一种基于脂肪酸去饱和酶基因的抗寒转基因烟草的构建方法

一种基于脂肪酸去饱和酶基因的抗寒转基因烟草的构建方法
【专利摘要】本发明提供了一种基于脂肪酸去饱和酶基因的抗寒转基因烟草的构建方法，首先，利用RT-PCR法扩增出了菠菜的硬脂酰基载体蛋白去饱和酶基因(SAD)，连接该基因至植物遗传转化载体pBI121上；经核苷酸序列分析克隆并重组正确的载体转化至农杆菌Agrobacterium?tumefaciens?LBA4404中；含重组质粒的农杆菌以叶盘法转化烟草无菌苗外植体，筛选出卡那霉素抗性植株并移栽于花盆中，生长成熟后收集种子；种子播种于含卡那霉素的MS培养基上使其萌发生长；从卡那霉素抗性植株的叶片提取核DNA进行PCR检测、点杂交及Southern杂交鉴定；最后，以分子鉴定的阳性转基因烟草作为实验材料，在低温胁迫下，分别进行电导率测定和叶绿素含量测定，转SAD基因烟草的抗寒性有明显的改善。
【专利说明】一种基于脂肪酸去饱和酶基因的抗寒转基因烟草的构建方 法

【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程【技术领域】，尤其涉及一种基于脂肪酸去饱和酶基因的抗寒转 基因烟草的构建方法。

【背景技术】
[0002] 植物尤其是农作物的抗寒性问题一直是国内外研究的热点。倘若农作物在较低的 温度下也能够正常生长，这对农作物抵抗低温寒害、尤其是对防止我国农作物种植中的倒 春寒、早霜等农业灾害具有重大的经济意义。
[0003] 已有的研究结果表明，植物抵御低温胁迫的能力与植物细胞的膜脂不饱和度呈正 相关性，也就是说，膜脂的不饱和度越高，则植物对低温环境的抵抗力越强。硬脂酰基载体 蛋白去饱和酶（SAD)是植物脂肪酸去饱和代谢过程的关键酶，它催化植物最主要的脂肪 酸--硬脂酸的第一个去饱和反应，并通过随后的一系列去饱和反应提高植物细胞、尤其 是植物细胞膜上的脂酰基的不饱和度，从而提高植物的抗寒能力。
[0004] 以往对植物寒害的生理学与生物化学研究阐明了植物遭受寒害的过程与机理，t匕 如，零上低温对植物伤害的主要原发部位是细胞膜、膜脂不饱和度与寒害程度密切相关。然 而，目前尚未见国内外通过导入高表达硬脂酰基载体蛋白去饱和酶基因来改良植物抗寒性 的报道。


【发明内容】

[0005] 本发明的目的在于提供一种基于脂肪酸去饱和酶基因的抗寒转基因烟草的构建 方法，旨在解决植物在零上低温条件下遭受伤害的问题。
[0006] 本发明是这样实现的，一种基于脂肪酸去饱和酶基因的抗寒转基因烟草的构建方 法，包括以下步骤：
[0007] (1)利用RT-PCR法扩增出的菠菜硬脂酰基载体蛋白去饱和酶基因连接至植物遗 传转化载体pBI 121上；
[0008] (2)将核苷酸序列测定正确的重组载体转化至农杆菌Agrobacterium tumefaciens LBA4404中并鉴定阳性转化菌落；
[0009] (3)将阳性转化子浸染烟草叶盘，形成愈伤组织并分化出芽后，在抗性MS培养基 (含100mg/L Km，500mg/L CB)上进行诱导生根，待根长达数厘米时，移栽于盛有营养土的花 盆中，在自然光下生长；提取卡那霉素抗性植株的叶片DNA进行点杂交及Southern杂交，确 定SAD基因导入的烟草植株；
[0010] (4)以SAD基因导入的转基因烟草作为实验材料，-20°C冷冻40分钟后置于室温 下，测定叶绿素含量随时间的变化；室温（27°C)下培养的转基因烟草移至6°C生长，测定电 导率随时间的变化；以转SAD基因烟草的叶绿素含量和电导率变化判断转基因烟草的抗寒 性是否有明显改善。
[0011] 在步骤⑴中，所述RT-PCR法扩增所用引物为：
[0012] 上游引物：5 ' -AGATTCGAACAATGGCTCTGAATCTCAACC-3 '，
[0013] 下游引物：5 ' -AGATCTAGAACTCAAAGCTTTACTTG-3 '。
[0014] 本发明利用基因工程技术，提供了一种抗寒性转基因烟草的制备方法，通过将一 个能够提高植物抗寒性的基因即菠菜硬脂酰基载体蛋白去饱和酶基因（SAD)转化至烟草 植株并进行了抗寒性分析。结果表明，构建的转SAD基因烟草的抗寒性具有显著改善。

【专利附图】

【附图说明】
[0015] 图1是菠菜SAD基因 RT-PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中，1 :DNA分子量 标志（BamH I+Hind III digested λ DNA) ;2:RT-PCR 扩增产物。
[0016] 图2是重组质粒pBI 121-13(含正向SAD基因 ），pBI 121-6(含反义SAD基因）经酶 切后的琼脂糖凝胶电泳图。其中，1 :重组质粒PBI121-13经Xba I酶切后的琼脂糖凝胶电 泳图；2 :pBI121-6经Xba I酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；3 :DNA分子量标志（BamH I+Hind III digested λDNA)〇
[0017] 图3是卡那霉素抗性烟草植株的DNA点杂交图，以NOS终止子区域为探针。其中， A:重组载体pBI121-13转化的烟草植株1至6号；B:重组载体pBI121-13转化的烟草植株 8至13号；C:a - b为重组载体pBI 121-13转化的烟草植株14至15号；c - f为重组载体 pBI 121-6转化的烟草植株1至4号；D: a -b为重组载体pBI 121-13转化的样品1至2号； c - d为未转化的烟草植株（阴性对照），f为pBI121空载质粒转化的烟草植株（阳性对 照）。
[0018] 图4是转基因烟草的Southern杂交分析图。其中，泳道1 :含有⑶S+N0STOT片段的 阳性对照；泳道2 :pBI121质粒；泳道3、4、7、8 :用重组质粒pBI121-13转化的2号、13号、9 号、14号植株；泳道5、6、9、10 :用重组质粒pBI 121-6转化的3号、4号、1号、2号植株。

【具体实施方式】
[0019] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0020] 实施例1植物遗传转化载体的构建
[0021] 硬脂酰基载体蛋白去饱和酶（SAD)是植物脂肪酸去饱和代谢过程的关键酶，而细 胞膜脂的不饱和度又与植物的抗寒性呈正相关。SAD基因在植物中表达较低，SAD酶是硬 脂酰去饱和的第一步，也是随后一系列去饱和反应的限速步骤。所以本发明将克隆到的菠 菜SAD基因插入到CaMV的35S启动子下游，构建成可高效表达SAD基因的植物遗传转化 载体PBI121-13。同时将反义的SAD基因也构建至pBI121，获得重组植物遗传转化载体 pBI 121-6,作为阴性对照。
[0022] 首先，用酚/氯仿抽提法提取菠菜总RNA，根据GenBank的菠菜SAD基因的cDNA序 列设计并合成一对特异性引物，用于SAD基因的克隆：
[0023] 上游引物：5 ' -AGATTCGAACAATGGCTCTGAATCTCAACC-3 '，
[0024] 下游引物：5' -AGATCTAGAACTCAAAGCTTTACTTG-3' ；
[0025] 用合成的这一对引物及提取的菠菜总RNA进行RT-PCR扩增。经0. 8 %琼脂糖凝胶 电泳检测，得到一条约1. 2Kb的扩增产物（图1)。
[0026] 将植物双元表达载体pBI121和纯化后的RT-PCR产物分别经CSP45I和Xbal双酶 切，用T4DNA连接酶将线性化的载体和PCR产物进行16度过夜连接，再将连接产物转化至 大肠杆菌（Escherichia coli)DH5a菌株，37°C培养过夜。次日挑选阳性菌落进行培养、制 备重组质粒。重组质粒经酶切后进行0.8%琼脂糖凝胶电泳，检测有无插入片段及片段大小 (图2)。通过对重组质粒上插入的DNA片段进行核苷酸序列测定并与SAD基因序列比对， 结果表明扩增出来的DNA片段是SAD基因的cDNA。所得到的重组质粒命名为pBI121-13。 同时，利用上述方法，将反义的SAD基因也克隆在pBI121载体上，所得重组质粒命名为 PBI121-6。
[0027] 实施例2pBI 121、pBI 121-13、pBI 121-6等植物遗传转化载体转化烟草
[0028] 取出储存于 _70°C冰箱的农杆菌 Agrobacterium tumefaciens LBA4404,划线于 YEB平板上，28°C培养，直至长出单菌落。挑取单菌落于5ml YEB培养基中，28°C，250rpm培 养过夜。取2ml接种于40ml YEB中继续培养。约3小时后，倒入预冷的离心管中，冰浴30 分钟，6000rpm离心10分钟，沉淀悬浮于lmlO. 1M CaCl2溶液中，吸取200 μ 1分装于预冷的 离心管中，分别加入约800ng ρΒΙ121，ρΒΙ121-13，ρΒΙ121-6。冰浴5分钟，置于液氮中8分 钟，取出后立即放入37°C水浴5分钟，加入ΥΕΒ至lml，28°C、250rpm培养4?5小时，离心， 沉淀悬浮于200μ1 YEB中，涂布于含有卡那霉素（50yg/ml)的LB平板上，28°C培养，直至 长出单菌落。挑取单菌落接种于含有卡那霉素（50yg/ml)的液体LB培养基中，待到生长 至对数期，提取质粒并电泳检测。
[0029] 将上述以冻融法导入了植物遗传转化载体pBI121，pBI121-13, pBI121-6的农杆 菌菌株进行筛选并鉴定阳性转化子。挑取阳性农杆菌单菌落分别接种于5ml含卡那霉素 (50yg/ml)的YEB培养基中，28°C、250rpm培养至0D6QQ = 0. 8?1.0,离心收集菌体，用MS 培养基洗涤后，调节菌体浓度到〇D_ = 0. 5?0. 6。将烟草（革新29号）无菌叶片切成 lcm见方小块，浸于不同农杆菌悬液中，5?7分钟，然后置于MS平板上，28°C光照培养三天 后，将转化处理的叶盘置于MS培养液中，5?7分钟后，再转到MS平板，25°C培养，光/暗为 12h/12h，直至形成愈伤并分化出芽。将顺利分化出的芽切割并转接至MS固体培养基中，诱 导生根，待根长达数厘米时，移栽至盛有营养土的花盆中，于实验室自然光照下使其生长。 当长至6?7片叶时，取植株叶片提取核DNA进行分子鉴定。
[0030] 实施例3点杂交及Southern杂交筛选转基因烟草
[0031] 准备杂交用尼龙膜，将尼龙膜用双蒸水浸湿，在2X SSC溶液中浸泡5分钟，抽滤点 样，加150 μ 12X SSC冲洗，待DNA完全干燥，放置在用0. 4MNaOH饱和的滤纸上变性5分钟， 然后再用2XSSC饱和的滤纸中和5分钟，80°C真空烘箱中烤膜1小时，干燥处存放备用。
[0032] 将pBI121质粒用BamHI和EcoRI双酶切，电泳检查酶切完全后，用低熔点琼脂糖 胶电泳回收⑶S+N0S Te,片段作为探针DNA。探针DNA的放射性标记，采用Random Primer方 法标记。
[0033] 杂交：将放射性标记的DNA探针100°C煮沸5分钟，冰浴冷却，加 EDTA至20mM。倒出 预杂交液，加入杂交液，加入探针，42°C杂交16?24小时。洗膜与放射自显影：弃去杂交液， 杂交膜先用2X SSC+0. 5% SDS溶液冲洗一次，再在室温下洗涤5分钟，再用2X SSC+0. 1% SDS洗涤5分钟，最后在68°C于0. IX SSC+O. 5%SDS中洗涤30分钟，并用0. IX SSC洗去 SDS，然后用滤纸吸去尼龙膜残留液，包上保鲜膜，压上X-光片及增感屏于-70°C放射自显 影，2?3天后显影X-光片。
[0034] 选取经卡那霉素抗性筛选出来的pBI 121-13, pBI 121-6, pBI 121转化植株及2株未 遗传转化植株做对照，提取叶片DNA并进行点杂交实验。根据点杂交结果（图3)，选杂交 信号最强的PBI121-13转化植株的2、13号，pBI121-6转化的3、4号提取核DNA做双酶切； PBI121-13转化的9、4号和pBI121-6转化的1、2号提取核DNA做单酶切。以Gus+N0STOT为 探针进行Southern杂交检测。Southern杂交结果表明，双酶切样品在2. 0Kb的位置有一条 杂交带，单酶切样品在不同位置有多条杂交带（图4)。说明这些植物是转基因植物，且为多 个拷贝。
[0035] 实施例4对照烟草和转SAD基因烟草的抗寒性分析
[0036] 电导率变化测定：将Southern杂交呈阳性的62, 63, 64, 139, 1315, 1314植株及未经遗 传转化的植株（对照），从室温（约27°C)、光下移至6°C、黑暗的培养箱中。分别于40小 时、88小时后测室温下和低温下植株的电导率。然后将植株转移至室温（约27°C )，自然光 下，48小时后测电导率。
[0037] 取大小相近的叶片，用打孔器打取10?15个小圆片，放入10mlddH20中，斜放在 摇床上摇lh，测电导，然后沸水煮15分钟，冷却后测电导，以煮沸前电导值占煮沸后电导值 的百分率为每种植物的相对电导率。
[0038] 叶绿素含量测定：从Southern杂交呈阳性的62, 63, 64, 139, 1315, 1314植株及未经遗 传转化的植株（对照）上，各剪取大小，叶龄一致的两片叶子，放入一次性使用的薄膜手套 中，封口。其中一片置于-20°C冷冻40分钟，取出后放于室温（约27°C )下，另一片叶保持 于室温下作对照。4天后测叶绿素含量。
[0039] 取lg左右叶片组织，加少量0&0)3及80%的丙酮，研磨至匀楽，过滤。再用80%丙 酮洗研钵数次并将洗液过滤合并，用80%丙酮定容滤液至10ml。在652nm波长下测0D值， 计算叶绿素的总量。比较各组叶绿素含量的变化。
[0040] 低温处理前各组烟草叶片的相对电导率基本一致。6度下40小时后，各组的电导 率出现差异、但相对较小。低温处理88小时后，对照组和pBI121-6转化植株组的相对电导 率都明显升高。而PBI121-13转化植株组的相对导电率始终保持在较低的水平（表1)。
[0041] 表1不同温度下对照组和处理组的电导率
[0042]

【权利要求】
1. 一种基于脂肪酸去饱和酶基因的抗寒转基因烟草的构建方法，其特征在于、包括以 下步骤： (1) 利用RT-PCR法扩增出的菠菜硬脂酰基载体蛋白去饱和酶基因连接至植物遗传转 化载体PBI121上； (2) 将核苷酸序列测定正确的重组载体转化至农杆菌Agrobacterium tumefaciens LBA4404中并鉴定阳性转化菌落； (3) 将阳性转化子浸染烟草叶盘，形成愈伤组织并分化出芽后，在抗性MS培养基（含 100mg/L Km，500mg/LCB)上进行诱导生根，待根长达数厘米时，移栽于盛有营养土的花盆 中，在自然光下生长；提取卡那霉素抗性植株的叶片DNA进行点杂交及Southern杂交，确定 SAD基因导入的烟草植株； (4) 以SAD基因导入的转基因烟草作为实验材料，-20°C冷冻40分钟后置于室温下，测 定叶绿素含量随时间的变化；室温（27°C )下培养的转基因烟草移至6°C生长，测定电导率 随时间的变化；以转SAD基因烟草的叶绿素含量和电导率变化判断转基因烟草的抗寒性是 否有明显改善。
2. 如权利要求1所述的基于脂肪酸去饱和酶基因的抗寒转基因烟草的构建方法，其特 征在于，在步骤（1)中，所述RT-PCR法扩增所用引物为： 上游引物：5' -AGATTCGAACAATGGCTCTGAATCTCAACC-3'， 下游引物：5' -AGATCTAGAACTCAAAGCTTTACTTG-3'。
【文档编号】C12N15/84GK104195169SQ201410438235
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月29日 优先权日:2014年8月29日
【发明者】马建忠, 刘丹, 肖成斌, 马燕林, 王永刚, 张伟杰 申请人:兰州理工大学