 离心菌体，重悬后超声破碎，阴离子交换柱纯化得到突变体酶D478N。
[0013] 突变体酶D478N的应用：应用于化学、食品和制药领域，最适反应pH为6.0,使得 底物D-半乳糖的平衡转化率提高。
[0014] 本发明的有益效果：本发明提供一种催化活性提高且最适pH降低的Alhe-LAI酶 的突变体酶D478N，其最适反应pH为6. 0,明显低于野生型Alhe-LAI酶的最适反应pH7. 0 ; 在酸性条件下，底物D-半乳糖的平衡转化率明显提高，较适于D-塔格糖的工业化生产，同 时突变体酶D478N的催化活性有所提高，在化学、食品和制药领域中具有重要的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1突变体酶D478N和野生型酶Alhe-LAI，pH对酶活影响对比示意图。
[0016] 图2突变体酶D478N和野生型酶Alhe-LAI对底物D-半乳糖的转化率对比示意图。
【具体实施方式】
[0017] 实施例1 :Alhe-LAI酶耐酸性突变体制备方法 利用快速PCR定点突变的方法构建pET-22b (+) -D478N突变质粒； pET-22b(+)-D478N突变质粒的构建：以pET-22b(+)-Alhe-LAI质粒为模板，经PCR1， PCR2及PCR3，引入D478N定点突变，测序验证结果表明除了所需突变位点外，没有出现随机 突变，因此突变质粒pET-22b (+)-D478N构建成功。
[0018] 突变引物如下所示：（下划线为突变点） 上游外侧引物：5' -TTATCCATAT GGAGGATGCA AACATGCAT-3'， 下游外侧引物：5' -TATATCTCGA GCCGATAACA CACTTCATT-3'， 正向突变引物：5' - GTGATCAATC AGACGACGAA TCC-3'，下划线为突变碱基， 反向突变引物：5' -TCGTCTGATT GATCACGATG C - 3'，下划线为突变碱基， PCR 1 :反应体系的组成： 以带有L-阿拉伯糖异构酶目的基因的克隆载体pET-22b ( + ) -Alhe-LAI为模版。
【权利要求】
1. 一种催化活性提高且最适pH降低的L-阿拉伯糖异构酶Alhe-LAI的突变体酶 D478N，其特征在于：将来源于的L-阿拉伯糖异构酶进行突 变得到单突变体酶；即将原来Alhe-LAI酶基因中的第478位天冬氨酸Asp替换为天冬酰胺 Asn，获得单突变体酶，命名为D478N。
2. 权利要求1所述催化活性提高且最适pH降低的L-阿拉伯糖异构酶Alhe-LAI的突 变体酶D478N的制备方法，其特征在于步骤为： (1) 在的Alhe-LAI酶模拟结构的基础上确定突变位 占 . ^ \\\ ? (2) 设计定点突变的突变引物，以携带Alhe-LAI酶基因的载体pET-22b ( + )-Alhe-LAI 为模板进行定点突变构建突变质粒pET-22b (+) -D478N ; 突变引物如下所示，下划线为突变点： 上游外侧引物：5' -TTATCCATAT GGAGGATGCA AACATGCAT-3'， 下游外侧引物：5' -TATATCTCGA GCCGATAACA CACTTCATT-3'， 正向突变引物：5' - GTGATCAATC AGACGACGAA TCC-3'，下划线为突变碱基， 反向突变引物：5' -TCGTCTGATT GATCACGATG C - 3'，下划线为突变碱基； (3) 将突变质粒pET-22b (+) -D478N转化大肠杆菌BL21 (DE3)细胞，挑选验证后的阳性 单克隆进行发酵培养； (4) 离心菌体，重悬后超声破碎，阴离子交换柱纯化得到突变体酶D478N。
3. 根据权利要求2所述催化活性提高且最适pH降低的L-阿拉伯糖异构酶Alhe-LAI 的突变体酶D478N的制备方法，其特征在于：步骤（2)所述突变质粒pET-22b (+)-D478N含 有Alhe-LAI的突变体酶D478N基因。
4. 权利要求1所述催化活性提高且最适pH降低的L-阿拉伯糖异构酶Alhe-LAI的突 变体酶D478N的应用，其特征在于：应用于化学、食品和制药领域，最适反应pH为6. 0,使得 底物D-半乳糖的平衡转化率提高。
【文档编号】C12N15/70GK104152430SQ201410438619
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年9月1日 优先权日:2014年9月1日
【发明者】沐万孟, 江波, 范晨, 张涛 申请人:江南大学