一种高效处理典型生活污水的栅藻及其培养方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种高效处理典型生活污水的栅藻及其培养方法和应用。根据典型生活污水氮磷浓度配制培养基培养四尾栅藻SDEC-8直至稳定期收获藻体。结果表明四尾栅藻SDEC-8在配制的典型生活污水中的生长速率、油脂含量、生物柴油产量均高于在BG11培养液中培养。生活污水总氮总磷浓度分别为40mg·L-1,8mg·L-1时，四尾栅藻SDEC-8的油脂含量、脂肪酸甲酯含量和脂肪酸甲酯产率最高，生物柴油性质最好。此外，配制的典型生活污水经四尾栅藻SDEC-8处理后，氮磷可实现高效去除，出水可达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB 18918-2002)一级A限值TN<15mg·L-1，TP<0.5mg·L-1。本发明利用配制的典型生活污水培养四尾栅藻SDEC-8，氮磷高效去除的同时大量高效地获得了微藻生物柴油，降低了微藻培养成本。CCTCC NO: M201444820140928
【专利说明】一种高效处理典型生活污水的栅藻及其培养方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微藻生物【技术领域】，特别涉及一种高效处理典型生活污水的栅藻及其 培养方法和应用
【背景技术】
[0002] 近年来，由于全球石化燃料消费量激增，石化储量的减少，引起了世界范围内的能 源危机，再加上石化燃料燃烧排放二氧化碳带来的环境问题，因此，寻找一种廉价的绿色再 生能源已成为世界各国政府以及民众广泛关注的科学与社会问题。研究发现，某些藻类具 有含油量高，易于培养，单位面积产量大，不与农业争地等优点，被视为新一代的，甚至是唯 一能实现替代化石燃料的生物柴油原料。其含有的16碳和18碳的脂肪酸对于生物柴油的 生产最为有利。然而生产成本高是制约微藻生物柴油规模生产的主要因素。而筛选获得容 易培养、生长快、产油高的藻种是克服微藻规模化生产瓶颈的首要的一步。早在上世纪70 年代，美国就启动了耗资2500万美元由美国国家可再生能源实验室（NREL)运作的水生物 物种项目。NREL已从海洋和湖泊中分离到3000多种藻类，从中筛选出生长快、含有高的包 括硅藻、绿藻和蓝藻等藻种300多种，但当时未解决成本问题。世界上其它各国的研究者也 都利用各种手段积极地筛选寻找能适应商业化生产的优良藻种。近几年，国内多家实验室 已经开始分别在科技部、自然科学基金委以及大型企业的资助下，开展大规模采集和筛选 高产油藻株的工作，并且取得了一些进展。选自自然环境的微藻往往在温度、光照和盐度适 应方面具有一定的抗逆性，适于大量培养生产。同时为进一步降低生产成本，利用废水废气 培养微藻开始成为当前能源微藻资源开发的研究热点和难点。藻类可通过光合作用利用废 气和废水，不仅达到废水废气减排的目的，而且还可以通过利用废水废气培养微藻以降低 生产成本，具有商业化减排开发的可行性。
[0003] 目前，由于氮磷污染所导致的水体富营养化已成为全球普遍关注的问题之一。脱 氮除磷已成为污水处理中重要的一环。传统的物理、化学脱氮除磷工艺在污水处理应用中 很难达到高效、经济、低耗的要求。由于藻类具有光合速率高、生长速率快、环境适应性强、 吸附作用快的优点，利用其处理污水能够实现高效、低成本去除氮、磷等营养物质，如果对 藻类加以利用可以克服传统污水处理方法易引起二次污染，潜在营养物质丢失、资源不能 完全利用等弊端。因此，利用藻类净化污水正成为污水处理中重要的研究方向。
[0004] 因此，如果能寻求一种耦合污水生产微藻生物柴油和微藻净化污水的新方法，既 能实现污水处理，同时又能收获藻类生物质能源，具有非常重要的应用前景。
【发明内容】
[0005] 本发明目的就在于克服现有技术中的以上不足，提供一种高效处理典型生活污水 的栅藻及其培养方法和应用。该方法既可以提高微藻生物柴油产率和品质、降低微藻培养 成本，又可以实现污水资源化利用。配制的典型生活污水经四尾栅藻SDEC-8处理后，氮磷 可实现高效去除，出水可达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》（GB 18918-2002) -级A 限值 TN〈15mg · L-1，ΤΡ〈0· 5mg · L-1。技术方案如下：
[0006] 本发明首先提供了一种高效处理典型生活污水的栅藻，分离于济南市泉城公园富 营养化湖泊中，命名为Scenedesmus quadricauda SDEC-8,已保藏于中国典型培养物保藏 中心，其保藏编号为：CCTCC Ν0:Μ 2014448。保藏日期：2014年9月28日。地址：武汉，中 国典型培养物保藏中心（武汉大学）；邮编=430072 ;保藏编号：CCTCC Ν0:Μ 2014448。四尾 栅藻SDEC-8富含优质油脂，油脂含量可达到细胞干重的31. 8%，脂肪酸中饱和脂肪酸可达 到80%，可作为生物柴油原料。高十六烷值（61.38)和低碘值（29. 38gI2/100g)决定了以 该株微藻为原料制备的生物柴油具有很好的氧化安定性。
[0007] 在一个方面中，本发明提供了 一种四尾栅藻SDEC-8人工污水培养液，其成 份和用量为（NH4)2C0 368. 5 ?291. Img · Γ1，Κ2ΗΡ0422· 5 ?84. 3mg · Γ1，MgSO4 · 7H20 75mg · I71，CaCl2 · 2H20 36mg · I71，梓檬酸 6mg · I71，梓檬酸铁铵 6mg · I71，EDTANa2Img · I71， Naf0320mg · Γ1，Η3Β032· 86mg · Γ1，MnCl2 · 4H20 I. 86mg · Γ1，ZnSO4 · 7H20 0· 22mg · Γ1， Na2MoCM · 2H20 0· 39mg · Γ1，CuSO4 · 5H20 0· 08mg · Γ1，Co (NO3) 2 · 6H20 0· 05mg · Γ1，初始 pH 值在7?8之间，接种后的藻细胞密度为0. 35?0. 40X IO6Cells. mL-1。
[0008] 优选的是，所述培养基成份和用量为：(NH4) 2C03137mg · L-1，K2HP0445mg · L-1， MgSO4 · 7Η20 75mg · Ι71，CaCl2 · 2Η20 36mg · Ι71，梓檬酸 6mg · Ι71，梓檬酸铁铵 6mg · Ι71， EDTANa2Img · Γ1，Na2C0320mg · Γ1，Η3Β032· 86mg · Γ1，MnCl2 · 4H20 I. 86mg · Γ1，ZnSO4 · 7H20 0· 22mg · I/1，Na2MoCM · 2Η20 0· 39mg · I/1，CuSO4 · 5Η20 0· 08mg · I/1，Co(NO3)2 · 6Η20 0· 05mg · L_\初始pH值=7· 0,接种后的藻细胞密度为0· 38X IO6ceIls. mL'在配制中浓 度生活污水中即（NH4)2CO3浓度为137mg · L-1，K2HPO4浓度为45mg · L-1时，四尾栅藻SDEC-8 获得的油脂产率为53. 84mg · L-1Cf1,脂肪酸甲酯产率17. 53mg · L-1Cf1
[0009] 在另一个方面中，本发明提供一种四尾栅藻SDEC-8人工污水培养液的应用，所述 的培养液培养四尾栅藻SDEC-8,得到四尾栅藻SDEC-8细胞。
[0010] 在一个实施例方案中，所述四尾栅藻SDEC-8细胞的脂肪酸甲酯含量为 9. 55mg .g-1，饱和脂肪酸含量为80%，十六烷值为61. 38,碘值为29. 38gl2/100g。培养18 天后，离心分离收获四尾栅藻SDEC-8生物质，藻粉在60°C低温干燥后，对其中的脂肪酸组 分进行检测分析，发现使用典型生活污水（(NH 4)2C03137mg · ΙΛ K2HP0445mg · Γ1)培养的四 尾栅藻SDEC-8富含最优脂肪酸组分C18:1，大于其他文献报道的C18:1含量，并且四尾栅 藻SDEC-8生物柴油的低温流动性能得到很大提高，因此使用此方法培养出的普通四尾栅 藻SDEC-8是一种潜在的优质生物柴油原料。
[0011] 本发明还提供了一种培养四尾栅藻SDEC-8的培养方法，包括如下步骤：
[0012] a)将四尾栅藻SDEC-8接种于BGll培养基中进行无菌培养，制得四尾栅藻SDEC-8 种子液，培养条件为温度25 ± I °C，光照2000-3000Lux ;
[0013] b)根据典型生活污水水质，配制人工污水，其成份和用量为（NH4)2C0368.5? 291. Img · Γ1，Κ2ΗΡ0422· 5 ?84. 3mg · Γ1，MgSO4 · 7H20 75mg · Γ1，CaCl2 · 2H20 36mg · Γ1， 梓檬酸 6mg · I71，梓檬酸铁铵 6mg · I71，EDTANa2Img · I71，Na2C0320mg · I71，Η3Β032· 86mg · I71， MnCl2 · 4H20 I. 86mg · Γ1，ZnSO4 · 7H20 0· 22mg · Γ1，Na2MoCM · 2H20 0· 39mg · Γ1，CuSO4 · 5H20 0· 08mg ·ΙΛ(：ο(Ν03)2 ·6Η20 0· 05mg ·ΙΛ 并将其 pH 调节至 7. 0 后于 120°C高温灭菌 30min， 即得典型生活污水培养液；
[0014] c)将制得的四尾栅藻SDEC-8种子液接种于典型生活污水培养液中，接种后的藻 细胞密度约为〇. 35?0. 40 X IO6ceIls. mL'整个系统连续光照条件下通气恒温培养，培养 周期为18天，当达到选定培养时间后，离心即得培养后四尾栅藻SDEC-8细胞。
[0015] 优选的是，步骤C)中培养条件：培养温度为25土 TC，光照为2500LUX的连续光 照，曝气气液比为〇. 2vvm。四尾栅藻SDEC-8获得的油脂产率和生物柴油产率最高，分别 为53. 84mg. Per1，17. 53mg. Per1，接种后第三天，氮磷去除明显，总氮总磷去除率分别达到 74. 46%、65. 80%，培养至第18天时污水中氮磷几乎完全去除。
[0016] 本方明提供了四尾栅藻SDEC-8在处理受污染湖泊中的应用。四尾栅藻SDEC-8进 行含氮和/或含磷废水的净化的应用。四尾栅藻SDEC-8的生产应用，用于生产高效油脂、月旨 肪酸、蛋白质、淀粉、色素、多糖和/或核酸的应用。四尾栅藻SDEC-8基本上包含了 C14:0、 C16:0、C18:0和C18:1等脂肪酸，且C16和C18系含量高达96%，其中C16:0和C18:1的含 量丰富，从以上脂肪酸组成上分析符合制备生物柴油的要求。
[0017] 有益效果
[0018] 1.本发明模拟典型生活污水培养四尾栅藻SDEC-8,提供了一种污水资源化高效 利用的新途径，氮磷高效去除的同时大量地获得了微藻生物柴油，大大降低了四尾栅藻 SDEC-8生产和废水处理的综合成本，提高了四尾栅藻SDEC-8的油脂产率和生物柴油产量， 带来更大的经济效益。
[0019] 2.本发明模拟典型生活污水培养四尾栅藻SDEC-8,不仅提高了四尾栅藻SDEC-8 的油脂产率，还提高了四尾栅藻SDEC-8的生物柴油品质，在良好的氧化安定性能下，优化 了低温流动性能，为生物柴油的规模化生产提供一种优质生物柴油原料。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1 :四尾栅藻SDEC-8在系统关系树中的位置。
[0021] 图2 :四尾栅藻SDEC-8的显微形态学照片。
[0022] 图3 :18S rRNA的PCR扩增产物电泳照片。
[0023] 图4 :四尾栅藻SDEC-8在三个不同氮磷浓度污水中的生长曲线。
[0024] 图5 :四尾栅藻SDEC-8在三个不同氮磷浓度污水中的脱氮效果。
[0025] 图6 :四尾栅藻SDEC-8在三个不同氮磷浓度污水中的除磷效果。
[0026] 其中，1光学显微照片，2扫描电子显微照片、比例尺6 μ m，3、4透射电子显微照片、 比例尺500nm. c,叶绿体；m,线粒体；η,细胞核；py,蛋白核；s,淀粉粒；V，液泡；A代表四 尾栅藻SDEC-8。
【具体实施方式】
[0027] 以下通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规的方法和条件进行选 择。
[0028] 实施例1四尾栅藻SDEC-8分离鉴定：
[0029] 一、样品采集
[0030] 2012年7月从山东省济南市泉城公园富营养化湖泊采集含有绿藻的水样。
[0031] 二、四尾栅藻SDEC-8的分离纯化
[0032] 分离纯化步骤：通过血球板计数法在显微镜下对植物园水样计数，将藻液密度稀 释到约3000个/ml。在超净实验台上，将BGll固体培养液倒平板（已放置过夜，无杂菌生 长），将待分离的藻液使用医用喉头喷雾器分别喷在标记好的平板上，然后盖好，放在培养 箱内培养十余天，就可在培养基上发生互相隔离的藻类群落，并通过显微镜检查纯藻群落， 然后用消毒过的接种环直接移植到装有培养液并经过灭菌的IOOml三角烧瓶中，用纱布及 无菌膜封口，进行培养。BGll ;pH控制在7.1。上述培养基如制成半固体培养基，则添加琼 脂5?6%。。在显微镜下观察藻细胞是否被纯化，若有杂藻将已经扩大培养的藻细胞用改进 的96孔板进一步分离纯化：充分振摇培养基，如藻细胞成聚合体尽量使藻细胞群体破裂为 单细胞。在显微镜下用细胞计数板计数（浓度大时需稀释后重新计数），根据所计藻细胞密 度，将培养液稀释至每50 μ 1含0. 9个藻细胞单位。充分混匀后，用移液枪依次吸取50 μ L 培养液于96孔培养板孔中，每个培养孔中预先放有新鲜的BGl 1培养液（300-500 μ 1)，加盖 用封口膜将培养板密封，防止液体挥发。将培养板孔在光照培养箱中培养，6?12h后，在倒 置显微镜下仔细观察并标记单细胞孔。待标记的单细胞孔内细胞增至500个以上或出现颜 色时，可进行转接扩大培养。选择单细胞生长的孔用移液枪将其培养物转移至装有200mL 的新鲜培养基的培养瓶中进行扩大培养。得到一株纯藻株，命名为SDEC-8。
[0033] 三、四尾栅藻SDEC-8的鉴定
[0034] 1.四尾栅藻SDEC-8的形态鉴定
[0035] 四尾栅藻SDEC-8的藻落形态特征：在培养基平板上培养后，可观察到绿色藻落， 呈圆形、边缘整齐、光滑、有光泽。
[0036] 四尾栅藻SDEC-8的菌体形态特征：在显微镜和扫描电镜下观察其形态符合栅藻 属特征，具有片状叶绿体，藻细胞真性定形群体扁平，由2-4个细胞组成，群体细胞并列直 线排成一列；细胞长圆形、卵形，细胞上下两端广圆，群体外侧细胞的上下两端各具一向外 斜的直或略弯曲的刺，细胞壁较平滑。细胞群体长宽取决于生长时期，一般长9-26 μ m，宽 8-14μπι。透射电镜观察结果显示，每个藻细胞内含有一个单独的叶绿体，并占据半个细胞， 叶绿体中包含一个很明显的蛋白核，蛋白核周围被淀粉粒包被。在细胞中可发现大小不一 的液泡，在一些液泡中可以看到深灰色的不规则油状物质。如图2 ;
[0037] 2.四尾栅藻SDEC-8的分子鉴定
[0038] (I) 18S rRNA 的 PCR 扩增与测序：
[0039] 实验仪器：小型离心机（Eppendorf，转速>12000r/min);电泳仪（北京六一仪器 厂）；PCR热循环扩增仪（Eppendorf);凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）。
[0040] 实验方法：按照试剂盒法，从适量新鲜藻液离心并提取藻种的总DNA，对DNA样品 进行18S rRNA扩增。扩增引物如下。
[0041] 正向引物为：18S-F(CCTGGTTGATCCTGCCAG);
[0042] 反向引物为：18S-R (TTGATCCTTCTGCAGGTTCA)。
[0043] PCR反应在50 μ L体系中进行。反应体系的组成为：模板DNA 1 μ L ;1. OU Taq PCR 混合物；正向引物2 μ L ;反向引物0. 5 μ L ;双蒸水20 μ L。
[0044] PCR 扩增条件：94°C变性 4min ;94°C lmin，55°C lmin，72°C I. 5min。循环 30 次； 72°C延伸10min，4°C放置。用1%的琼脂糖凝胶对菌株的18S rRNA扩增产物做电泳检测， 验证后切下胶条，用DNA凝胶回收试剂盒（上海生工生物工程有限公司）纯化PCR产物。回 收后的PCR扩增产物委托上海生工生物工程有限公司进行测序。
[0045] 18S rRNA序列分析与系统发育分析：
[0046] 18S rRNA的PCR扩增产物电泳照片如图3所示。通过与两侧Marker对照，可知目 标扩增产物的片段长度约为1.8kb。
[0047] 测序后得到四尾栅藻SDEC-8的18S rRNA长度为1054bp的序列，提交到Genbank 与其他藻株进行比对（登录号为KF999643)，发现四尾栅藻SDEC-8与Scenedesmus sp.的 进化距离最为接近，确定其属于栅藻属，结合显微形态鉴定，初步认定其为四尾栅藻，命名 为 Scenedesmus quadricauda SDEC-8。
[0048] 基于形态鉴定和分子鉴定的结果，将SDEC-8鉴定为四尾栅藻（Scenedesmus quadricauda SDEC-8)，已于2014年9月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏 编号：CCTCC Ν0:Μ 2014448。地址：武汉，中国典型培养物保藏中心（武汉大学）；邮编： 430072
[0049] 实施例2四尾栅藻SDEC-8的BGll培养基培养
[0050] 为了使四尾栅藻SDEC-8更快更好的生长，在BG-Il培养基基础上进行培养。
[0051] (1)所使用培养基：BG11培养基成分如表1所示，使用前，pH控制在7. 1，120°C，灭 菌30分钟。
[0052] 表IBGll培养基成分
[0053]
[0054]
【权利要求】
1. 一种高效处理典型生活污水的栅藻，其特征在于，分离于富营养化湖泊中，命名 为Scenedesmus quadricauda SDEC-8,已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号： CCTCC NO:M 2014448。
2. -种如权利要求1所述的四尾栅藻SDEC-8人工污水培养液，其特征在于：成 份和用量为（NH4)2C0368. 5 ?291. lmg ? I71，K2HP0422. 5 ?84. 3mg ? I71，MgS04 ? 7H20 75mg ? I71，CaCl2 ? 2H20 36mg ? I71，梓檬酸 6mg ? I71，梓檬酸铁铵 6mg ? I71，EDTANa2lmg ? I71， Na2OT320mg ? I71，H3B032. 86mg ? I71，MnCl2 ? 4H20 1. 86mg ? I/1，ZnS04 ? 7H20 0? 22mg ? L' Na2Mo04 ? 2H20 0? 39mg ? I71，CuS04 ? 5H20 0? 08mg ? I71，Co (N03) 2 ? 6H20 0? 05mg ? I71，初始 pH 值在7?8之间，接种后的藻细胞密度为0. 35?0. 40X 106Cells. mL-1。
3. -种如权利要求2所述的四尾栅藻SDEC-8人工污水培养液，其特征在于：培养基 成份和用量为：（NH4)2C03137mg ? I71，K2HP0445mg ? I71，MgS04 ? 7H20 75mg ? L' CaCl2 ? 2H20 36mg ? I71，梓檬酸 6mg ? I71，梓檬酸铁铵 6mg ? I71，EDTANa2lmg ? I71，Na2C0320mg ? I71， H3B032. 86mg ? I/1，MnCl2 ? 4H20 1. 86mg ? I/1，ZnS04 ? 7H20 0? 22mg ? I/1，Na2Mo04 ? 2H20 0? 39mg ? I71，CuS04 ? 5H20 0? 08mg ? I71，Co (N03) 2 ? 6H20 0? 05mg ? I71，初始 pH 值=7. 0，接种 后的藻细胞密度为〇. 38X 106cells. mL'
4. 一种如权利要求3所述的四尾栅藻SDEC-8人工污水培养液的应用，其特征在于：所 述的培养液培养四尾栅藻SDEC-8,得到四尾栅藻SDEC-8细胞。
5. 如权利要求4的应用，其特征在于，所述四尾栅藻SDEC-8细胞的脂肪酸甲酯含量为 9. 55mg ? g-1，饱和脂肪酸含量为80%，十六烷值为61. 38,碘值为29. 38gl2/100g。
6. -种培养权利要求1所述的四尾栅藻SDEC-8的培养方法，其特征在于，包括如下步 骤： a) 将四尾栅藻SDEC-8接种于BG11培养基中进行无菌培养，制得四尾栅藻SDEC-8种子 液，培养条件为温度25 ± 1 °C，光照2000-3000LUX ; b) 根据典型生活污水水质，配制人工污水，其成份和用量为（NH4)2C0368 . 5? 291. lmg ? I71，K2HP0422. 5 ?84. 3mg ? I71，MgS04 ? 7H20 75mg ? I71，CaCl2 ? 2H20 36mg ? I71， 梓檬酸 6mg ? I71，梓檬酸铁铵 6mg ? I71，EDTANa2lmg ? I71，Na2C0320mg ? I71，H3B032. 86mg ? I71， MnCl2 ? 4H20 1. 86mg ? I71，ZnS04 ? 7H20 0? 22mg ? I71，Na2Mo04 ? 2H20 0? 39mg ? I71，CuS04 ? 5H20 0? 08mg ?L'CoWOl *61120 0? 05mg 吨'并将其 pH 调节至 7. 0 后于 120°C高温灭菌 30min， 即得典型生活污水培养液； c) 将制得的四尾栅藻SDEC-8种子液接种于典型生活污水培养液中，接种后的藻细胞 密度约为〇. 35?0. 40X 106Cells. mL'整个系统连续光照条件下通气恒温培养，培养周期 为18天，当达到选定培养时间后，离心即得培养后四尾栅藻SDEC-8细胞。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤c)中培养条件：培养温度为25±1°C， 光照为2500Lux的连续光照，曝气气液比为0. 2vvm。
8. 权利要求1所述的四尾栅藻SDEC-8在处理富营养化湖泊中的应用。
9. 权利要求1所述的四尾栅藻SDEC-8进行含氮和/或含磷废水的净化的应用。
10. 权利要求1所述的四尾栅藻SDEC-8用于生产高效油脂、脂肪酸、蛋白质、淀粉、色 素、多糖和/或核酸的应用。
【文档编号】C12N1/12GK104388315SQ201410625552
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月7日 优先权日:2014年11月7日
【发明者】裴海燕, 宋明明, 胡文容, 韩琳, 张硕, 韩飞 申请人:山东大学