一种单糖起始的多酶偶联合成透明质酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种单糖起始的多酶偶联合成透明质酸的方法，是以两种单糖为起始底物，通过多酶体系的偶联，合成透明质酸。本发明方法偶联了以单糖为底物的糖核苷酸的酶法合成和以糖核苷酸为底物的透明质酸酶法合成，该方法使用单糖为起始底物，价格低廉，容易获得，避免了价格昂贵的糖核苷酸的供给，大大降低了酶法合成透明质酸的生产成本，同时，多酶偶联合成透明质酸能够有效避免透明质酸微生物发酵生产工艺中内毒素残留的弊端。本发明方法工艺简单，条件温和，易于操作，无污染，适合于透明质酸的大规模合成，具有极大的应用前景。
【专利说明】一种单糖起始的多酶偶联合成透明质酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种酶法合成透明质酸的方法，尤其涉及一种单糖为起始的多酶偶联 合成透明质酸的方法，属于寡糖合成制备【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 透明质酸（hyaluronan,hyaluronicacid,HA)，是由重复二糖单位连接而成 的长链酸性粘多糖，二糖单位中有一分子N-乙酰氨基葡萄糖和一分子葡萄糖醛酸以 [-β3-GlcNAc-βΙ-4-GlcA-l-]连接方式组成。透明质酸是自然界最简单的一种糖胺聚糖， 不与蛋白质共价连接，没有硫酸、异构化修饰，以游离形式存在。透明质酸以其独特的分子 结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能。此外，透明质酸还会影响细胞移动、 增生分化以及细胞吞噬。
【权利要求】
1. 一种单糖起始的多酶偶联合成透明质酸的方法，步骤是： (1) 使用浓度为0. 05M?0. 5M、pH值为5. 5?8. 0的磷酸盐缓冲液分别配制浓度为 0. 1M的N-乙酰氨基葡萄糖溶液和浓度为0. 1M葡萄糖醛酸溶液，备用； (2) 使用浓度为0. 05M?0. 5M、pH值为5. 5?8. 0的磷酸盐缓冲液分别配制浓度为 〇. 1M的腺苷三磷酸（ATP)溶液和浓度为0. 1M的尿苷三磷酸（UTP)溶液，备用； (3) 使用浓度为0. 05M?0. 5M、pH值为6. 5?8. 0的磷酸盐缓冲液分别配制浓度均为 50mg/mL的N-乙酰氨基葡萄糖激酶溶液、葡萄糖醛酸激酶溶液、N-乙酰氨基葡萄尿苷转移 酶溶液、葡萄糖醛酸尿苷转移酶溶液、透明质酸合酶溶液，备用； (4) 将步骤（1)、（2)中制得的0. 1M的N-乙酰氨基葡萄糖溶液、0. 1M的腺苷三磷酸 (ATP)溶液与0. 1M的尿苷三磷酸（UTP)溶液按体积比1:1?3:1?2混合，30± 1°C水浴中 孵育10±2分钟，再加入孵育时混合液体积35?65%的步骤（3)中制得的50mg/mL N-乙 酰氨基葡萄糖激酶溶液与50mg/mL N-乙酰氨基葡萄尿苷转移酶溶液按体积比1. 1?1. 3:1 混合的酶液，充分混匀后，在30?37°C水浴中反应12?48小时，得反应液，该反应液命名 为尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc)反应液； (5) 将步骤（1)、（2)中制得的0. 1M的葡萄糖醛酸溶液、0. 1M的腺苷三磷酸（ATP)溶 液与0. 1M的尿苷三磷酸（UTP)溶液按1:1?3:1?2的体积比混合，30±1°C水浴中孵育 10 ±2分钟，再加入孵育时混合液体积40?60%的步骤（3)中制得的50mg/mL葡萄糖醛酸 激酶溶液与50mg/mL葡萄糖醛酸尿苷转移酶溶液按体积比1. 1?1. 5:1混合的酶液，充分 混匀后，在30?37°C水浴中反应12?48小时，得反应液，该反应液命名为尿苷二磷酸-葡 萄糖醛酸（m)P-GlcA)反应液； (6) 将尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc)反应液与尿苷二磷酸-葡萄糖醛 酸（UDP-GlcA)反应液按体积比1:0. 8?1. 2混合，再加入该混合液体积40?100 %的步骤 ⑶制得的50mg/mL透明质酸合酶溶液，充分混匀后，在28?35°C水浴中反应24?48小 时，100°C煮沸5?10分钟，得反应液，该反应液命名为透明质酸反应液； (7) 将步骤（6)制得的透明质酸反应液在2?8°C条件下8, 000?13, 000转/分钟离 心20?60分钟，收集上清液； (8) 将步骤（7)制得的上清液在30?40°C的条件下旋转蒸发30?60分钟，去除多余 的水分，得含透明质酸的浓缩液； (9) 选择截留分子量为100?1，000的透析袋，以去离子水作为透析液，对步骤（8)制 得的浓缩液实施透析去除小分子杂质，每间隔6-8小时更换一次透析水，透析3?5次，对 透析后溶液冷冻干燥，即获得透明质酸产品。
2. 如权利要求1所述单糖起始的多酶偶联合成透明质酸的方法，其特征在于，步骤 (1)、（2)、（3)中所述的磷酸盐缓冲液是浓度为0. 05M、pH值为7. 5的磷酸钠缓冲液。
3. 如权利要求1所述单糖起始的多酶偶联合成透明质酸的方法，其特征在于，步骤（4) 所述将步骤（1)、（2)中制得的0. 1M的N-乙酰氨基葡萄糖溶液、0. 1M的腺苷三磷酸（ATP) 溶液与〇. 1M的尿苷三磷酸（UTP)溶液按体积比1:1. 2:1. 2混合，30± 1°C水浴中孵育10±2 分钟，再加入孵育时混合液体积35?65%的步骤（3)中制得的50mg/mL N-乙酰氨基葡萄 糖激酶溶液与50mg/mL N-乙酰氨基葡萄尿苷转移酶溶液按体积比1. 2:1混合的酶液，充分 混匀后，在37°C水浴中反应16小时，得反应液。
4. 如权利要求1所述单糖起始的多酶偶联合成透明质酸的方法，其特征在于，步骤（5) 所述将步骤（1)、（2)中制得的0. 1M的葡萄糖醛酸溶液、0. 1M的腺苷三磷酸（ATP)溶液与 〇. 1M的尿苷三磷酸（UTP)溶液按1:1. 5:1. 5的体积比混合，30土 1°C水浴中孵育10±2分 钟，再加入孵育时混合液体积40?60 %的步骤（3)中制得的50mg/mL葡萄糖醛酸激酶溶液 与50mg/mL葡萄糖醛酸尿苷转移酶溶液按体积比1. 3:1混合的酶液，充分混匀后，在37°C水 浴中反应24小时，得反应液。
5. 如权利要求1所述单糖起始的多酶偶联合成透明质酸的方法，其特征在于，步骤 ⑷、（5)所述水浴反应中含有终浓度为10mM的MgCl2。
6. 如权利要求1所述单糖起始的多酶偶联合成透明质酸的方法，其特征在于，步骤（6) 所述将尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc)反应液与尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸 (UDP-GlcA)反应液按体积比1:1. 1混合，再加入该混合液体积40?100%的步骤（3)制得 的50mg/mL透明质酸合酶溶液，充分混匀后，在30°C水浴中反应24小时后，100°C煮沸5分 钟。
7. 如权利要求1所述单糖起始的多酶偶联合成透明质酸的方法，其特征在于，步骤（7) 所述透明质酸反应液在4°C条件下12, 000转/分钟离心30分钟。
8. 如权利要求1所述单糖起始的多酶偶联合成透明质酸的方法，其特征在于，步骤（8) 所述上清液在35 °C的条件下旋转蒸发50分钟。
9. 如权利要求1所述单糖起始的多酶偶联合成透明质酸的方法，其特征在于，步骤（9) 所述透析袋的截留分子量为100?1，〇〇〇,间隔8小时更换一次透析水，透析3次。
【文档编号】C12P19/26GK104357517SQ201410649819
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月14日 优先权日:2014年11月14日
【发明者】房俊强, 王鹏, 王帅帅, 付玄 申请人:山东大学