蛙疱疹病毒1型的lamp快速检测方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明蛙疱疹病毒1型的LAMP快速检测方法及试剂盒，属于农业科学生物技术应用领域。所述快速检测方法，包括下述步骤：(1)提取待测样本总的DNA核酸作为反应模板；(2)配置LAMP反应溶液，其中LAMP反应溶液由下列体积比的组分组成，Bst DNA聚合酶:水霉菌:灭菌水:2×反应缓冲液:引物混合物＝1:2:8.6:12.5:0.9；(3)将步骤(1)提取的样本总DNA加入到步骤(2)配制的LAMP反应溶液中，混合；(4)在60℃恒温水浴中反应30分钟；(5)诊断结果：将步骤(4)扩增反应后产物用电泳检测或荧光染料技术进行鉴定。本方法具有操作简单、低成本，反应快速、特异性强、灵敏度高的优点，且用时短，灵敏度比普通PCR高100倍，对壶菌早期诊断准确性更高的特点。
【专利说明】蛙疱疹病毒1型的LAMP快速检测方法及试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属于农业科学生物技术应用领域，具体涉及娃疱疫病毒1型的LAMP快速检 测方法以及与该方法配套实用的检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 疱疹病毒在哺乳类、鸟类、爬行类等多种动物中均有发现，并且均可导致严重的传 染病。根据宿主种类的不同，可将疱疹病毒分为三组：感染哺乳类、鸟类和爬行类的；感染 两栖类和硬骨鱼类的以及单独一类可感染无脊椎动物中的双壳纲动物的。这其中，能感染 两栖动物的两类分别为娃疱疫病毒1型（RaHV-I ;又称卢克疱疫病毒）和娃疱疫病毒2型 (RaHV-2 ;又称蛙病毒4)。
[0003] 蛙疱疹病毒1型首次发现于南美豹蛙（Rana pipiens)的一种肾腺癌（即卢克 肿瘤）组织中，经研究发现该病毒即为这种肾腺癌的病原体，蛙疱疹病毒1型具有非常独 特的温度依赖机制：低温条件会促进其进行复制，但会抑制其转移和扩散。蛙疱疹病毒1 型的DNA大小约为220kbp左右，经序列比对后证明其与海水鲶鱼疱疹病毒（Ictalurid herpesvirus 1，IcHV-I)亲缘关系较为相近。由于卢克肿瘤在野生豹娃中的发生频率非常 高,对野生豹蛙的种群数量产生了非常严重的危害，因此,进一步研究蛙疱疹病毒的生物学 特性并开发出简便、快速的检测手段对于保护和避免野生蛙类受到该病害威胁具有重要作 用。
【发明内容】
[0004] 环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种 新型核酸扩增技术，由日本学者Notomi等发明的一种新型的基因扩增技术，相较于传统的 PCR技术，具有操作简便，特异性强，结果易观察等特点。
[0005] 本发明利用LAMP技术，首次开发出针对蛙疱疹病毒的LAMP快速检测方法，对及时 发现和诊断出蛙的卢克肿瘤具有重要意义。
[0006] 本发明的目的在于公开了蛙疱疹病毒1型的LAMP快速检测方法。
[0007] 本发明的第二个目的在于公开了用于蛙疱疹病毒1型LAMP快速检测方法的试剂 盒。
[0008] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0009] 蛙疱疹病毒1型的LAMP快速检测方法，包括下述步骤：
[0010] (1)、提取待测样本总DNA作为反应模板；
[0011] (2)、配置LAMP反应溶液，其中LAMP反应溶液由Bst DNA聚合酶、水霉菌、灭菌水、 2X反应缓冲液和引物混合物组成，体积比为：
[0012] Bst DNA聚合酶：水霉菌：灭菌水：2X反应缓冲液：引物混合物= 1:2:8. 6:12. 5:0. 9 ；
[0013] (3)、将步骤（1)提取的样本总DNA加入到步骤⑵配制的LAMP反应溶液中，混 合；
[0014] (4)、在60°C恒温水浴中反应30分钟；
[0015] (5)、诊断结果：将步骤（4)扩增反应后产物用电泳检测或荧光染料技术进行鉴 定，呈阳性的表不样本含有娃疱疫病毒1型，呈阴性的表不样本不含有娃疱疫病毒1型。
[0016] 上述技术方案所述的蛙疱疹病毒1型LAMP快速检测方法，其中，步骤（2)中的 2X反应缓冲液由900 μ L 2XLAMP反应缓冲液和100 μ L浓度为25mM的dNTP混合液组 成；其中 2XLAMP 反应缓冲液的组成为：1M pH8. 8Tris-HCl 40mL，KCl I. 49g，MgSO4L 93g， (順4)25042.648，了￥661120211^和86七31116 187.48;其中10(^1^的(1阶13混合液由25 4 1^^丁？、 25 μ L dCTP、25 μ L dGTP 和 25 μ L dTTP 组成；
[0017] 所述引物混合物由20μ L FIP、20y L ΒΙΡ、2· 5μ L F3和2· 5μ L Β3组成，其中 FIP、BIP、F3和Β3的浓度均为100 μ M ;外引物F3序列如SEQ No. 2所示，外引物Β3序列如 SEQNo. 3所示，内引物FIP序列如SEQ No. 4所示和内引物BIP序列如SEQ No. 5所示。
[0018] 上述技术方案所述的蛙疱疹病毒1型LAMP快速检测方法，其中，步骤（3)中样本 总DNA与LAMP反应溶液之间的体积比为1:25。
[0019] 上述技术方案所述的蛙疱疹病毒1型LAMP快速检测方法，其中，步骤（5)中电泳 检测的过程为：取产物5 μ L进行2. 0%琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为120V，20min ;电泳图 出现条带的为阳性，没有出现条带的为阴性。
[0020] 上述技术方案所述的蛙疱疹病毒1型LAMP快速检测方法，其中，步骤（5)中的荧 光染料技术鉴定过程为：在步骤（2)配置的LAMP反应溶液中加入染色剂，反应后在紫外灯 下呈现绿色为阳性，不呈现绿色的为阴性。
[0021] 上述技术方案所述的蛙疱疹病毒1型LAMP快速检测方法，其中，所述染色剂为FD， 染色剂与步骤（2)配置的LAMP反应溶液的体积比为0. 2:25。
[0022] 用于上述技术方案中任一技术方案所述的蛙疱疹病毒1型的LAMP快速检测方法 的试剂盒，其中：所述试剂盒由Bst DNA聚合酶、水霉菌、灭菌水、2X反应缓冲液和引物混 合物组成，体积比为：
[0023] Bst DNA聚合酶：水霉菌：灭菌水：2X反应缓冲液：引物混合物= 1:2:8. 6:12. 5:0. 9 ；
[0024] 所述2 X反应缓冲液由900 μ L 2 X LAMP反应缓冲液和100 μ L浓度为25mM的dNTP 混合液组成；其中2XLAMP反应缓冲液的组成为：1M pH8. 8Tris-HCl 40mL，KCl 1.49g， MgSO4L 93g，（NH4)2S042. 64g，Tween202mL 和 Betaine 187. 4g ;其中 100 μ L 的 dNTP 混合液 由 25 μ L dATP、25 μ L dCTP、25 μ L dGTP 和 25 μ L dTTP 组成；
[0025] 所述引物混合物由20μ L FIP、20y L ΒΙΡ、2· 5μ L F3和2· 5μ L Β3组成，其中 FIP、BIP、F3和Β3的浓度均为100 μ M ;外引物F3序列如SEQ No. 2所示，外引物Β3序列如 SEQNo. 3所示，内引物FIP序列如SEQ No. 4所示和内引物BIP序列如SEQ No. 5所示。
[0026] 本发明操作步骤中的步骤（1)中待测样本总DNA提取的操作按照TIANGEN组织 DNA提取试剂盒说明书进行操作。
[0027] 本发明具有以下有益效果：
[0028] 1、本发明根据GenBank公布的蛙疱疹病毒1型标准株一 NC_008211. 1的基因序列， 针对序列保守区域设计了蛙疱疹病毒1型的LAMP检测方法的特异性引物2对，一对外引物 F3、B3和一对内引物FIP、BIP，4条引物序列分别如SEQ No. 2?No. 5所示。以提取样本总 DNA为模板，建立了快速检测蛙疱疹病毒1型的LAMP技术。
[0029] 2、本发明LAMP检测技术利用特异引物（4条），以识别蛙疱疹病毒1型靶基因的几 个特定区域，特异性更强。反应在等温（60°C )条件下进行，不需要循环仪等昂贵的仪器，扩 增反应极快，一般30分钟完成，扩增产物量大，利用电泳检测或荧光染料技术鉴定出待测 样本是否含有蛙疱疹病毒1型；灵敏度高、特异性强，适合蛙疱疹病毒1型的快速准确检测。
[0030] 3、本发明LAMP技术不需要单独反转录过程和巢式PCR的二次扩增，减少分子检测 的一些环节，降低了检测的污染率；且实验证明检测灵敏度比PCR高100倍，使用本发明的 方法对蛙卢克肿瘤的早期诊断更准确。
[0031] 4、本方法具有操作简单、低成本，反应快速、特异性强、灵敏度高的优点，且用时 短，灵敏度比普通逆转录-聚合酶链锁反应（PCR)高100倍，对蛙疱疹病毒1型早期诊断准 确性更高。可广泛用于样本快速检测、流行监控。
[0032] 5、本发明还根据检测方法相应地建立了检测试剂盒，本发明方法和试剂盒可快 速、准确、灵敏地检测蛙疱疹病毒1型，适合样本快速检测、蛙疱疹病毒1型流行监控等。
【专利附图】
【附图说明】：
[0033] 1、图1为实施例1中LAMP快速检测方法所用试剂盒对蛙疱疹病毒1型检测的电 泳图。
[0034] 2、图2为蛙疱疹病毒1型的LAMP快速检测方法所用试剂盒的引物特异性检测电 泳图。
[0035] 3、图3为蛙疱疹病毒1型的LAMP快速检测方法所用试剂盒的灵敏度实验电泳图。
[0036] 4、图4为蛙疱疹病毒1型的LAMP快速检测方法所用试剂盒的灵敏度实验荧光显 示图。
【具体实施方式】：
[0037] 为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明蛙疱疹病毒1型 的LAMP快速检测方法及试剂盒作进一步的说明。
[0038] 本发明提供一种蛙疱疹病毒1型的快速检测方法。根据GenBank公布的蛙疱疹病 毒1型标准株 NC_008211. 1的基因序列，针对保守区域的序列（序列如SEQ No. 1所不） 设计了蛙疱疹病毒1型的LAMP检测方法的4条特异性引物分别为外引物F3(序列如SEQ No. 2所示）、外引物B3(序列如SEQ No. 3所示）、内引物FIP (序列如SEQ No. 4所示）和内 弓丨物BIP(序列如SEQ No. 5所示），以蛙疱疹病毒1型标准株--NC_008211. 1为模板，建 立了检测所有蛙疱疹病毒1型的LAMP方法。然后依据电泳图谱诊断。
[0039] 以下实施例中涉及的各种真菌均可从市场直接购买。
[0040] 实施例1 :蛙疱疹病毒1型的LAMP方法检测：
[0041] 本实施例中待测样本中的阳性样本即蛙疱疹病毒1型由东北林业大学保护医学 与生态安全研究中心保存也可以从市场购买获得，阴性样本为纯水。
[0042] 具体的检测方法步骤为：
[0043] (1)、按照TIANGEN组织DNA提取试剂盒说明书的步骤提取阳性样本和阴性样本的 总DNA核酸作为反应模板；
[0044] (2)、配置LAMP反应溶液：按总反应体积25 μ L为例，扩增体系由1 μ L Bst DNA聚 合酶、2 μ L水霉菌、8. 6 μ L灭菌水、12. 5 μ L 2Χ反应缓冲液和0. 9 μ L引物混合物组成；
[0045] 其中2 X反应缓冲液由900 μ L 2 X LAMP反应缓冲液和100 μ L浓度为25mM的dNTP 混合液组成；其中2XLAMP反应缓冲液的组成为：1M pH8. 8Tris-HCl 40mL，KCl 1.49g， MgSO4L 93g，（NH4)2S042. 64g，Tween202mL 和 Betaine 187. 4g ;其中 100 μ L 的 dNTP 混合液 由 25 μ L dATP、25 μ L dCTP、25 μ L dGTP 和 25 μ L dTTP 组成；
[0046] 所述引物混合物由 20yL FIP、20yL BIP、2.5yL F3 和 2.5yL Β3 组成，其中 FIP、 BIP、F3和B3的浓度均为100 μ M ;
[0047] (3)、取步骤（1)提取的样本总DNA 1 μ L加入到步骤⑵配制的25 μ L LAMP反应 溶液中，混合；
[0048] (4)、在60°C恒温水浴中反应30分钟；
[0049] (5)、诊断结果：取产物5 μ L进行2. 0 %核酸琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为120V， 20min ;电泳图出现条带的为阳性，没有出现条带的为阴性。
[0050] 凝胶电泳图如图1所示，其中泳道1、2和3为待测样本，结果为阳性；泳道4为阴 性对照，结果为阴性。
[0051] 实施例2 :蛙疱疹病毒1型的LAMP快速检测方法所用试剂盒的特异性实验：
[0052] 本实施例中的引物和操作步骤与实施例1完全相同。
[0053] 用实施例1的引物和操作步骤在虹彩病毒基因组、伪狂犬病毒基因组、蛙疱疹病 毒1型基因组、毛霉菌基因组、壶菌基因组、水霉菌基因组、青霉菌基因组、酵母菌基因组、 猪细小病毒共9个样本检测疱疹病毒LAMP的特异性，阴性样本为纯水。
[0054] 具体的检测方法为：
[0055] (1)、按照TIANGEN组织DNA提取试剂盒说明书的步骤分别提取虹彩病毒基因组、 伪狂犬病毒基因组、蛙疱疹病毒1型基因组、毛霉菌基因组、壶菌基因组、水霉菌基因组、青 霉菌基因组、酵母菌基因组、猪细小病毒和纯水的总DNA作为反应模板；
[0056] (2)、配置LAMP反应溶液：按总反应体积25 μ L为例，扩增体系由1 μ L Bst DNA聚 合酶、2 μ L水霉菌、8. 6 μ L灭菌水、12. 5 μ L 2Χ反应缓冲液和0. 9 μ L引物混合物5 μ L溶 液1、5 μ L溶液2和15 μ L溶液3组成；
[0057] 其中溶液1为2Χ反应缓冲液，所述2Χ反应缓冲液由900yL 2XLAMP反应 缓冲液和IOOuL浓度为25mM的dNTP混合液组成；其中2XLAMP反应缓冲液的组成 为：1M pH8.8Tris-HCl 40mL，KCl 1.49g，MgS041.93g，（NH4)2S042.64g，Tween202mL 和 Betainel87.4g;其中 IOOyL 的 dNTP 混合液由 25yL dATP、25yL dCTP、25yL dGTP 和 25 μ L dTTP 组成；
[0058] 溶液2为引物混合物（100 μ M Primer stock)，所述引物混合物由20 μ L FIP、 20 μ LBIP、2. 5 μ L F3 和 2· 5 μ L B3 组成，其中 FIP、BIP、F3 和 B3 的浓度均为 100 μ M ;
[0059] (3)、分别将步骤⑴提取的总DNA 1 μ L加入到步骤⑵配制的25 μ L LAMP反应 溶液中，混合；
[0060] (4)、在60°C恒温水浴中反应30分钟；
[0061] (5)、诊断结果：取产物5以1^进行2.0%琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为12(^，2〇1^11。 电泳图出现条带的为阳性，没有出现条带的为阴性。
[0062] 如图2所示，其中图2中，M :marker (分子标尺）；泳道1 :虹彩病毒基因组；泳道 2 :伪狂犬病毒基因组；泳道3 :蛙疱疹病毒1型基因组；泳道4 :毛霉菌基因组；泳道5 :壶菌 基因组；泳道6 :水霉菌基因组；泳道7 :青霉菌基因组；泳道8 :酵母菌基因组；泳道9 :猪细 小病毒；泳道10 :纯水。由图2所示，只有蛙疱疹病毒1型基因组呈阳性，说明该方法对蛙 疱疹病毒1型检测特异。本试验例中的各种真菌及病毒基因均可从市场购买并通过常规方 法进行提取或者由东北林业大学保护医学与生态安全研究中心保存和提取，东北林业大学 保护医学与生态安全研究中心保证从申请日起二十年内向公众发放生物材料。
[0063] 实施例3 :蛙疱疹病毒1型的LAMP快速检测方法所用试剂盒的灵敏度实验：
[0064] 本实施例中的引物和操作步骤与实施例1完全相同，待测样本中的阳性样本即蛙 疱疹病毒1型由东北林业大学保护医学与生态安全研究中心保存也可以从市场购买获得， 阴性样本为纯水
[0065] 为蛙疱疹病毒1型病毒LAMP引物扩增不同浓度梯度基因后琼脂糖凝胶电泳检测 结果，扩增条件为60°C，扩增时间为30min。IX IO7-I X IO3个拷贝的模板均有特异性产物 产生，和对照组均无条带产生，此图可看出本研究所设计的通用LAMP引物在60°C下，扩增 30min之后最少可检出IX IO3个拷贝的模板（如附图3和图4)。
[0066] 具体检测步骤如下：
[0067] (1)、按照TIANGEN组织DNA提取试剂盒说明书的步骤提取待测样本总的DNA核 酸，将提取的DNA分别加水稀释从IO 7到ΚΓ1，稀释后的DNA作为反应模板；
[0068] (2)、配置LAMP反应溶液：按总反应体积25 μ L为例，扩增体系由1 μ L Bst DNA聚 合酶、2 μ L水霉菌、8. 6 μ L灭菌水、12. 5 μ L 2Χ反应缓冲液和0. 9 μ L引物混合物5 μ L溶 液1、5 μ L溶液2和15 μ L溶液3组成；
[0069] 其中溶液1为2Χ反应缓冲液，所述2Χ反应缓冲液由900yL 2XLAMP反应 缓冲液和IOOuL浓度为25mM的dNTP混合液组成；其中2XLAMP反应缓冲液的组成 为：1M pH8.8Tris-HCl 40mL，KCl 1.49g，MgS041.93g，（NH4)2S042.64g，Tween202mL 和 Betainel87.4g;其中 IOOyL 的 dNTP 混合液由 25yL dATP、25yL dCTP、25yL dGTP 和 25 μ L dTTP 组成；
[0070] 溶液2为引物混合物（100 μ M Primer stock)，所述引物混合物由20 μ L FIP、 20 μ L ΒΙΡ、2· 5 μ L F3 和 2· 5 μ L B3 组成，其中 FIP、BIP、F3 和 B3 的浓度均为 100 μ M ;
[0071] (3)、当结果需要用荧光染料技术检测时，在步骤（2)的25 μ L LAMP反应中加入 〇· 2 μ L荧光染料FD ;
[0072] (4)、取步骤⑴提取的样本总DNA 1 μ L加入到步骤⑵配制的25 μ L LAMP反应 溶液中，混合；
[0073] (5)、在60°C恒温水浴中反应30分钟；
[0074] (6)、诊断结果：1.琼脂糖电泳观察结果；
[0075] 2.在紫外灯的直接照射下，观察实验结果。
[0076] 结果如图3所示，其中图3中，M:marker (分子标尺）；泳道I :1X107个拷贝；泳 道2 :1 X IO6个拷贝；泳道3 :1 X IO5个拷贝；泳道4 :1 X IO4个拷贝；泳道5 :1 X IO3个拷贝； 泳道6 :1 X IO2个拷贝；泳道7 = IXlO1个拷贝；泳道8 :1 X 10°个拷贝；泳道9 = IXKT1个拷 贝；10泳道：阴性对照。
[0077] LAMP反应过程中可通过荧光染料使其显色，在I X IO6个拷贝?I X 10°个拷贝以及 纯水中按照步骤（3)在LAMP反应液中加入荧光染料，并将步骤（1)提取的样本总DNA 1 μ L 加入到步骤（2)配制的25μ L LAMP反应溶液中，混合；结果如图4所示，最低可以看出IO3 个拷贝的蛙疱疹病毒1型浓度，与灵敏度后琼脂糖电泳结果检测一致。
[0078] 以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限 制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技 术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依 据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本 发明的技术方案的范围内。
【权利要求】
1. 蛙疱疹病毒1型的LAMP快速检测方法，包括下述步骤： (1) 、提取待测样本总DNA作为反应模板； (2) 、配置LAMP反应溶液，其中LAMP反应溶液由Bst DNA聚合酶、水霉菌、灭菌水、2 X 反应缓冲液和引物混合物组成，体积比为： Bst DNA聚合酶：水霉菌：灭菌水：2X反应缓冲液：引物混合物= 1:2:8. 6:12. 5:0. 9 ； (3) 、将步骤⑴提取的样本总DNA加入到步骤⑵配制的LAMP反应溶液中，混合； (4) 、在60°C恒温水浴中反应30分钟； (5) 、诊断结果：将步骤（4)扩增反应后产物用电泳检测或荧光染料技术进行鉴定，呈 阳性的表不样本含有娃疱疫病毒1型，呈阴性的表不样本不含有娃疱疫病毒1型。
2. 根据权利要求1所述的蛙疱疹病毒1型LAMP快速检测方法，其特征在于，步骤（2)中 的2 X反应缓冲液由900 μ L 2 X LAMP反应缓冲液和100 μ L浓度为25mM的dNTP混合液组 成；其中2父1^1^反应缓冲液的组成为：1]\1?!18.81'1^-!1(：14〇1^，1((：11.498，]\%50 4 1.938， (NH4)2S04 2 . 64g，Tween20 2mL 和 Betaine 187. 4g ;其中 100 μ L 的 dNTP 混合液由 25 μ L dATP、25 μ L dCTP、25 μ L dGTP 和 25 μ L dTTP 组成； 所述引物混合物由20yL FIP、20yL BIP、2.5yL F3和2.5yL B3组成，其中FIP、BIP、 F3和B3的浓度均为100 μ Μ ;外引物F3序列如SEQ No. 2所示，外引物B3序列如SEQ No. 3 所示，内引物FIP序列如SEQ No. 4所示和内引物BIP序列如SEQ No. 5所示。
3. 根据权利要求1所述的蛙疱疹病毒1型LAMP快速检测方法，其特征在于，步骤（3) 中样本总DNA与LAMP反应溶液之间的体积比为1:25。
4. 根据权利要求1所述的蛙疱疹病毒1型LAMP快速检测方法，其特征在于，步骤（5) 中电泳检测的过程为：取产物5 μ L进行2. 0%琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为120V，20min ; 电泳图出现条带的为阳性，没有出现条带的为阴性。
5. 根据权利要求1所述的蛙疱疹病毒1型LAMP快速检测方法，其特征在于，步骤（5) 中的荧光染料技术鉴定过程为：在步骤（2)配置的LAMP反应溶液中加入染色剂，反应后在 紫外灯下呈现绿色为阳性，不呈现绿色的为阴性。
6. 根据权利要求5所述的蛙疱疹病毒1型LAMP快速检测方法，其特征在于：所述染色 剂为FD，染色剂与步骤（2)配置的LAMP反应溶液的体积比为0. 2:25。
7. 用于权利要求1?5中任一权利要求所述的娃疱疫病毒1型的LAMP快速检测方法 的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由Bst DNA聚合酶、水霉菌、灭菌水、2X反应缓冲液和 引物混合物组成，体积比为： Bst DNA聚合酶：水霉菌：灭菌水：2X反应缓冲液：引物混合物= 1:2:8. 6:12. 5:0. 9 ； 所述2 X反应缓冲液由900 μ L 2 X LAMP反应缓冲液和100 μ L浓度为25mM的dNTP混 合液组成；其中2XLAMP反应缓冲液的组成为：1M pH8. 8Tris-HCl 40mL，KC1 1. 49g，MgS04 1. 93g，（NH4)2S042 . 64g，Tween20 2mL 和 Betaine 187. 4g ;其中 100 μ L 的 dNTP 混合液由 25 μ L dATP、25 μ L dCTP、25 μ L dGTP 和 25 μ L dTTP 组成； 所述引物混合物由20yL FIP、20yL BIP、2.5yL F3和2.5yL B3组成，其中FIP、BIP、 F3和B3的浓度均为100 μ Μ ;外引物F3序列如SEQ No. 2所示，外引物B3序列如SEQ No. 3 所示，内引物FIP序列如SEQ No. 4所示和内引物BIP序列如SEQ No. 5所示。
【文档编号】C12Q1/70GK104293983SQ201410631647
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年11月11日 优先权日:2014年11月11日
【发明者】王晓龙, 汪环 申请人:东北林业大学