一种用于荧光定量pcr反应的荧光探针的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于荧光定量PCR反应的荧光探针。其特征在于所述的探针包含一条寡核苷酸序列，其5’端为扩增靶序列特异性寡核苷酸序列，并修饰荧光基团，3’端为一段与5’序列反向互补回文结构核苷酸序列，并修饰荧光淬灭基团。在一定条件下，该探针形成分子内二级结构，荧光基团与淬灭基团靠近从而淬灭荧光基团释放的荧光信号。所述的探针与一般荧光单针相比，特异性高，灵敏度高，荧光淬灭效率低，因此反应的信噪比更高，可应用于实时荧光定量PCR检测反应以及所有终点荧光检测反应。
【专利说明】一种用于焚光定量PCR反应的焚光探针
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种寡核苷酸荧光探针，更确切地说涉及一种用于荧光定量PCR反应 的荧光探针，所述的探针可以应用于实时荧光定量PCR反应检测等，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 突光定量 PCR(Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction， FQ-PCR，qPCR)作为新一代分子生物学研究工具，已成为分子诊断、临床检验以及基础生物 医学研究的主流技术平台，广泛应用于传染病、肿瘤、遗传病、心血管等疾病的分子诊断。
[0003] 早期的实时PCR核酸检测技术使用荧光染料指示PCR反应产物的累积过程，例如 SYBR GREEN，EVE GREEN等。染料法简单，成本低，无需设计特殊的探针，然而由于其是通过 识别双链DNA的量来表征PCR产物的积累，所以，无法区分非特异扩增或引物二聚体引起的 非特扩增，在实际应用中还是受到了很大的限制。
[0004] 随后，人们开始应用荧光基团标记的寡核苷酸片段特异性识别并指示PCR扩 增产物，例如TaqMN探针、分子信标、荧光共振能量转移探针（相邻探针）、蝎型探针 (scorpions)等。与祀分子特异性结合的TaqMAN探针会在PCR扩增过程中通过Taq DNA 聚合酶的5'外切酶的作用切除5'末端的荧光分子使之游离，从而释放荧光信号，被破坏的 探针无法可逆恢复，因此TaqMN探针虽然拥有更大的信号放大作用，检测的灵敏度更高； 但是由于荧光基团和淬灭基团距离较远，荧光淬灭不完整，荧光本底较高。分子信标相反， 荧光分子与淬灭分子毗邻，距离较近，荧光淬灭完整，因此荧光本底较低；但是分子信标在 PCR反应过程中不被破坏，因此信号放大作用仅仅依靠 PCR产物累积，检测的灵敏度较低。 蝎行探针类似于分子信标，其缺点也是信号放大能力较TaqMan探针逊色。
[0005] 本发明拟公开一种新型的用于荧光定量PCR反应的荧光探针。所述的探针结合分 子信标与TaqMN探针的双重优势，一方面克服TaqMan探针荧光本底高的缺陷，另一方面又 克服分子信标信号放大能力差的问题，与一般荧光探针相比，荧光本底低，检测特异性高， 灵敏度高，可应用于实时荧光定量PCR反应及荧光终点检测PCR技术，所以既克服了现有技 术存在的缺陷又具有很高的实用价值。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于构建一种用于突光定量PCR反应的突光探针，命名为TLoop。所 述的探针包含一条寡核苷酸序列，其5'端为扩增靶序列特异性寡核苷酸序列，并在5'端修 饰荧光基团，3'端为一段与5'序列反向互补回文结构核苷酸序列，并修饰荧光淬灭基团。 在一定条件下，该探针形成分子内二级结构，荧光基团与淬灭基团靠近从而淬灭荧光基团 释放的荧光信号。在PCR反应复性温度条件下，5'端序列优先与靶序列结合，5'端荧光报 告基团在Taq DNA聚合酶的5'端外切酶作用下断裂下来，并释放出荧光信号。
[0007] 所述的"一定条件"指PCR反应或杂交反应过程中所需要的一定的缓冲条件、离子 强度和表面活性剂浓度等条件。
[0008] 所述探针5'端靶序列结合序列特征，包括Tm值与一般TaqMan探针相同，所述的 探针使用的核苷酸为DNA、RNA或辅以适当的LNA修饰，3'端反向互补回文结构序列根据5' 端序列的GC含量的不同设计为5-12个碱基（核苷），7-9个碱基对最优。
[0009] 所述探针所形成的分子内发夹结构，其5'端（荧光报告基团修饰端）突出0-5个 碱基（核苷），以利于与祀序列的快速结合且大限度的淬灭突光信号。3-5个碱基为最佳。
[0010] 针对荧光修饰，理论上，所有存在荧光共振转移作用的荧光基团-淬灭基团 对（荧光基团及其对应的淬灭基团）都可以用在探针修饰上，荧光基团最常用的比如 FAM(carboxy-fluorescein,羧基突光素 ）、TET (Tetrachloro fluorescein,四氯-6-羧基 突光素 ）、HEX (Hexachloro fluorescein，六氣 _6_ 甲基突光素）、VIC、5_TAMRA (Carboxyte 1：四11161：11711'110(13111；[116，羧基四甲基罗丹明）、1?(1)((父-1'110(13111；[116，罗丹明父）、16叉38 1^(1-)((德 克萨斯红）、cy3 (Indodicarbocyanine 3,卩引哚菁类染料 3)、cy5 (Indodicarbocyanine 5， 吲哚菁类染料5)、JOE (2, 7-二甲基-4, 5-二氯-6-羧基荧光素）等；荧光淬灭基团最常 用的比如BHQ (Black Hole Quencher)系列，Dabcyl (4-(4' -恶烧氨基苯偶氮）苯甲酸）、 Eclipse 等。
[0011] 本发明的探针所使用的核苷酸可以是DNA，RNA，并辅以适当的LNA修饰。但是5' 端第一个碱基（修饰荧光基团）必须可以被Taq DNA聚合酶的5'外切酶剪切，因此，类似 于PNA这样的非自然核苷一定不能用于探针的5'端第一个碱基。
[0012] 在荧光定量PCR反应过程中，存在PCR反应的变性、复性和延伸三个温度阶段，在 变性阶段时，探针颈环结构解离，复性过程中，当体系中含有匹配模板时，探针环状结构区 域与模板结合，使探针的颈环结构无法恢复，探针5'端与模板完全结合，在PCR延伸过程 中，Taq DNA聚合酶通过5'外切酶的作用剪切探针，探针5'端荧光素从探针上解离，彻底 释放出荧光信号。若体系中不含目标DNA，复性过程中探针无法与模板结合，探针倾向于颈 环结构恢复，荧光信号被淬灭。经过多个循环以后，被剪切下来的荧光素逐步累积，从而达 到检测靶DNA的作用（图1)。
[0013] 在终点法检测的荧光PCR反应中，比如数字PCR技术，反应结束的最后一步温度降 低到室温左右，反应中几乎所有未被破坏的完整探针均会形成稳定的颈环结构，荧光信号 被高效淬灭，而被剪切的探针无法恢复，游离的荧光基团释放出荧光信号。
[0014] 本发明所涉及的荧光探针，主要应用于实时荧光定量PCR检测和数字PCR检测等 技术平台。用作实时荧光定量PCR检测时，复性温度检测荧光信号，为了让探针维持颈环结 构，可在延长茎干区域长度，或者在茎干区域添加 LNA核苷，以提高茎干双链区域的Tm值； 用于数字PCR平台等终点检测方法时，对探针茎干区域的Tm值要求就没有那么高，5-10个 喊基足够了。
[0015] 与现有的荧光寡核苷酸探针相比，该具有以下先进性：
[0016] [1]设计简单：只要选择适宜的区域设计探针即可，无特殊结构，对GC含量无依赖 性，
[0017] [2]荧光淬灭效率高：突光报告基团和淬灭基团非常靠近，淬灭效果最大化。
[0018] [3]特异性高：颈环结构的存在，只有当靶序列与探针结合力足够大才能解开颈 环结构，探针才可以与靶序列发生杂交。
[0019] [4]灵敏度高：每个循环被利用的探针会被彻底剪切，因此会在PCR扩增过程中达 到指数累积的作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1为本发明提供的TLoop探针。
[0021] 图2为TLoop探针及PCR反应原理图；
[0022] 图3为基于TLoop探针的荧光定量PCR技术检测EGFR基因 L858Q突变。模板 浓度分别为 A :105copies/y L、B :104copies/y L、C :103copies/y L、D :102copies/y L、E : IO1Copies/ μ L、F :无菌水；上图为Taq Man探针，下图为TLoop探针。
[0023] 图4为基于TLoop探针的数字PCR技术检测EGFR基因 L858Q突变结果；
[0024] A :使用TLoop探针；B :使用TaqMan探针。
【具体实施方式】
[0025] 下面用具体的实施例来进一步阐明本发明突出的特点和显著的进步，但本发明决 非仅局限于实施例。
[0026] 实施例1 :基于TLoop探针的荧光定量PCR技术检测EGFR基因 L858Q突变
[0027] 1、探针及引物设计与合成
[0028] 根据人EGFR基因第21外显子L858Q基因突变类型设计引物和探 针，上游引物E21F序列为5' -cgcagcatgtcaagatca-3'，下游引物E21R序列 为 5' -cctccttactttgcctcc-3'， PCR 产物长度 92bp。 TLoop 探针 TL858 序列为 5， -FAM-cagcagtttggcc gcccacaaactgctg-BHQl-3，。 TaqMan 探针 TM858 序列为 5' -FAM-cagcagtttggcc C| gccca-BHQl-3'。（探针框起来的碱基为突变位点，灰色阴影部 分为茎干结构区域）
[0029] 上述引物及探针设计好后送英潍捷基公司合成。合成产物用无菌去离子水稀释至 终浓度100 μ M储存。使用时稀释10倍。
[0030] 2、荧光定量PCR体系的配制
[0031] 将探针和引物用无菌去离子水稀释到终浓度10 μ Μ，各PCR组分按以下配方配制。 DNA模板为包含EGFR L858Q基因突变的人工质粒。纯化、定量后用TE缓冲液稀释到终浓度 分另U 为 IO5Copies/μ L、IO4Copies/μ L、IO3Copies/μ L、IO2Copies/μ LilOlCopies/μ L，同 时用不含核酸的TE缓冲液作为阴性对照。
[0032]
【权利要求】
1. 一种用于荧光定量PCR反应的荧光探针，其特征在于所述的探针包含一条寡核苷酸 序列，其5'端为扩增靶序列特异性寡核苷酸序列，并在5'端修饰荧光基团，3'端为一段与 5'序列反向互补回文结构核苷酸序列，并修饰荧光淬灭基团，在一定条件下，该探针形成分 子内二级结构，荧光基团与淬灭基团靠近从而淬灭荧光基团释放出荧光信号； 所述的探针，命名为TLoop; 所述的一定条件，指PCR反应或杂交反应过程中所需要的缓冲条件、离子强度和表面 活性剂浓度。
2. 按权利要求1所述的探针，其特征在于在PCR反应复性温度条件下，5'端序列优先 与靶序列结合，5'端荧光报告基团在TaqDNA聚合酶的5'端外切酶作用下断裂下来，并释 放出突光信号。
3. 按权利要求1所述的探针，其特征在于所述的探针使用的核苷酸为DNA、RNA或辅以 适当的LNA修饰，但5'端第一碱基修饰荧光基团是被TaqDNA聚合酶的5'外切酶剪切。
4. 按权利要求1所述的探针，其特征在于5'端靶序列互补片段Tm值高于PCR复性温 度2-10°C;3'端反向互补回文结构序列根据5'端序列的Gc含量的不同，设计为5-12个核 苷。
5. 按权利要求1所述的探针，其特征在于形成的分子内发夹结构，5'端序列突出0-5 个喊基。
6. 按权利要求1或5所述的探针，其特征在于5'端序列突出3-5个碱基。
7. 按权利要求1或4所述的探针，其特征在于3'端反向互补回文结构序列为7-9个碱 基。
8. 按权利要求1所述的探针，其特征在于： ① 针对修饰荧光，所有存在荧光共振转移作用的荧光基团-淬灭基团对都可以用在探 针修饰上，所用的荧光基团是FAM、TET、HEX、VIC、5-TAMRA、ROX、TexasRed-X、cy3、cy5 或 JOE;荧光淬灭基团最常用的比如BHQ系列，Dabcyl或Eclipse; ② 在荧光定量PCR反应过程中，存在PCR反应的变性、复性和延伸三个温度阶段，在变 性阶段时，探针颈环结构解离，复性阶段中，当体系中含有匹配模板时，探针环状结构区域 与模板结合，使探针的颈环结构无法恢复，探针5'端与模板完全结合，在PCR延伸过程中， Taq DNA聚合酶通过5'外切酶的作用剪切探针，探针5'端荧光素从探针上解离，彻底释放 出荧光信号；若体系中不含目标DNA，复性过程中探针无法与模板结合，探针倾向于颈环结 构恢复，荧光信号被淬灭；经过多个循环以后，被剪切下来的荧光素逐步累积，从而达到检 测靶DNA的作用。
9. 权利要求1所述的探针的应用，其特征在于用于实时荧光定量PCR检测和数字PCR 技术检测；用作实时荧光定量PCR检测时，复性温度检测荧光信号，为使探针维持颈环结 构，在延长茎干区域的长度，或者在茎干区域添加LNA核苷，以提高茎干双链区域的Tm值； 用于数字PCR平台终点检测方法时，对探针茎干区域的Tm值只要求5-10个碱基。
10. 按权利要求9所述的应用，其特征在于具体步骤是： A :基于TLoop探针的荧光定量PCR技术检测EGFR基因L858Q突变 1、探针及引物设计与合成 根据人EGFR基因第21外显子L858Q基因突变类型设计引物和探针，上游引物E21F序 列为 5' -cgcagcatgtcaagatca-3'，下游引物E21R序列为 5' -cctccttactttgcctcc-3'，PCR产物长度92bp;TLoop探针TL858序列为5'-FAM-
-BHQ1-3'；TaqMan探针TM858 序列为 5'
-BHQ1-3' ；其中， 探针框起来的碱基为突变位点，灰色阴影部分为茎干结构区域； 然后将上述引物及探针设计好后送英潍捷基公司合成，合成产物用无菌去离子水稀释 至终浓度100UM储存，使用时稀释10倍； 2、 荧光定量PCR体系的配制 将探针和引物用无菌去离子水稀释到终浓度10UM，各PCR组分按以下配方配制，DNA模板为包含EGFRL858Q基因突变的人工质粒，纯化、定量后用TE缓冲液稀释到终浓度分别 为 105copies/liL、104copies/liL、103copies/liL、102copies/liL'lC^copies/liL，同时用 不含核酸的TE缓冲液作为阴性对照； 3、PCR反应及数据分析 反应条件为：95°C预变性lOmin，随后94°C15s，58°C20s，检测FAM荧光信号，共50个 循环； 与一般的TaqMan探针相比，扩增曲线很好，检测灵敏度可以达到10个拷贝的核酸，灵 敏度高，阴性对照没有起峰，说明探针的特异性优于一般的TaqMan探针； B:基于颈环探针的数字PCR技术检测EGFR基因L858Q突变 1、 芯片制作 通过模塑法制作PDMS芯片，首先将PDMS预聚体与固化剂按照质量比10 :1混合，抽真 空除气，浇注在预先制备好的硅片模具上，另外在载玻片上薄涂一层相同的PDMS，静置lh， 放于65°C热板上预固化30分钟，将浇注于模具上的PDMS剥离，打孔，将有管道面与涂层后 的玻璃涂层面贴合在一起，并在进样槽上方加盖一盖玻片；最后将贴合好的PDMS放入85°C 的热板上加热l〇min，使其键合； 2、 探针及引物设计与合成 根据人EGFR基因第21外显子L858Q基因突变类型设计引物和探针，上游引物E21F序 列为 5' -cgcagcatgtcaagatca-3'，下游引物E21R序列为 5' -cctccttactttgcctcc-3'，PCR 产物长度92bp;TLoop探针TL858序列为5'-FAM-
-BHQl-3'，TaqMan探针TM858 序列为 5'-FAM-
.-BHQ1-3'，其中， 探针框起来的碱基为突变位点，灰色阴影部分为茎干结构区域； 然后将上述引物及探针设计好后送英潍捷基公司合成，合成产物用无菌去离子水稀释 至终浓度100UM储存，使用时稀释10倍； 3、 荧光定量PCR体系的配制 将探针和引物用无菌去离子水稀释到终浓度10UM，各PCR组分按以下配方配制。DNA模板为包含EGFRL858Q基因突变的人工质粒，浓度103C〇pieS/iiL; 4、 进样 首先制备PCR预混液，在样品进样口注入PCR预混液，油进样口注入含乳化剂的含3% AbilEM90液体石錯，将注射器置于泵上，利用负压泵的抽吸作用，PCR预混液及石蜡油由进 样口朝出样口方向流动，在芯片十字交叉结构处PCR预混液在两侧石蜡油的夹流作用下切 割形成纳升级的乳滴聚集在芯片的乳滴收集区，进样结束后用PDMS封闭进样及出样口； 5、PCR反应及数据分析 将该芯片即可放入PCR仪进行在片的原位PCR扩增，PCR循环程序为：95°ClOmin预变 性，95°C10s，58°C40s循环，共35个循环，最后采用荧光显微镜观察结果，(XD照相，计数荧 光信号阳性乳滴。
【文档编号】C12Q1/68GK104404142SQ201410631409
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月11日 优先权日:2014年11月11日
【发明者】景奉香, 李刚, 张冀申, 贾春平, 金庆辉, 赵建龙 申请人:中国科学院上海微系统与信息技术研究所