重组人参超氧化物歧化酶的制备方法

重组人参超氧化物歧化酶的制备方法
【专利摘要】本发明提供一种适合大肠杆菌分泌表达重组人参超氧化物歧化酶(recombinant ginseng superoxide dismutase，rgSOD)的信号肽核苷酸序列和编码人参SOD的SOD核苷酸序列、含有上述核苷酸序列的载体、含有前述载体的工程细胞以及从该工程细胞纯化rgSOD的方法。优化后的超氧化物歧化酶基因非常适合大肠杆菌表达，具有高表达、高稳定、高分泌的特点。本发明可高效、简便、低成本地获得rgSOD纯品。本发明还包括通过上述方法制备的重组人参超氧化物歧化酶在制备治疗与人老化相关疾病或病理症状的药物、食品、保健品及其化妆品中的应用。CGMCC No97432014.09.29
【专利说明】重组人参超氧化物歧化酶的制备方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及大肠杆菌分泌表达重组人参超氧化物歧化酶的编码信号肽的核苷酸 序列和编码人参S0D的核苷酸序列、含有上述核苷酸序列的载体、含有前述载体的工程细 胞和从该工程细胞纯化rcSOD的方法及其用途，属于基因工程和蛋白质生物化学领域。

【背景技术】
[0002] 超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase,EC1. 15. 1. 1，S0D)是一种广泛存在于动 植物、微生物中的金属酶。能催化生物体内超氧自由基（〇2〇发生歧化反应，是机体内〇 2i勺 天然消除剂（黎瑞珍，杨庆建，陈贻锐.超氧化物歧化酶（S0D)活性的测定及其应用研 究.海南琼州大学学报，2004年10月28日：34-36)。从而清除0 2_，在生物体的自我保护系 统中起着极为重要的作用。S0D是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过 程中产生的有害物质。对人体不断地补充S0D具有抗衰老的特殊效果（朱汉民，王赞舜.衰 老机理研究中的超氧物岐化酶.国外医学老年病分册，1985. (1) :49?54 ;胡文荛，钟福 孙，韩宪法等.正常人、高血脂症、心血管病血中过氧化脂质和超氧物岐化酶的分析.生化 药物杂志，1988 (2) : 48?50)。超氧化物歧化酶是1938年Marn等人首次从牛红血球中分 离得到超氧化物歧化酶开始算起，人们对S0D的研究己有七十多年的历史。1969年McCord 等重新发现这种蛋白，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反 应的性质，所以正式将其命名为超氧化物歧化酶。S0D几乎从人到细胞，从动物到植物，都有 它的存在（Reiss.Ratliversuperoxidedismutasepurificationandagerelat edmodification.EuropanJ.Biochem. 1976, 63:617 ?623)，按其所含金属辅基不同可 分为三种，第一种是含铜（Cu)锌（Zn)金属辅基的称（Cu.Zn-S0D)，最为常见的一种酶，呈绿 色，主要存在于机体细胞浆中；第二种是是含锰（Mn)金属辅基的称（Mn-S0D)，呈紫色，存在 于真核细胞的线粒体和原核细胞内；第三种是含铁（Fe)金属辅基的称（Fe-SOD)，呈黄褐 色，存在于原核细胞中。
[0003] 人参超氧化物歧化酶（Cu/Zn型）蛋白全长152个氨基酸，单个肽链分子量为 15. 3KD，以二聚体形式存在。
[0004] 伴随生物科学技术的发展，人们开始了基因工程法表达S0D，但在大肠杆菌中表达 S0D往往以无活性的包涵体形式存在，虽然人们尝试了诸多复性方法，终究因为成本高、复 性率低等原因，很难实现工业化大规模生产要求。后来，科研工作者探讨了利用真核生物酵 母分泌表达，获得了较为满意的结果，目前，上市的重组S0D，均用大肠杆菌胞内表达或酵母 表达生产，虽然采用高密度发酵，但表达水平低，加上由此带来的复杂的纯化工艺（需要反 相层析），产率较低，此低产率不能满足市场需求。除了应用大肠杆菌表达系统外，人们也试 图利用芽孢杆菌、啤酒酵母以及哺乳动物细胞等表达系统生产S0D。采用真核表达系统能够 实现S0D的活性，但遗憾的是，因为表达水平低、成本高等因素，目前几乎没有人采用这些 表达系统来生产S0D。而大肠杆菌分泌表达系统的研究是其中最重要的趋势。
[0005] 本发明人通过多次筛选，发现了一个可用于分泌表达人参超氧化物歧化酶蛋白的 分泌信号肽段编码的基因（SEQIDNO: 1)，与人参超氧化物歧化酶编码基因（SEQIDNO: 3)融合形成信号肽-人参超氧化物歧化酶编码基因，构建原核表达载体后，转入大肠杆菌 BL21(DE3)细胞中，从而实现了rgSOD的高水平分泌表达rgSOD，在此基础上完成了本发明。
[0006] 本发明系统优化、改变了获得S0D的大肠杆菌工程细胞的方法，利用大肠杆菌基 因表达的分泌肽段与S0D融合表达获得了更为满意的结果，并通过发酵工艺的改进，同时 简便纯化工艺，获得高表达、高得率、高活性极具产业化价值的一种rgSOD生产方法。


【发明内容】

[0007] 基于现有技术的缺欠，本发明的目的是提供编码上述信号肽的核苷酸序列、含有 该信号肽核苷酸序列和人参S0D核苷酸序列的载体、含有前述载体的工程细胞以及从该工 程细胞纯化rgSOD的方法。
[0008] 本发明的发明人惊奇地发现，在表达如SEQIDN0 :3所示的人参S0D核苷酸序列 前，加入如SEQIDN0:1所示的信号肽核苷酸序列，可以意外地获得高融合表达的人参S0D 的载体，且使用该载体表达的SOD易于纯化，纯度高、收量大，活性高。
[0009] 在本发明的又一个方面，提供了一种在编码人参超氧化物歧化酶的核苷酸序列前 加入一个能使人参超氧化物歧化酶表达后分泌到细胞壁与原生质膜间隙的分泌肽段核酸 序列，所述的核苷酸序列SEQIDNO: 1能够编码SEQIDN0 :2所示的氨基酸序列，而且所述 核苷酸序列SEQIDNO: 1与人参超氧化物歧化酶编码区序列SEQIDN0 :3融合形成核苷酸 序列SEQIDN0 :5。
[0010] 在本发明的再一个方面，提供了一种表达载体，它含有本发明上述的核苷酸序列。 优选地，所述表达载体为pET22b。
[0011] 在本发明的再一个方面，提供了一种工程细胞，它是通过所述表达载体序列转化 宿主细胞而获得的，且表达载体中整合有编码重组超氧化物歧化酶的核苷酸序列。
[0012] 优选地，所述的工程细胞是大肠杆菌菌株为BL21 (DE3)。
[0013] 在本发明的进一步方面，提供了 一种生产人参超氧化物歧化酶的表达方法，包括 以下步骤：在适合表达条件下，培养本发明上述的宿主细胞，从而分泌表达人参超氧化物歧 化酶；优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌菌株为BL21 (DE3)。所述培养包括：培养分为培养 阶段和诱导阶段，培养阶段培养菌液浓度达到0D600,诱导期时间为18-21hr，发酵及诱导 温度保持在16_25°C，IPTG用量为0. 05-lmM/L，诱导期的pH值为6-8。所述大肠杆菌宿主 细胞包括可以用IPTG诱导合成人参超氧化物歧化酶，并且能够分泌到细胞壁与原生质膜 间隙的大肠杆菌细胞。
[0014] 在本发明的另一个方面，对表达后重组人参S0D进行了粗提和进一步纯化。其包 括如下步骤：（1)对发酵样品通过离心和/或过滤方式收集菌体，用溶菌酶处理菌体，再通 过离心方法获得清液，（2)通过盐析和/或超滤进行初步纯化后，或直接通过阴离子交换、 疏水层析方法，获得纯度达到95%以上（如95-99. 9% )的纯品，本发明所制备的重组人参 S0D活性在5500U、或6000U以上。
[0015] 在本发明的另一个方面，本发明提供使用上述方法制备的重组人参S0D在制备治 疗与人超氧化物歧化酶相关疾病或病理症状的药物、食品、保健品及其化妆品中的用途。所 述重组人参超氧化物歧化酶含有任一如下氨基酸序列：
[0016]a)SEQIDNO. 2所示氨基酸序列；和/或 [0017]b)SEQIDNO. 4所示氨基酸序列；或 [0018]c)SEQIDNO. 6所示氨基酸序列。
[0019]本发明的主要优点在于：（1)优化后的链接分泌信号肽基因非常适合大肠杆菌表 达，具有高表达、高稳定、高分泌的特点；（2)含有分泌信号肽的超氧化物歧化酶基因的宿 主菌株具有高密度生长的特性，非常适于基因工程药物大规模高密度的发酵生产。大肠杆 菌表达的hgSOD以可溶性、具活性形式分泌到细胞壁与原生质膜间隙；产物不须复性，可以 直接进行纯化；同时由于表达水平高，纯化工艺复杂程度大大简化，得率得到大幅度提高； (3)与真核系统表达相比，成本大大降低，产业化价值得到大幅度提升。

【专利附图】

【附图说明】
[0020] 图1显示用于编码本发明信号肽的核苷酸序列。
[0021] 图2本发明信号肽的氨基酸序列。
[0022] 图3显示用于编码本发明天然人参S0D的核苷酸序列。
[0023] 图4本发明天然人参S0D的氨基酸序列。
[0024] 图5显示用于编码本发明重组人参S0D的核苷酸序列。
[0025] 图6本发明重组人参S0D的氨基酸序列。
[0026] 图7用于编码本发明信号肽的核苷酸序列和由其推定的本发明信号肽的氨基酸 序列的对应图。
[0027] 图8用于编码本发明融和表达的重组人参S0D的核苷酸序列和由其推定的本发明 融和表达的重组人参S0D的氨基酸序列的对应图。
[0028] 图9是本发明的一种表达质粒pET-rgSOD的构建示意图。
[0029] 图10是摇瓶37°C条件下rgSOD表达电泳图。各泳道如下：泳道1、诱导前；泳道 2、诱导后，诱导4小时取样，SDS-PAGE电泳检测表达情况。
[0030] 图11是在不同温度条件下（IPTG浓度为lmM/L)rgS0D表达电泳图。诱导20小 时后，收集菌体，用溶菌酶在37°C条件下，处理2小时，15000rpm离心10分钟，取上清， SDS-PAGE检测表达情况。
[0031] 图12是IPTG浓度对rgSOD表达水平的影响。在20°C条件下，分别用0. 6mM、0. 4mM、 0. 2mM、0.ImM浓度的IPTG诱导表达。诱导20小时后，收集菌体，用溶菌酶在37°C条件下， 处理2小时，15000rpm离心10分钟，取上清，SDS-PAGE检测表达情况。
[0032] 图13是在6. 5L发酵罐中rgSOD的表达情况电泳图。各泳道如下：泳道1、诱导前 取样；泳道2、诱导20小时取样。
[0033] 图14是纯化后的rgSOD的电泳图。在6. 5L发酵罐中表达rgSOD，收集菌体，用溶 菌酶在37°C条件下，处理2小时，15000rpm离心10分钟，取上清，用阴离子交换层析、疏水 层析以后的蛋白SDS-PAGE电泳图。

【具体实施方式】
[0034] 为了提供对本发明的实质性理解，在下文中以不同的详细程度描述了本发明的某 些方面、模式、实施方式、变型和特征。
[0035] 在实施本发明的过程中，使用了分子生物学、基因工程学、遗传学、细胞分子 生物学、生物化学、蛋白质生物化学、蛋白质生物化学工程、制药工艺学、医学、生理学、 病理学、动物实验学，Sambrook等（MolecularCloning:ALaboratoryManual, 2nd edition, 1989,ColdSpringHarborLaboratoryPress)等很多传统技术和基础理论。这 些技术是熟知的。
[0036] 在本发明的一个实施方式中，提供了一种重组人参超氧化物歧化酶，其中，所述 人参超氧化物歧化酶包含任一如下氨基酸序列：
[0037]a)SEQIDN0. 2所示氨基酸序列；和/或
[0038]b)SEQIDN0. 4所示氨基酸序列；或
[0039]c)SEQIDN0.6所示氨基酸序列。
[0040] 在本发明的又一个实施方式中，通过分子克隆提供编码所述信号肽和人参超氧化 物歧化酶的核苷酸序列。
[0041] 本发明的术语"核苷酸序列"包括基因组DNA、CDNA、合成的DNA和RNA。优选地， 其指DNA，更优选为编码序列的cDNA。本发明还涵盖编码具有如本文所定义的特定性质的 酶或蛋白的核苷酸序列。本文所用的术语"核苷酸序列"是指寡核苷酸序列或多核苷酸序 列和其变体、同源物、片段和衍生物（如其部分）。所述核苷酸序列可以是源自基因组或合 成物或重组物，其可以是双链的或单链的（无论其代表正义链还是反义链）核酸分子。
[0042] 在本发明的一个【具体实施方式】中，提供了一种分离的核酸分子，其中，所述分离的 核酸分子包含任一如下核苷酸序列：
[0043]a)编码SEQIDN0:2的氨基酸序列的SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列；和/或
[0044]b)编码SEQIDN0:4的氨基酸序列的SEQIDN0. 3所示的核苷酸序列；或
[0045]c)编码SEQIDN0:6的氨基酸序列的SEQIDN0. 5所示的核苷酸序列。
[0046] 编码具有如本文所定义的酶或蛋白的核苷酸序列可以从产生所述酶或蛋白的任 何细胞或生物中分离得到。用于分离核苷酸序列的各种方法都是本领域熟知的。本文仅为 举例性质，例如利用强变性剂提取总RNA，利用转录和反转录方法，产生所述酶或蛋白的生 物的染色体DNA或信使RNA(mRNA)来构建基因组DNA和/或cDNA文库。
[0047] 还有，也可以通过成熟的标准方法通过合成来制备编码所述酶或蛋白的核苷酸序 列，再如，利用自动DNA合成仪上合成寡核苷酸，然后将其纯化、退火、连接并克隆到适当的 载体中。
[0048] 因此，所述核苷酸序列可以是源自混合的基因组和合成来源、混合的合成和cDNA 来源、或混合的基因组和cDNA来源，其根据标准技术通过连接源自合成的、基因组的或 cDNA的片段根据需要而制得。每个连接的片段对应于整个核苷酸序列的不同部分。所述 DNA序列也可以使用特定引物通过聚合酶链式反应（PCR)来制备。
[0049] 本文中术语"PCR"被称之为聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR) 是指在DNA聚合酶的催化下，通过变性、退伙，聚合扩增等反复循环达到几何数量级扩增位 于两段已知序列之间的DNA区段。
[0050] 可以使用本发明的多核苷酸（核苷酸序列）制备引物，如PCR引物，用于可选扩增 反应的引物；或可以将多核苷酸克隆到载体中。所述引物、和其它片段的长度可以是至少 12个、如至少15个，优选为至少20个、如至少25个、30个、35个或40个核苷酸，且其也涵 盖在如本文所用的术语多核苷酸之内。
[0051] 通常，使用重组DNA技术（即重组的DNA)制备编码具有如本文所定义的特定性质 的酶或蛋白的核苷酸序列。因此，在本发明的一个可选实施方式中，可以使用本领域已知的 化学方法来合成全部或部分核苷酸序列。
[0052] 通常，可通过合成方法来制备引物，该方法包括以每次一个核苷酸的方式逐步制 备所需要的核酸序列。本领域中易于获得使用自动化技术来实现上述方法的技术。引物 设计可以根据提高纯度需要考虑在目的蛋白N端或C端的核苷酸序列加入编码标签蛋 白（Tagged-proteinexpressionsystem)的核苷酸序列，常见的标签蛋白包括但不限于 His-tag蛋白，Flag-tag蛋白，GST-tag蛋白等。
[0053] 可以重组、合成或通过本领域技术人员可利用的任何方法来制备根据本发明的多 核苷酸（如DNA多核苷酸）。它们也可以通过标准技术进行克隆。通常使用重组方法，如使 用PCR(聚合酶链式反应）克隆技术来制备较长的多核苷酸。这包括制备位于所需要克隆 的脂质靶向序列区域侧翼的一对引物（如约12至40个核苷酸），使引物接触从人参中获 得的mRNA或cDNA，在可以使所需区域扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增的片段 (如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物），并回收扩增的DNA。可以设计引入使其包含适 合的限制性酶识别位点，以便可以将扩增的DNA克隆到适合的克隆载体中。
[0054] 如上所述，可以重组、合成或通过本领域技术人员可利用的任何方法来制备根据 本发明的多核苷酸（如DNA多核苷酸）。它们也可以通过标准技术进行克隆。通常使用重 组方法，如使用PCR(聚合酶链式反应）克隆技术来制备较长的多核苷酸。这包括制备位于 所需要克隆的脂质靶向序列区域侧翼的一对引物（如约15至30个核苷酸），使引物接触从 人参中获得的mRNA或cDNA，在可以使所需区域扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩 增的片段（如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物），并回收扩增的DNA。可以设计引入使 其包含适合的限制性酶识别位点，以便可以将扩增的DNA克隆到适合的克隆载体中。酶切 位点的设计可以根据载体克隆位点和编码具有本文所定义的特定性质的酶或蛋白的核苷 酸序列来设定，往往在前面加入若干个保护碱基，详细可以参考PR0MEGA公司提供的保护 喊基设定参考手册。
[0055] 在本发明的一个【具体实施方式】中，所述人参超氧化物歧化酶通过表达任一以下所 示的核苷酸序列而获得：
[0056]a)编码SEQIDN0:2的氨基酸序列的SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列；和/或
[0057]b)编码SEQIDN0:4的氨基酸序列的SEQIDN0. 3所示的核苷酸序列；或
[0058]c)编码SEQIDN0:6的氨基酸序列的SEQIDN0. 5所示的核苷酸序列。
[0059] 术语"构建体"，即指构建的载体，其包含载体载体本身的核苷酸序列和依照本发 明使用的编码具有本文所定义的特定性质的酶或蛋白的核苷酸序列，且其直接或间接地与 启动子连接。在一些【具体实施方式】中，优选构建体至少包含本发明的核苷酸序列，或编码具 有如本文定义的特定性质的酶或蛋白且可操作地与启动子连接的核苷酸序列。
[0060] 术语"表达载体"是指能够在体内或体外表达的构建体。其包含载体本身的核苷 酸序列和依照本发明使用的编码具有本文所定义的特定性质的酶或蛋白的核苷酸序列，且 其直接或间接地与强启动子连接。优选地，本发明的表达载体包含载体本身的核苷酸序列 和所述信号肽-人参S0D结合的核苷酸序列，表达载体可以被引入到生物（如大肠杆菌宿 主生物）的基因组中。术语"引入"优选涵盖稳定的引入到基因组中。
[0061] 在本发明的一个【具体实施方式】中，提供了 一种表达载体，其中所述表达载体含有 任一如下核苷酸序列：
[0062]a)SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列；和/或
[0063]b)SEQIDN0. 3所示的核苷酸序列；或
[0064]c)SEQIDN0. 5所不的核苷酸序列。
[0065] 优选地，所述表达载体为pET22b。
[0066] 如本文所定义的编码人参SOD的核苷酸序列和信号肽序列可以存在于载体中，在 该载体中所述核苷酸序列可操作地连接到调控序列，使得所述调控序列能够通过适合的宿 主细胞（如大肠杆菌）表达所述核苷酸序列，即所述载体是表达载体。本发明的载体可以 被转化到上述的适合宿主细胞中，以表达具有如本文所定义的编码人参S0D活性的酶或蛋 白。通常根据其将被引入的宿主细胞来选择载体（如质粒、粘粒、病毒或噬菌体载体、基因 组插入物）。本发明可以涵盖发挥等同功能且本领域已知或可知的其它形式的表达载体。 一旦转化到所选择的宿主细胞中，载体可以不依赖宿主细胞的基因组而复制并发挥功能， 或可以自行整合进入基因组。
[0067] 所述载体可以包含一个或多个选择性标记基因，如提供抗生素抗性的基因，如提 供氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性或四环素抗性的基因。载体可以在体外使 用，例如，用于制备RNA或用于转染或转化宿主细胞。
[0068] 表达载体可以进一步包含能使该载体在所述宿主细胞中复制的核苷酸序列。所述 载体可以是PET1 -46系列载体（N0VAGEN公司）、pGEX系列载体、pUC系列载体、pACYC系列 载体、pUB系列载体、pE系列载体、pAMB系列载体和plj系列载体。优选为pET系列载体， 最优选为pET22b。
[0069] 上述核苷酸序列的检测是通过核苷酸序列测序仪来完成，同时通过各种分子 生物学软件来分析所得到的基因是否是目的基因。常用分析软件有GENTYX，Vector NTI，GenDOC，DNAman，也可以借助于BLAST和FASTA进行离线和/或在线搜索和检索分析用 以比对核苷酸序列和蛋白质序列。
[0070] 本文所使用的术语"酶"与术语"氨基酸序列"和/或术语"多肽"和/或术语"蛋 白"同义。在一些实例中，术语"氨基酸序列"与术语"肽"和/或"酶"同义，可以互为替代 使用。
[0071] 本文所使用的术语"重组人参S0D"与术语"融和表达的重组人参S0D"同义。
[0072] 本文术语"信号肽"是根据所用的序列和/或载体，通过由宿主细胞表达编码人参 S0D的核苷酸序列所产生的人参S0D可以被分泌出或包含在细胞内。信号序列可以用于指 导编码序列分泌通过特定的细胞膜。所述信号序列对人参S0D编码序列来说可以是天然的 或外源的。可以使用能够指导所表达的人参S0D进入所选宿主细胞（优选为大肠杆菌BL21 宿主细胞）分泌途径的任何信号肽编码序列。
[0073] 用于本发明任一方法和/或应用中的编码人参S0D的核苷酸序列可以编码天然的 人参S0D或人参S0D变体。例如，用于本发明的编码人参S0D的核苷酸序列可以是中所述 的一种。NCBI这些文献通过引用并入本文。
[0074] 本文所用的术语"人参S0D"优选地是指具有催化超氧自由基转化为过氧化氢和产 生氧气功能的酶。
[0075] 优选地，用于本发明任一方法和/或应用中的人参S0D是能够将各种有机体内的 超氧自由基转化为过氧化氢和产生氧气功能。所述有机体包括但不限于动物、植物和微生 物。首选为动物，优选为人类。
[0076] 在本发明的一些实施方式中，可以将编码信号肽的核苷酸序列可操作地连接到编 码所选人参S0D的核苷酸序列。所选人参S0D可以在本文所定义的宿主细胞中作为融合蛋 白表达。
[0077] 本发明还涵盖由用于本发明任一方法和/或应用中的编码人参超氧化物歧化酶 的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。
[0078] 本发明提供了一种特别适合在大肠杆菌细胞中表达的人参超氧化物歧化酶的分 泌肽段编码序列。该序列是根据大肠杆菌密码子偏爱性等原则而筛选出的。设计出的专门 为rgSOD分泌表达的编码序列用常规方法进行全基因合成，或通过PCR方法实现的。
[0079] 本文中的术语"细胞"包含本发明的核苷酸序列或编码具有如本文定义的特定性 质的酶或蛋白的核苷酸序列和/或由其获得的产物的任何细胞，其与术语"生物"和/或术 语"细菌"和/或术语"微生物"和/或术语"细菌微生物"同义，互为替换使用。如在背景 技术所描述的含有编码天然人参S0D酶的天然核苷酸序列的天然人参植物细胞也包含在 本文术语"细胞"内。
[0080] 与本发明有关的术语"工程细胞"或"转化的宿主细胞"包括任何包含编码具有如 本文定义的特定性质的酶或蛋白的核苷酸序列和/或由其获得的产物的细胞，和/或其中 启动子能够允许编码具有如本文定义的特定性质的酶或蛋白的核苷酸序列在所述生物内 表达。优选核苷酸序列被引入到生物的基因组中。术语"转基因生物"不涵盖在处于自身 天然环境中并同时受到其同处于自身天然环境中的天然启动子控制的天然核苷酸编码序 列。因此，本发明的转基因生物包括包含以下任何一种或组合的生物：编码具有如本文定义 的特定性质的酶或蛋白的核苷酸序列、本文定义的构建体、本文定义的载体、本文定义的质 粒、本文定的细胞或其产物。例如，所述转基因生物还可以包含编码具有如本文定义的特定 性质的酶或蛋白且受到启动子控制的核苷酸序列，其中所述启动子原本并不与重组人参超 氧化物歧化酶编码基因相连。
[0081] 在本发明的再一个实施方式中，提供一种工程细胞，其中所述工程细胞是通过转 化上述表达载体进入宿主细胞后获得的细菌细胞。
[0082] 所述宿主微生物可以是原核或真核生物。本发明的人参S0D或者编码人参S0D的 核苷酸序列可获自于，包括但不限于以下属的细菌微生物：埃希氏菌属（Escherichia)、分 枝杆菌属（Mycobacterium)、链球菌属（Streptococcus)、乳杆菌属（Lactobacillus)、脱亚 硫酸菌属 ?esulfitobacterium)、芽抱杆菌属（Bacillus)、弯曲杆菌属（Campylobacter)、 弧菌属（Vibrionaceae)、木杆菌属（Xylella)、硫化叶菌属（Sulfolobus)、气单胞菌 属（Aeromonas)、链霉菌属（Streptomyces)、酵母菌属（Saccharomyces)、乳球菌属 (Lactococcus)、、曲霉属（Aspergillus)、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces)、李斯特菌 属（Listeria)、奈瑟氏球菌属（Neisseria)、中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium)、雷尔氏菌 属（Ralstonia)、黄单胞菌属（Xanthomonas)和假丝酵母属（Candida);优选为埃希氏菌属 (Escherichia).优选为埃希氏菌属（Escherichia)。
[0083]适宜地，本发明的人参SOD或者编码人参SOD的核苷酸序列可以获自于，优选 获自于以下细菌微生物：大肠杆菌（E.coli)、芽孢杆菌（Bacillussp)、空肠弯曲杆菌 (Campylobacterjejuni)、弧菌（Vibrionaceae)、苛养木杆菌（Xylellafastidiosa)、硫 横矿硫叶菌（Sulfolobussolfataricus)、酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)、嗜 水气单胞菌（Aeromonashydrophila)、杀鲑气单胞菌（Aeromonassalmonicida)、天蓝 色链霉菌（Streptomycescoelicolor)、龟裂链霉菌（Streptomycesrimosus)、分枝杆菌 (Mycobacterium)、化胺性链球菌（Streptococcuspyogenes)、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis)、青枯雷尔氏菌（Ralstoniasolanacearum)、野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris)、地毯草黄单胞菌（Xanthomonasaxonopodis)、近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis)、嗜热链球菌（Streptococcusthermophilus)、瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus)、脱齒脱亚硫酸菌（Desulfitobacteriumdehalogenans)、土曲霉（Aspergillus terreus)、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe)、无害李斯特菌（Listeria innocua)、单核细胞增多性李斯特菌（Listeriamonocytogenes)、脑膜炎奈瑟氏球菌 (Neisseriameningitidis)、百脉根中慢生根瘤菌（Mesorhizobiumloti)。优选为大肠杆 菌细胞，更优选为BL21 (ED3)大肠杆菌细胞。
[0084] 在本发明的一些实施例中，制备了一些感受态细胞以利于体外载体转入到宿主细 胞中。常用制备感受态细胞包括低温处理。例如16°C。
[0085] 再者，适合用于本发明的宿主生物也可以为植物。因此，本发明还涉及产生具有增 强S0D表达水平的转基因植物的方法，其包括以下步骤：利用本文定义的人参过氧化物歧 化酶（尤其是利用包含本文定义的人参过氧化物歧化酶的表达载体或构建体）转化植物细 胞，和由转化的植物细胞培养出植物。
[0086] 在一个实施方式中，根据本发明的人参S0D可以是可获自于，优选获自于大肠杆 菌BL21JZY001(分类命名：大肠埃希氏菌，EscherichiaColi)的人参S0D，所述大肠杆菌 菌株JZY001由吉林省金梓源生物技术有限公司根据国际承认用于专利程序的微生物保 藏布达佩斯条约保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心ChinaGeneral MicrobiologicalCultureCollectionCenter(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号中国科学院微生物研究所，邮政编码：1〇〇1〇1)保藏日为2014年09月29日，保藏号为 CGMCC9743。
[0087] 在本发明的一些实施方式中，对适合本发明的细菌微生物的菌种、培养条件、诱导 条件和表达发酵条件等进行了实验性研究，所述条件还包括溶氧、转速和温度等外部各种 条件。
[0088] 在获得工程细胞后，便可在适合的条件下培养工程细胞。凡适合于大肠杆菌生长、 表达的培养基都可用于本发明。例如，合适的培养基包括但并不限于以下培养基：LB、马铃 薯糖琼脂培养基、豆芽汁培养基、豌豆琼脂培养基、马铃薯-蔗糖-琼脂培养基、马铃薯-蔗 糖-琼脂培养基等，优选为LB培养基。
[0089] 溶氧条件都可以控制，适合的溶氧控制在20-90%。溶氧的维持可以用氧气、空气 混合气体的通入来解决。
[0090] 在另一优选例中，本发明还通过发酵工艺优化，进一步优化了rgSOD的表达条件。 由于表达水平高，达到l〇〇mg/L以上，且为可溶性表达，给纯化工艺带来极大便利，通过二 步层析工艺，大幅度提商广品得率，得到了表达量商、比活性商、提纯方便、得率商和性状稳 定的rgSOD产品，大大降低生产成本，非常适合大规模生产。
[0091] 在优化基因的5'端与3'端分别引进特异性酶切位点，用分子克隆的常规方法， 将优化基因克隆入表达载体（如pET28、pET22等）。然后，转化入BL21(DE3)宿主细胞，用 IPTG诱导，摇瓶表达选出高表达工程细胞。
[0092] 在获得工程细胞后，便可在适合的条件下培养工程细胞。凡适合于大肠杆菌生长、 表达的培养基都可用于本发明。例如，合适的培养基包括（但并不限于）以下培养基：
[0093] -种优选的摇瓶培养条件是：挑取LB平板上的单克隆，以LB为摇瓶培养液，培养 至0D600,用IPTG诱导表达，诱导18-21小时，rgSOD产量可达50-200mg/L。
[0094] 为了大规模生产rgSOD，需要在发酵罐上培养工程细胞，表达rgSOD，因此对大肠 杆菌BL21 (DE3)工程细胞的中试表达条件进行优化，发酵规模从1L到300L，发酵能力呈线 性放大。优化后表达量大于400mg/L发酵物。
[0095] 经过本发明的反复实验，表达条件进行优化如下：
[0096] 1.对于培养基的选择而言，发酵罐发酵时可选择无机盐培养基，也可在无机盐培 养基基础上进行一定更改，但所含离子成份宜与无机盐培养基相似。
[0097] 2.就温度的控制而言，rgSOD的发酵及诱导温度保持在16-25°C。
[0098] 3.就诱导期的pH值而言，诱导期pH控制在6-8;
[0099] 4.就溶氧（D0)的控制而言，D0控制在20-90%。溶氧的维持可以用氧气/空气 混合气体的通入来解决。
[0100] 5.就补料的流加而言，补料种类宜包括淀粉、葡萄糖等碳源，可单独补料或混合补 料。
[0101] 6.就诱导期IPTG浓度而言，常规诱导浓度都可用于本发明，通常IPTG浓度控制在 0.l-lmM/L〇
[0102] 7.就氨苄西林使用量而言，要求100mg-400mg，能够有效地抑制杂菌生长。
[0103] 8.就诱导时间而言，没有特别限制，通常为18-21小时，较佳地为20小时。
[0104] 在本发明的一些实施方式中，从发酵的细菌中抽提人参S0D蛋白。该抽提过程就 是所述的粗提，具体包括收集菌体，离心获得生物量，破壁溶出蛋白，盐析、过滤等步骤。
[0105] 表达的rgSOD存在于细胞壁与原生质膜之间，表达水平大于200mg/L发酵物， 使纯化复杂度大大下降。通常，发酵样品先以离心或过滤等方式收集细胞，然后用溶菌 酶（4-10mg/g菌体）溶解细胞壁多糖，使目标蛋白进入上清液体中，上清液含目的蛋白质 rgSOD。上清液可通过盐析、超滤等方法进行初步纯化后再进行层析纯化，也可直接进行层 析纯化，所述盐析为用0-60%中性硫酸铵分级粗提蛋白，超滤用超滤膜进行过滤，例如用截 留分子量为10KD的超滤膜进行过滤。
[0106] 在本发明的一些实施方式中，对粗提后的蛋白进行进一步纯化。层析技术包括 阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析等技术。经不同层 析技术、层析过程比较，优化的层析方法包括：1.阴离子交换层析：阴离子交换层析介 质包括但不限于Q-Sepharose、DEAE-Sepharose。如果发酵样品的盐浓度较高，影响与离 子交换介质的结合，则在进行离子交换层析前需降低盐浓度。样品可以用稀释、超滤、透 析、凝胶过滤层析等手段进行平衡缓冲液的更换，直至与对应的离子交换柱平衡液系统 相似，然后上样，进行盐浓度或pH的梯度洗脱；2.疏水层析：疏水层析介质包括但不限于Phenyl-Sepharose、Butyl-Sepharose、Octyle_Sepharose。样品通过添加NaCl、（NH4)2S04 等方式提高盐浓度，然后上样，通过降低盐浓度方法洗脱。通过疏水层析除去疏水性有较 大差异的杂蛋白。3?凝胶过滤层析疏水层析介质包括（但不限于）Sephacryl、Superdex、 Sephadex类。通过凝胶过滤层析更换缓冲体系，或进一步精纯。
[0107] 经过上述纯化可得到rgSOD纯品，纯化得率通常为40%以上，纯度95%以上，纯品 得率约200mg/L培养物。
[0108] 纯化后的rgSOD可用常规方法制成各种剂型，如冻干粉针剂。选择一定的稳定剂， 同时还可添加表面活性剂、抗氧化剂等保护剂，及适当缓冲液进行冷冻干燥。得到的制品具 有活性损失小、水分含量低、稳定性好、易于长期保存等特点。rgSOD还可做成水针剂、喷雾 齐U、微球缓释剂，以及经PEG修饰制成长效制剂等。
[0109] 在本发明的一个实例中，构建了rgSOD的BL21(ED3)表达工程细胞，IPTG诱导，高 水平分泌表达rgSOD，不需复性。
[0110] 在本发明的另一个实例中，经过发酵参数优化，提高rgSOD的表达水平。
[0111] 因表达蛋白属于胞外分泌型，不需破菌处理。在本发明的另一个实例中，经过纯 化，得到rgSOD纯品，纯化得率50 %以上，纯度95 %以上，纯品得率约200mg/L培养物。
[0112] 在本发明又一个实施方式中，纯化后原液加入适当辅料，制成rgSOD的注射用粉 针剂。稳定性试验表明，该粉针剂稳定。
[0113] 优选地，所述孵育温度和孵育时间的组合可以有效保证至少5%的S0D活性，优选 至少 10% 的S0D活性，优选至少 15%、20%、25%、26%、28%、30%、40%、50%、60% 或 75% 的酶或蛋白活性。
[0114] 在再一个实施方式中，样品经10KD膜包超滤浓缩置换缓冲液、QSepharose F.F.以及phenylsepharoseF.F.层析以后得到纯度大于95%、得率在50%以上的纯品。
[0115] 综上所述，在一个完整的【具体实施方式】中，本发明提供了一种制备重组人参超氧 化物歧化酶的方法，其中，所述方法包括如下步骤：
[0116]a)将如下的任一核苷酸序列克隆入表达载体pET22b的步骤，所述的核苷酸序列 为：SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列，和/或SEQIDN0. 3所示的核苷酸序列，或SEQID NO. 5所示的核苷酸序列；
[0117]b)将所述表达载体pET22b转入到宿主细胞大肠杆菌BL21 (ED3)细胞的步骤；
[0118]c)将宿主细胞大肠杆菌BL21 (ED3)细胞进行培养步骤，培养条件包括：培养分为 培养阶段和诱导阶段，培养阶段培养菌液浓度达到0D600,诱导时间为18-21hr，发酵及诱 导温度保持在16_25°C，诱导期IPTG浓度在0. 1-0. 2mM/L;
[0119]d)分离纯化出融核表达的重组人参超氧化物歧化酶的步骤，对发酵样品通过离心 和/或过滤方式收集菌体，用溶菌酶lmg/g菌体，在37°C条件下，处理2小时，再通过离心获 得清液；
[0120] e)通过盐析和/或超滤进行初步纯化步骤，所述盐析为用0-60 %中性硫酸铵分级 粗提蛋白，超滤用超滤膜进行过滤，所述超滤膜为截留分子量为10KD的超滤膜；
[0121]f)通过阴离子交换、疏水层析方法，从而获得纯度达到95-99. 9%的重组人参超 氧化物歧化酶的步骤。
[0122] 在本发明的另一个实施方式中，提供使用上述方法制备的人参SOD在制备治疗与 人超氧化物歧化酶相关疾病或病理症状的药物、食品、保健品及其化妆品中的用途。所述重 组人参超氧化物歧化酶含有任一如下氨基酸序列 ：
[0123]a)SEQIDN0. 2所示氨基酸序列；和/或
[0124]b)SEQIDN0. 4所示氨基酸序列；或
[0125]c)SEQIDN0.6所示氨基酸序列。
[0126] 上述相关疾病或病理症状包括但不限于：白内障、退化性眼底病变，新生儿视网膜 病变、异位性皮肤炎、色素沉着黑斑、老人斑、皮肤过敏、高血压、动脉硬化、心肌梗塞、心肌 无力、心律不整、鼻子过敏、气喘、肺气肿、肺纤维化、成人呼吸窘迫症、老年痴呆、帕金森氏 症、脑循环障碍、镰刀型贫血、蚕豆症、铅中毒、肾脏病、蛋白尿、膀胱炎、摄护腺肥大、肾丝球 发炎、便秘、口臭、糖尿病及共并发症、风湿性关节炎、癌症、化疗副作用手术、器官移植、肝 炎、更年期、衰老病（aging,老化）等。
[0127] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，例如Sambrook等，分子克隆实验指南（NewYork:ColdSpringHarborLaboratory Press, 1989) ;Jan-ChristerJanson等，ProteinPurification(JohnWiley&Sonss,Inc., 1998)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0128] 实施例
[0129] 实施例1.rgSOD大肠杆菌表达载体的构建：
[0130] 分泌肽段基因参考大肠杆菌K12菌株分泌蛋白和SEQIDN0:2(图2)所示膜蛋白 信号肽设计，并全基因合成的，其序列如SEQIDN0 :1所示的DNA片段（图1)。其中用于 编码本发明信号肽的核苷酸序列与其演绎的本发明信号肽的氨基酸序列见图7。同时在其 5'端引入Ndel酶切位点。如SEQIDN0 :4所示天然人参超氧化物歧化酶的氨基酸序列 (图4)和SEQIDN0 :3所示核苷酸序列是已知的（图3)，如NCBI的Genbank登陆号分别为 AF034630. 1和AAB87572,目的基因的获得是根据天然人参超氧化物歧化酶的氨基酸序列， 用常规基因合成法，在人参超氧化物歧化酶的氨基酸序列的5'端引入分泌肽段基因，并在 人参超氧化物歧化酶的氨基酸序列的3'端引入Xhol酶切位点，该基因SEQIDN0 :5(图 5)编码分泌肽-人参超氧化物歧化酶氨基酸序列如SEQIDN0 :6所示（图6)。用于编码 本发明融和表达的重组人参S0D的核苷酸序列及其演绎的本发明融和表达的重组人参S0D 的氣基酸序列对应关系见图8。
[0131] 表达质粒pET-rgSOD的构建及高表达工程细胞的获得构建过程如图9所示。合 成的分泌肽-超氧化物歧化酶全基因用Ndel+Xhol内切酶（来源于NEBBiolab)酶切，同 时将载体pET22b用相同的Ndel+Xhol进行酶切，然后用NEBTAKARADNA连接酶（solution 1，TAKARA，中国大连）连接入pET22b载体中，得到pET-rgSOD，测序证实DNA序列正确无 误。然后，将pET-rgSOD质粒，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，在37°C条件下，用IPTG诱导 4小时后确定表达人参超氧化物歧化酶（图10)。
[0132] 实施例2温度对rgSOD表达水平的影响
[0133] 取单克隆，接种到LB-级种子液中，培养17-20hr;取3只50mL培养管，按1 : 50 的比例分别接种于三只5mL培养基的50mL培养管中，培养4hr左右，ImM/LIPTG诱导，诱导 温度分别为16 °C、25 °C、37 °C，收集菌体，用溶菌酶在37 °C条件下，处理2小时，15000rpm离 心10分钟，取上清，SDS-PAGE检测表达情况。实验结果表明，在摇瓶中表达rgSOD在16°C、 25°C都几乎差不多，然而37°C表达分泌蛋白相对较少（图11)。
[0134] 实施例3IPTG浓度对rgSOD表达水平的影响
[0135] 取单克隆，接种到LB-级种子液中，培养17_20hr;按1 : 50的比例分别接种于5 只装有5mL培养基的50mL培养管中，37°C培养4hr左右，冷却到20°C，分别加入IPTG，使培 养基中浓度为〇. 6mM、0. 4mM、0. 2mM、0.ImM诱导，收集菌体，用溶菌酶在37°C条件下，处理2 小时，15000rpm离心10分钟，取上清，SDS-PAGE检测表达情况。实验结果表明，几个梯度浓 度IPTG诱导rgSOD表达量差不多，用0.ImM的IPTG浓度诱导比较经济，节约成本（图12)。
[0136] 实施例4.中试发酵条件选择及优化NBSBioFlo3000发酵罐（6. 5L)经过上述优 化后，rgSOD表达量约为300mg/L发酵液，表达量明显增加（图13)。
[0137] 实施例5.rgSOD纯化实施例4的发酵物4°C下5000rpm离心10分钟，收集菌体，用 溶菌酶溶解菌体，溶解酶使用量为lmg/g菌体，37°C温浴2小时。离15000rpm离心去除菌 体，收集澄清液。使用Millipore超滤器，超滤膜截流分子量为10KD，超滤时留取回流液。 上清超滤至体积剩下500ml左右，加入以10mM磷酸盐缓冲液（PB，pH7. 4)，继续超滤；反复 此程序，直至样品的电导水平和10mMPB(pH7. 4)缓冲液的电导水平接近。
[0138] 阴离子交换层析：层析介质：QSepharoseF.F. (Phamarcia)缓冲液：溶液A:10mM PBS(pH7. 4)，溶液B:10mMPB+1MNaCl(pH7. 4)上样：将超滤浓缩的rgSOD溶液（1L左右， 电导为4000uS/cm左右）上样清洗：上样后用6CV(柱体积，下同）的溶液A清洗层析柱梯 度：清洗后直接用30%溶液B洗脱目标蛋白收集：收集30%B洗脱下的蛋白层析。
[0139]疏水层析：phenyl-sepharose(Phamarcia)缓冲液：溶液A: 10mMPBS(pH7. 4)，溶 液C:10mMPB+3MNaCl(pH7. 4)上样：将层析1得到的样品加入固体NaCl至3. 0M，上样梯 度：1〇〇%A直接清洗收集：收集100%A洗下的目的蛋白样品经过此2步层析，即阴离子交 换层析、疏水层析以后，纯度提高至95% (图14)、得率在50%以上的rgSOD纯品，纯品得率 200mg/L培养物。
[0140] S0D的活力测定方法
[0141] 改良的邻苯三酚自氧化法简单易行，较为实用。化学发光法和光化学扩增法不适 用于测定Mn-S0D，但对于Cu/Zn-S0D反应极灵敏。Cyte还原法用于Mn-S0D活力测定结果 稳定，重复性好。但专一性和灵敏度不够理想，而且需要特殊仪器，实际应用受到限制。亚 硝酸盐形成法与CN-抑制剂或SDS处理相结合，应用于Mn-S0D测定，灵敏度比Cyte还原法 提高数倍，而且专一性强，重复性好，操作方便，不需要特殊仪器和设备，易于实际应用和推 广，是目前较好的测定方法之一。通常情况下，S0D酶活性测定只能应用间接活性测定法。 根据S0D国家标准，本公司采用改良Marklund法，即邻苯三酚自氧化方法。
[0142] 1定义：25°C时抑制邻苯三酚自氧话速率50%时所需要的S0D量为一个活力单位。
[0143] 2原理：在碱性条件下，邻苯三酚会发生自氧化，可根据S0D抑制邻苯三酚自氧化 能力测定S0D活力。
[0144] 3试剂：A液：pH8.200.lmol/L三枪甲基氨基甲烷（Tris)-盐酸缓冲液（内含 lmmol/LEDTA.2Na)。称取 1.214gTris和 37.2mgEDTA.2Na溶于 62.4mL0.1mol/L盐 酸溶液中，用蒸馈水定容至l〇〇ml。B液：4. 5mmol/L邻苯三酚盐酸溶液。称取邻苯三酚 (A.R) 56. 7mg溶于少量lOmmol/L盐酸溶于，并定容至lOOmL。
[0145] 4仪器：紫外-可见分光光度计，机密酸度计，精确度0.OlpH，离心机，10mL比色 皿，10mL离心管，玻璃乳钵。
[0146] 5样品的制备：
[0147] 6分析步骤：邻苯三酚自氧化速率测定，在25°C左右，于10mL比色皿中一次加入A 液2. 35mL，蒸馏水2mL，B液0. 15mL。加入B液立即混合并倾入比色皿，分别测定在325波 长条件下初始和lmin后吸光值，二者之差即邻苯三酚自氧化速率AA^OnirT1).本试验确 定AAmOnirT1)为0. 060。S0D活性测定加样程序表如下：
[0148]

【权利要求】
1. 一种重组人参超氧化物歧化酶，其特征在于，所述人参超氧化物歧化酶包含任一如 下氨基酸序列： a) SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列；和/或 b) SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列；或 c) SEQ ID NO. 6所示氨基酸序列。
2. 分离的核酸分子，其特征在于，所述分离的核酸分子包含任一如下核苷酸序列： a) 编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列的SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；和/或 b) 编码SEQ ID N0:4的氨基酸序列的SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；或 c) 编码SEQ ID N0:6的氨基酸序列的SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。
3. -种重组人参超氧化物歧化酶，其特征在于，所述人参超氧化物歧化酶通过表达任 一以下所示的核苷酸序列而获得： a) 编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列的SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；和/或 b) 编码SEQ ID N0:4的氨基酸序列的SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；或 c) 编码SEQ ID N0:6的氨基酸序列的SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。
4. 一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有任一如下核苷酸序列： a) SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；和/或 b) SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；或 c) SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。
5. 如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pET22b。
6. -种工程细胞，其特征在于，所述工程细胞是通过转化权利要求4所述的表达载体 进入宿主细胞后获得的细菌细胞。
7. 如权利要求5所述的工程细胞，其特征在于，所述工程细胞为大肠杆菌BL21(ED3)细 胞。
8. -种制备重组人参超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，所述方法包括： a) 将权利要求3所述的任一核苷酸序列克隆入表达载体pET22b的步骤； b) 将所述表达载体pET22b转入到宿主细胞大肠杆菌BL21(ED3)细胞的步骤； c) 将宿主细胞大肠杆菌BL21(ED3)细胞进行培养步骤，培养条件包括：培养分为培养 阶段和诱导阶段，培养阶段培养菌液浓度达到0D600,诱导时间为18-21hr，发酵及诱导温 度保持在16-25°C，诱导期IPTG浓度在0. 1-0. 2mM/L ; d) 分离纯化出融核表达的重组人参超氧化物歧化酶的步骤，对发酵样品通过离心和/ 或过滤方式收集菌体，用溶菌酶lmg/g菌体，在37°C条件下，处理2小时，再通过离心获得清 液； e) 通过盐析和/或超滤进行初步纯化步骤，所述盐析为用0-60%中性硫酸铵分级粗提 蛋白，超滤用超滤膜进行过滤，所述超滤膜为截留分子量为10KD的超滤膜； f) 通过阴离子交换、疏水层析方法，从而获得纯度达到95-99. 9 %的重组人参超氧化 物歧化酶的步骤。
9. 重组人参超氧化物歧化酶在制备治疗与人超氧化物歧化酶相关疾病或病理症状的 药物、食品、保健品及其化妆品中的用途。
10. 如权利要求8所述的方法或权利要求10所述的用途，其特征在于，所述重组人参超 氧化物歧化酶含有任一如下氨基酸序列： a) SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列；和/或 b) SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列；或 c) SEQ ID NO. 6所示氨基酸序列。
【文档编号】C12N15/70GK104342409SQ201410535835
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2014年10月12日 优先权日:2014年6月17日
【发明者】刘爽, 邓小霞, 庞玉, 王子华, 孙晓悦 申请人:吉林省金梓源生物科技有限公司