一种快速检测无乳链球菌的分子信标探针及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测无乳链球菌的分子信标探针，其特征在于，所述分子信标探针的碱基序列为：BeaconSAG：5’-FAM- CACCA TTCTGCTCCGAAGAGAAAGC TGGTG -DABCAL-3’；所述探针的5’端用FAM标记，3’端用DABCAL标记，荧光基团激发波长495nm，检测波长520nm。本发明的分子信标探针信号强度高，并且特异性高，可以有效、快速地检测无乳链球菌。本发明还公开了一种快速检测无乳链球菌的试剂盒及检测方法。
【专利说明】一种快速检测无乳链球菌的分子信标探针及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种分子信标探针和试剂盒，通过使用荧 光原位杂交的手段，检测样品中少量的无乳链球菌。
【背景技术】
[0002] 无乳链球菌亦称B群链球菌（Group B Streptococcus, GBS)，是新生儿和女性生 殖系统感染的重要细菌。尤其是新生儿时期的感染，是危及生命的重要原因，其并发症包括 败血症、肺炎和脑膜炎等。在成年妇女的阴道内，有15%左右可以检测出无乳链球菌，这类 女性分娩的新生儿感染该菌的几率会比较高。
[0003] 新生儿无乳链球菌感染分为早发性感染和晚发性感染两种。早发性感染一般是感 染后一周内发病，在美国新生儿早发性感染的死亡率为4%-6%;晚发型感染多见于出生后 7天?3月足月儿，主要表现为脑膜炎，常呈隐匿性发病。临床表现有发热、昏睡、颅内高压 等，如伴发败血症则预后较差。多数感染都是因为母体生殖系统携带的无乳链球菌，经由破 裂的胎膜进入羊水，然后感染胎儿。细菌感染呼吸道可引起肺炎，进入血液系统可引起败血 症、脑膜炎和骨髓炎等。
[0004] 目前临床上检测无乳链球菌最常用的方法是CAMP法：在血平板上B群链球菌能产 生CAMP因子，能促进金黄葡萄球菌溶血素活性--在血琼脂平板上用金黄色葡萄球菌培养 物划一条直线，然后将链球菌培养物划一条线，与金黄色葡萄球菌培养物的划线相互垂直， 但不要接触，二者相距3_5mm，各链球菌分离菌划线间距10?20mm。置37°C温箱内培养24h 后观察结果。在两划线交界处出现箭头样的溶血区为阳性。该方法具有简单、成本低的优 点，缺点是灵敏度较低，且检测时间较长。样本内含菌量少时往往不能得出阳性结果，并且 不能区分是无乳链球菌还是其它B群链球菌。利用PCR方法可在短时间内使特定的核酸序 列拷贝数几何级数增加，有很高的灵敏度和特异性，但缺点是假阳性率高，另一方面，患者 分泌物中有往往含有抑制PCR反应的成分，这又会导致假阴性的出现，这两方面的缺点限 制了 PCR检测的临床应用。由此可见，无乳链球菌临床诊断，急需更简洁、灵敏的检测方法。
[0005] 分子信标探针（Molecular beacon probe)，具有灵敏度高、特异性强、只有和革巴序 列杂交上了才会发出荧光等优点，被应用于荧光原位杂交。本发明通过对大量无乳链球菌 和其它链球菌菌株的16S rRNA序列进行比对，挑选无乳链球菌的特异性序列，设计、合成分 子信标探针，建立稳定的分子信标原位杂交反应体系，克服了无乳链球菌当前临床检测的 诸多问题，为无乳链球菌感染的诊断、预防和控制提供新的检测方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种分子信标探针，通过荧光原位杂交的手段，建立一种 快速、灵敏、特异性地检测样品中无乳链球菌的方法。
[0007] -种快速检测无乳链球菌的分子信标探针，其特征在于，所述分子信标探针的碱 基序列为：
[0008] Beacon SAG :5' -FAM-CACCATTCTGCTCCGAAGAGAAAGCTGGTG-DABCAL-3' ；
[0009] 所述探针的5'端用FAM标记，3'端用DABCAL标记，荧光基团激发波长495nm，检 测波长520nm。
[0010] 进一步地，所述分子信标浓度为IOng/ μ L。
[0011] 本发明还提供了一种快速检测无乳链球菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包 括：
[0012] ⑴裂解液：4%氢氧化钠
[0013] (2)杂交液：10% (w/v)硫酸葡聚糖，IOmM NaCl，20% (v/v)甲酰胺，0· 1% (w/v) 焦磷酸钠，0.2% (w/v)聚乙烯基吡咯烷酮，0.2% (w/v)聚鹿糖，5mM Na2EDTA，0. 1% (v/v) TritonX-100, 50mM Tris/HCl (pH 7· 5)，IOng/ μ L分子信标探针，所述分子信标探针的碱基 序列为：
[0014] Beacon SAG :5' -FAM-CACCATTCTGCTCCGAAGAGAAAGCTGGTG-DABCAL-3' ；
[0015] (3)终止液：1 稀硫酸
[0016] (4)洗涤液：5mM Tris，15mM NaCl，0. 1% (v/v)Triton X-100, pH 值为 10。
[0017] 本发明最后提供了一种上述试剂盒快速检测无乳链球菌的方法，其特征在于包括 如下步骤：
[0018] ⑴吸取10 μ L样品滴在载玻片上，自然风干；
[0019] (2)在风干的样品上加入IOyL裂解液，待其自然风干后，浸入无水乙醇中，浸泡5 分钟；
[0020] (3) 52 °C 杂交 10 分钟；
[0021] (4)液侵泡1分钟，终止反应；
[0022] (5)滴加封片剂后，用荧光显微镜镜检，用20 X物镜扫视和计数，用60或100X物 镜观察细菌形态。
[0023] 本发明的技术要点或原理：突光原位杂交（Flourescence in situ Hybridization，FISH)是一种应用标记有荧光物质的探针，通过杂交的方法来检测细胞或 组织内特异性DNA或RNA的方法；分子信标探针是一种具有独特"发夹"空间结构的探针，在 未与靶序列结合时，分子信标呈"发夹"结构，有一环序列（loop)和一茎序列（stem)，其中 环序列是与靶位点互补的碱基序列，而茎序列是与靶位点无关的互补序列；在探针的两端 分别标记有荧光基团和荧光猝灭基团，当探针处于发卡结构时，荧光基团和猝灭基团相邻， 产生能量共振转移效应，使得荧光基团被猝灭，不能产生荧光信号，而当探针与靶位点结合 时，发夹结构被打开，荧光基团和猝灭基团分开，产生荧光信号，通过荧光显微镜可以检测 到该突光信号。
[0024] 本发明通过比对多个无乳链球菌和其它链球菌的16S rRNA序列，筛选出1条无乳 链球菌特有的靶序列。根据该靶序列，人工合成分子信标探针，其碱基组成为：
[0025] Beacon SAG :5' -FAM-CACCATTCTGCTCCGAAGAGAAAGCTGGTG-DABCAL-3'
[0026] 探针的5'端用FAM标记，3'端用DABCAL标记，荧光基团激发波长495nm，检测波 长 520nm。
[0027] 本发明通过大量实验，确定荧光原位杂交的最佳温度为52°C，甲酰胺最佳浓度为 20%，分子信标最佳浓度为IOng/ μ L。
[0028] 本发明分子信标探针5'端的荧光标记，包括但不限于FITC、FAM或Cy3等等，3'端 的荧光猝灭标记，包括但不限于DABCYL、BDH或TANRA等，荧光基团或荧光猝灭基团可以根 据现有技术进行添加。
[0029] 本发明的分子信标探针能够用于检测的样本范围广泛，包括但不限于，痰、咽拭 子、胃灌洗液、支气管灌洗液、活体组织、吸引物、咳出物、体液（脊髓、胸腹水、心包液等）、 血液、脓液、骨髓、尿液、组织切片、食物样本、来自土壤、空气和水的样本，以及它们的培养 物。这些样本经相应处理后，原则上是只要保持细胞形态完整并且靶核酸未被破坏，均可使 用本发明的分子信标探针检测。这些样本的处理方法是本领域技术人员所掌握的，例如：
[0030] 痰：痰液涂片法；
[0031] 脓液：同痰液涂片法；
[0032] 病灶组织：先用组织研磨器磨碎后再行涂片；
[0033] 尿液：留全量夜尿，静置4?5h后，弃上清液，取沉淀部分尿液10ml，3000rpm，离 心30min，取沉淀物涂片；
[0034] 胸、腹水标本：参照尿液涂片法；
[0035] 脑脊液：无菌操作收集脑脊液，放置冰箱或室温24h，待薄膜形成后涂片。也可将 脑脊液离心沉淀，3000rpm，离心30min，弃上清液，取沉淀物涂片。
[0036] 本发明的分子信标探针信号强度高，并且特异性高，可以有效、快速地检测无乳链 球菌。
【具体实施方式】
[0037] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但下列实施例仅用于说明 本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造 商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产 品。
[0038] 实施例1 :分子信标探针及寡聚核苷酸序列的设计与合成
[0039] 选择出能特异性地检测无乳链球菌的靶序列，在该段靶序列上设计与其完全互补 的分子信标探针：
[0040] Beacon SAG :5' -FAM-CACCATTCTGCTCCGAAGAGAAAGCTGGTG-DABCAL-3'
[0041] 该分子信标是由碱基组成的颈环结构的特异序列，其中5,端用FAM标记，3,端用 DABCTL标记，荧光基团要求激发波长495nm，检测波长520nm ;人工设计合成分子信标及与 其完全互补的寡核苷酸（5' -AGGTCCGGGTTCTCTCGGAT-3'）。通过对分子信标和寡聚核苷酸 做热变性曲线实验，确定荧光原位杂交的最佳反应温度为52°C，去离子甲酰胺的最佳浓度 为 20%。
[0042] 实施例2 :使用分子信标探针FISH检测细菌标准菌株。
[0043] 无乳链球菌和其他细菌标准菌株购自ATCC，共检测5种无乳链球菌和12种其它链 球菌。检测试剂盒包括：
[0044] (1)裂解液：4%氢氧化钠
[0045] (2)杂交液：10% (w/v)硫酸葡聚糖，IOmM NaCl，20% (v/v)甲酰胺，0· 1% (w/v) 焦磷酸钠，0.2% (w/v)聚乙烯基吡咯烷酮，0.2% (w/v)聚鹿糖，5mM Na2EDTA，0. 1% (v/v) TritonX-100, 50mM Tris/HCl (pH 7· 5)，IOng/ μ L分子信标探针，所述分子信标探针的碱基 序列为：
[0046] Beacon SAG :5, -FAM-CACCATTCTGCTCCGAAGAGAAAGCTGGTG-DABCAL-3,；
[0047] (3)终止液：1 %稀硫酸
[0048] (4)洗涤液：5mM Tris，15mM NaCl，0. 1% (v/v)Triton X-100, pH 值为 10。
[0049] 检测方法：
[0050] (I)吸取10 μ L培养样品滴在载玻片上，自然风干；
[0051] (2)在风干的样品上加入IOyL裂解液，待其自然风干后，浸入无水乙醇中，浸泡5 分钟；
[0052] (3)在样品上加入10 μ L杂交液，置于杂交炉中52°C杂交10分钟；
[0053] (4)用终止液侵泡1分钟,终止反应；
[0054] (5)滴加封片剂后，用荧光显微镜镜检，用20 X物镜扫视和计数，用60或100 X物 镜观察细菌形态。在暗色背景中，无乳链球菌发出绿色荧光。
[0055] 结果判定方法：
[0056] 无乳链球菌阴性:连续观察50个不同视野，未发现细菌。
[0057] 无乳链球菌阳性（报告菌数）：1-9条/50视野。
[0058] 无乳链球菌阳性（1+) :10-99条/50视野。
[0059] 无乳链球菌阳性（2+) : 1-9条每视野。
[0060] 无乳链球菌阳性（3+) :10-99条每视野。
[0061] 无乳链球菌阳性（+) :>100条每视野。
[0062] 表一：使用无乳链球菌分子信标探针FISH检测细菌标准菌株
[0063]
【权利要求】
1. 一种快速检测无乳链球菌的分子信标探针，其特征在于，所述分子信标探针的碱基 序列为： Beacon SAG :5' -FAM-CACCATTCTGCTCCGAAGAGAAAGCTGGTG-DABCAL-3' ； 所述探针的5'端用FAM标记，3'端用DABCAL标记，荧光基团激发波长495nm，检测波 长 520nm。
2. 如权利要求1所述的分子信标探针，其特征在于，所述分子信标浓度为10ng/y L。
3. -种快速检测无乳链球菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括： (1)裂解液：4%氢氧化钠； ⑵杂交液：10% (w/v)硫酸葡聚糖，10mM NaCl，20% (v/v)甲酰胺,0.1% (w/v)焦 磷酸钠，0.2% (w/v)聚乙烯基吡咯烷酮，0.2% (w/v)聚鹿糖，5mM Na2EDTA，0.1% (v/v) TritonX-100, 50mM Tris/HCl (pH 7. 5)，10ng/ ii L分子信标探针，所述分子信标探针的碱基 序列为： Beacon SAG :5' -FAM-CACCATTCTGCTCCGAAGAGAAAGCTGGTG-DABCAL-3' ； (3) 终止液：1%稀硫酸； (4) 洗涤液：5mM Tris，15mM NaCl，0. 1% (v/v)Triton X-100，pH 值为 10。
4. 一种利用权利要求3所述试剂盒快速检测无乳链球菌的方法，其特征在于包括如下 步骤： (1) 吸取10 U L样品滴在载玻片上，自然风干； (2) 在风干的样品上加入10 y L裂解液，待其自然风干后，浸入无水乙醇中，浸泡5分 钟； (3) 在样品上加入10 y L杂交液，置于杂交炉中52°C杂交10分钟； (4) 用终止液侵泡1分钟，终止反应； (5) 滴加封片剂后，用荧光显微镜镜检，用20 X物镜扫视和计数，用60或100 X物镜观 察细菌形态。
【文档编号】C12N15/11GK104388558SQ201410635596
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月12日 优先权日:2014年11月12日
【发明者】方华成, 洪冉, 刘振世, 易春 申请人:苏州达麦迪生物医学科技有限公司