一种透明质酸寡糖链修饰末端带葡萄糖醛酸的黄酮化合物的方法
【专利摘要】本发明公开了一种透明质酸寡糖链修饰末端带葡萄糖醛酸的黄酮化合物的方法，属于生物制药【技术领域】。本发明选用末端带葡萄糖醛酸的黄酮化合物为起始，利用具有β(1→4)乙酰氨基葡萄糖转移酶活性和β(1→3)葡萄糖醛酸转移酶活性的双功能透明质酸合酶，在末端葡萄糖醛酸的基础上，进行透明质酸寡糖链的合成，制备获得透明质酸寡糖链修饰的黄酮化合物。本发明方法避免了化学合成存在的频繁保护和脱保护步骤，具有经济、绿色、高效等优点，拓宽了黄酮类化合物的衍生，制备了具有药物传输靶向标签的新型黄酮类药物，为研发新型靶向性抗癌药物开辟了新的途径，具有潜在的临床应用前景。
【专利说明】一种透明质酸寡糖链修饰末端带葡萄糖醛酸的黄酮化合物 的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制药【技术领域】。涉及一种透明质酸寡糖链修饰末端带葡萄糖醛酸 的黄酮化合物的方法。
【背景技术】
[0002] 黄酮类化合物（Flavonoid)是广泛存在于自然界的一类重要的多酚类化合物，以 2-苯基色原酮（2-phenylchromone)为母核，两个苯环（A与B环）通过中央三碳链相互联 结而形成的一系列化合物。黄酮类化合物在植物界分布很广，是植物次级代谢的产物，多存 在于高等植物及羊齿类植物中。直接从天然植物中提取的黄酮类化合物一般以游离态或糖 苷形式存在，分子中含有多个酚羟基。
[0003]
【权利要求】
1. 一种透明质酸寡糖链修饰末端带葡萄糖醛酸的黄酮化合物的方法，步骤是： (1) 使用〇? 05?0? 5M、pH值为5. 5?9. 0的Tris-HCl缓冲液分别配制浓度为0? 1M的 UDP-GlcNAc (尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖）溶液，浓度为0. 1M的UDP-GlcA (尿苷二磷 酸-葡萄糖醛酸）溶液，备用； (2) 使用去离子水配制浓度为0. 1M的末端带有葡萄糖醛酸的黄酮化合物，备用； (3) 使用0? 05?0? 5M、pH值为6. 5?8. 5的Tris-HCl缓冲液配制浓度为30mg/mL的 透明质酸合酶溶液，备用； (4) 将步骤（1)制得的UDP-GlcNAc溶液与步骤⑵制得的末端带葡萄糖醛酸的黄酮化 合物溶液按1?3:0. 5?1的体积比混合，28°C水浴中孵育10±2分钟，再加入反应溶液总 体积10?30%的浓度为30mg/mL的透明质酸合酶溶液，28?32°C水浴中反应20?28小 时，100°C煮沸，得反应液； (5) 将步骤（4)制得的反应液在2?8°C条件下8, 000?13, 000转/分钟离心20? 60分钟，收集上清液； (6) 将步骤（5)收集的上清液在30?37°C的条件下旋转蒸发30?60分钟去除多余 水分，得浓缩反应液； (7) 将步骤（6)制得的浓缩反应液使用分子筛凝胶层析纯化，以去离子水为流动相，按 柱体积0.2?1.5%的体积比例进行上样，层析柱选择内径为1.0?3. 5厘米，长度为1.0 米的普通中压层析柱，洗脱流速为70?90mL/小时，收集洗脱液，然后利用薄层层析进行产 物鉴定，对含有目标产物的收集组分进行合并，冷冻干燥，即得透明质酸二糖修饰的黄酮化 合物； (8) 将步骤（7)制得的透明质酸二糖修饰的黄酮化合物用浓度为0. 05?0. 5M、pH值 为5. 5?8. 0的Tris-HCl缓冲液配制成浓度为0. 1M的透明质酸二糖修饰的黄酮化合物溶 液； (9) 将步骤（1)制得的UDP-GlcA溶液与步骤（8)制得的透明质酸二糖修饰的黄酮化 合物溶液按1?3:0. 5?1的体积比混合，28°C水浴中孵育10±2分钟，再加入反应溶液总 体积10?30%的浓度为30mg/mL的透明质酸合酶溶液，28?32°C水浴中反应16?24小 时，100°C煮沸，得反应液； (10) 将步骤（9)制得的反应液在2?8°C条件下8, 000?13, 000转/分钟离心20? 60分钟，收集上清液； (11) 将步骤（10)收集的上清液在30?37°C的条件下旋转蒸发30?60分钟去除多 余水分，得浓缩反应液； (12) 将步骤（11)制得的浓缩反应液使用分子筛凝胶层析纯化，以去离子水为流动相， 按柱体积0. 2?1. 5 %的体积比例进行上样，层析柱选择内径为1. 0?3. 5厘米，长度为1. 0 米的普通中压层析柱，洗脱流速在70?90mL/小时，收集洗脱液，利用薄层层析进行产物 鉴定，对含有目标产物的收集组分进行合并，冷冻干燥，即得透明质酸三糖修饰的黄酮化合 物； (13) 将步骤（12)制得透明质酸三糖修饰的黄酮化合物用浓度为0. 05?0. 5M、pH值 为5. 5?8. 0的Tris-HCl缓冲液配制成浓度为0. 1M的透明质酸三糖修饰的黄酮化合物溶 液； (14) 将步骤（1)制得的UDP-GlcA溶液与UDP-GlcNAc溶液以及步骤（13)制得的透明 质酸三糖修饰的黄酮化合物按反应溶液终摩尔浓度比为1?1000:1?1000:1的比例混 合，28°C水浴中孵育10 ±2分钟，再加入反应溶液总体积10?30%的浓度为30mg/mL的透 明质酸合酶溶液，28?32°C水浴中反应10?16小时，100°C煮沸，得反应液； (15) 将步骤（14)制得的反应液在2?8°C条件下8, 000?13, 000转/分钟离心20? 60分钟，收集上清液； (16) 将步骤（15)收集的上清液在30?37°C的条件下旋转蒸发30?60分钟去除多 余水分，得浓缩反应液； (17) 将步骤（16)制得的浓缩反应液透析去除小分子杂质，选择截留分子量范围为 100?1，000的超滤管，6, 000转/分钟离心30±5分钟，收集超滤后的组分，进行冷冻干燥， 即获得透明质酸寡糖链修饰末端带葡萄糖醛酸的黄酮化合物。
2. 如权利要求1所述透明质酸寡糖链修饰末端带葡萄糖醛酸的黄酮化合物的方法，其 特征在于：步骤（1)、（3)、⑶或（13)中所述的Tris-HCl缓冲液浓度为0. 05M，其pH值为 7. 5。
3. 如权利要求1所述透明质酸寡糖链修饰末端带葡萄糖醛酸的黄酮化合物的方法，其 特征在于：步骤（4)、（9)或（14)中所述的反应液中含有终浓度为20mM的MnC12。
4. 如权利要求1所述透明质酸寡糖链修饰末端带葡萄糖醛酸的黄酮化合物的方法，其 特征在于：步骤（4)中所述UDP-GlcNAc溶液与步骤（2)制得的末端带葡萄糖醛酸的黄酮化 合物溶液按1. 2:1的体积比混合；所述透明质酸合酶溶液加入量占反应总体积的20% ;所 述反应是在30°C水浴中进行反应24小时。
5. 如权利要求1所述透明质酸寡糖链修饰末端带葡萄糖醛酸的黄酮化合物的方法，其 特征在于：步骤（5)、（10)或（15)中所述离心条件是：4°C条件下12, 000转/分钟离心30 分钟。
6. 如权利要求1所述透明质酸寡糖链修饰末端带葡萄糖醛酸的黄酮化合物的方法， 其特征在于：步骤（7)或（12)中所述分子筛凝胶层析选用Bio-Gel P2胶，其分离分子量范 围是100?1，800,上样量为柱体积的0. 5%，流速控制为85mL/小时。
7. 如权利要求1所述透明质酸寡糖链修饰末端带葡萄糖醛酸的黄酮化合物的方法，其 特征在于：步骤（7)或（12)中所述薄层层析选用Merck公司生产的TLC Silica gel 60F254， 展开剂组分选用体积比为乙酸乙酯：甲醇：水：乙酸=5:2:1:0.4的混合溶液。
8. 如权利要求1所述透明质酸寡糖链修饰末端带葡萄糖醛酸的黄酮化合物的方法，其 特征在于：步骤（9)中所述UDP-GlcA溶液与步骤（8)制得的透明质酸二糖修饰的黄酮化合 物溶液按1. 2:1的体积比混合；所述透明质酸合酶溶液加入量占反应总体积的20% ;所述 反应是在30°C水浴中进行反应20小时。
9. 如权利要求1所述透明质酸寡糖链修饰末端带葡萄糖醛酸的黄酮化合物的方法，其 特征在于：步骤（14)中所述UDP-GlcA溶液与UDP-GlcNAc溶液以及步骤（13)制得的透明 质酸三糖修饰的黄酮化合物按反应溶液终摩尔浓度比为500:500:1的比例混合；所述透明 质酸合酶溶液加入量占反应总体积的20% ;所述反应是在30°C水浴中进行反应12小时。
【文档编号】C12P19/60GK104388499SQ201410649632
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月14日 优先权日:2014年11月14日
【发明者】房俊强, 王鹏, 付玄, 薛梦阳 申请人:山东大学