一种前交叉韧带残端来源的间充质干细胞的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种前交叉韧带残端组织来源的间充质干细胞的分离方法，包括如下步骤：(1)取前交叉韧带残端组织，剪成组织碎块，采用浓度为0.2～0.6％(w/v)的I型胶原酶溶液消化4～6h；(2)终止消化，用100～400目筛网过滤，1000～2000rpm离心4～10min，弃上清，PBS洗涤3次，重悬于间充质干细胞培养基中，置于37℃、5％CO2条件下培养，2～3天后弃去非贴壁细胞和碎片，换液，此后每3～4天换液一次，在细胞融合度为80％～90％时收获细胞，即可。本发明前交叉韧带残端来源的间充质干细胞综合韧带细胞的稳定表型和MSC“干性”特征两者的优点，其分化确切，生物活性优良，是未来韧带再生及其转化医学研究中较为理想的一种种子细胞来源，临床应用前景良好。
【专利说明】一种前交叉韧带残端来源的间充质干细胞的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种韧带残端来源的间充质干细胞的制备方法。
【背景技术】
[0002]前交叉韧带损伤在临床骨科及运动医学领域非常常见，尤其是对于高水平的专业运动员。关节镜下前交叉韧带重建目前被认为是广泛接受的治疗前交叉韧带断裂的“金标准”，用于前交叉韧带重建的肌腱移植物(包括自体、异体和人工合成的韧带)在体内经历急性炎性反应、再血管化、基质合成、胶原重塑4个“韧带化”整合阶段。前交叉韧带重建的目标是恢复膝关节稳定的功能，但是很多接受前交叉韧带重建的患者依然发生关节退变。成功的前交叉韧带重建的前提条件是移植物与宿主组织的生物学整合。一些研究发现前交叉韧带/后交叉韧带的保留残端组织的生物增强重建有利于韧带的愈合。
[0003]种子细胞为基础的组织工程及再生医学策略为韧带的生物学再生带来新的希望。目前用于韧带再生的种子细胞主要为成体间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)。
[0004]MSC因其来源广泛、优良的自我更新、多向分化潜能、免疫调节、定向归巢以及无伦理道德方面争议等优点。在体内外适当的条件下，MSC能分化为中胚层、甚至内外胚层的组织细胞。但是，另一方面，MSC在体外培养扩增过程中可能出现转化、衰老或凋亡现象，常伴随细胞增殖能力和分化潜能的下降，逐渐失去其“干性”特点。再者，MSC最传统经典主要来源是骨髓，但其MSC的含量非常低(仅占有核细胞的0.01%?0.001% )，且存在供区并发症等缺点。因此开发其他来源的MSC用于韧带的修复重建非常有意义。尽管还可以从其他组织，如脂肪或滑膜组织分离间充质干细胞，但是这些间充质干细胞相对骨髓间充质干细胞的干性较弱，用于韧带修复时，不能确切的分化为韧带细胞，导致修复效果不佳。
【发明内容】
[0005]为了解决上述问题，本发明提供了一种前交叉韧带残端来源的间充质干细胞的制备方法和鉴定。
[0006]本发明前交叉韧带残端组织来源的间充质干细胞的分离方法，其包括如下步骤:
[0007](I)取前交叉韧带残端组织，剪成组织碎块，采用浓度为0.2?0.6% (w/v)的I型胶原酶溶液消化4?6h ;
[0008](2)终止消化，用100?400目筛网过滤，1000?2000rpm离心4?lOmin，弃上清，PBS洗涤3次，重悬于间充质干细胞培养基中，置于37°C、5% CO2条件下培养，2?3天后弃去非贴壁细胞和碎片，换液，此后每3?4天换液一次，在细胞融合度为80 %?90 %时收获细胞，即可。
[0009]前交叉韧带残端:前交叉韧带损伤后断端的残留组织。
[0010]步骤(I)中，所述组织碎块的体积为I?5mm3。
[0011]步骤(I)中，所述消化是在37°C、30?300转/分条件下振荡消化。
[0012]步骤⑴中，所述I型胶原酶溶液的浓度为0.2% (w/v);所述I型胶原酶溶液是包含胶原酶的低糖DMEM培养基。
[0013]步骤(2)中，所述终止消化的方法是:加入细胞悬液1/2?3倍体积的含10% FBS的低糖DMEM培养基。
[0014]步骤(2)中，所述筛网为200目筛。
[0015]步骤(2)中，所述离心的转速为1200rpm,离心时间为5min。
[0016]步骤⑵中，细胞培养时，环境的相对湿度为95%。
[0017]步骤⑵中，所述间充质干细胞培养基是添加有10% FBS, 3.7g/LNaHC03,100U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素，25ng/ml两性霉素B，2mM L-谷氨酰胺的低糖DMEM培养基。
[0018]本发明还提供了前述方法分离得到的间充质干细胞。
[0019]FBS:胎牛血清。
[0020]目前，通常认为间充质干细胞存在于骨髓、外周血、脐血、松质骨、脂肪组织、滑膜和脐带中，但是用这些来源的间充质干细胞用于半月板修复均存在缺陷，如，骨髓间充质干细胞含量非常低(仅占有核细胞的0.01%?0.001% )，且存在供区并发症等缺点，而其他组织来源的干细胞又不能确切分化为半月板细胞，导致修复效果不好。
[0021]然而，发明人却从前交叉韧带残端组织分离得到的间充质干细胞，综合前交叉韧带残细胞的稳定表型和间充质干细胞“干性”特征两者的优点，可以克服前述其他来源间充质干细胞用于修复前交叉韧带残存在的问题。
[0022]本发明前交叉韧带残端间充质干细胞，既具有间充质干细胞通常都具有的干性，又来源于韧带组织，可以制备成为韧带组织修复用种子细胞，修复韧带组织，临床应用前景良好。
[0023]以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1前交叉韧带损伤的MR1、关节镜下发现、大体观察；
[0025]图2前交叉韧带残端原位MSC显微镜下的形态；
[0026]图3前交叉韧带残端原位MSC的表面标记；
[0027]图4前交叉韧带残端原位MSC的成骨分化；
[0028]图5前交叉韧带残端原位MSC的成脂分化；
[0029]图6前交叉韧带残端原位MSC的成软骨分化。
【具体实施方式】
[0030]实验材料和试剂:
[0031]磷酸缓冲盐溶液(PBS)，I型胶原酶，低糖DMEM (含lg/L葡萄糖，购自Gibco)，高糖DMEM (含4.5g/L葡萄糖)，胰酶消化液(0.25%胰酶/0.1 % EDTA)，CD29抗体，CD44抗体，CD90抗体，CD105抗体，CD34抗体，CD45抗体，II型胶原抗体，成骨诱导液，成脂诱导液，成脂诱导维持液，成软骨诱导液，茜素红染液，油红O染液，甲苯胺蓝染液，。
[0032]实施例1本发明前交叉韧带残端组织来源的间充质干细胞的分离及检测
[0033]一、分离及检测方法
[0034]1、前交叉韧带残端的取材
[0035]通过患者的临床表现、MRI和关节镜下的阳性发现综合判断确诊为ACL损伤(详见图1)。在关节镜下用髓核钳取出韧带残端(详见图1)。在显微镜下剔除周围的滑膜和增生的纤维组织,置于含有双抗的PBS中漂洗3次。
[0036]2、前交叉韧带残端特异MSC的分离培养
[0037]用眼科剪将取材的韧带残端剪成约Imm3大小的组织碎块，然后在0.2% I型胶原酶(低糖DMEM配置)中37°C恒温水浴摇床振荡(150转/分)消化4?6h。经显微镜观察，大部分细胞消化下来后用巴氏吸管吹打3min，加入细胞悬液等体积的含10% FBS的低糖DMEM新鲜培养基终止消化，用200目筛网过滤消化后的细胞悬液，1200rpm离心5min，弃上清，PBS洗涤3次，显微镜下细胞计数后细胞按I X 16/瓶(25cm2培养瓶)重悬于完全培养基(低糖 DMEM，10% FBS, 3.7g/L NaHCO3,100U/ml 青霉素，100 μ g/ml 链霉素，25ng/ml 两性霉素B，2mM L-谷氨酰胺)中，置于37°C含5% CO2和95%湿度的培养箱中孵育。隔日倒置相差显微镜下观察细胞形态变化和生长情况。2?3天后弃去非贴壁细胞和细胞碎片，更换新的完全培养基。此后每3?4天换液一次。原代细胞培养大约10?15天，细胞达到80 %?90 %融合，用0.25 %胰酶/0.1 % EDTA按1:2或1:3的比例消化传代。收集第3代细胞用于后面的实验。
[0038]实施例2本发明前交叉韧带残端组织来源的间充质干细胞的分离及检测
[0039]一、分离及检测方法
[0040]1、前交叉韧带残端的取材
[0041]通过患者的临床表现、MRI和关节镜下的阳性发现综合判断确诊为ACL损伤(详见图1)。在关节镜下用髓核钳取出韧带残端(详见图1)。在显微镜下剔除周围的滑膜和增生的纤维组织,置于含有双抗的PBS中漂洗3次。
[0042]2、前交叉韧带残端特异MSC的分离培养
[0043]用眼科剪将取材的韧带残端剪成约Imm3大小的组织碎块，然后在0.4% I型胶原酶(低糖DMEM配置)中37°C恒温水浴摇床振荡(30转/分)消化4?6h。经显微镜观察，大部分细胞消化下来后用巴氏吸管吹打3min，加入细胞悬液1/2体积的含10% FBS的低糖DMEM新鲜培养基终止消化，用100目筛网过滤消化后的细胞悬液，100rpm离心lOmin，弃上清，PBS洗涤3次，显微镜下细胞计数后细胞按I X 16/瓶(25cm2培养瓶)重悬于完全培养基(低糖 DMEM，10% FBS, 3.7g/L NaHCO3,100U/ml 青霉素，100 μ g/ml 链霉素，25ng/ml 两性霉素B，2mM L-谷氨酰胺)中，置于37°C含5% CO2和95%湿度的培养箱中孵育。隔日倒置相差显微镜下观察细胞形态变化和生长情况。2?3天后弃去非贴壁细胞和细胞碎片，更换新的完全培养基。此后每3?4天换液一次。原代细胞培养大约10?15天，细胞达到80 %?90 %融合，用0.25 %胰酶/0.1 % EDTA按1:2或1:3的比例消化传代。收集第3代细胞用于以下实验。
[0044](I)取前交叉韧带残端组织，剪成组织碎块，采用浓度为0.2?0.6% (w/v)的I型胶原酶溶液消化4?6h ;
[0045](2)终止消化，将细胞悬液用100?400目筛网过滤，1000?2000rpm离心4?lOmin，弃上清，PBS洗涤3次，重悬于间充质干细胞培养基中，置于37°C、5% C02、95%湿度条件下培养，2?3天后弃去非贴壁细胞和碎片，换液，此后每3?4天换液一次，在细胞融合度为80%?90%时收获细胞，即可。
[0046]实施例3本发明前交叉韧带残端组织来源的间充质干细胞的分离及检测
[0047]一、分离及检测方法
[0048]1、前交叉韧带残端的取材
[0049]通过患者的临床表现、MRI和关节镜下的阳性发现综合判断确诊为ACL损伤(详见图1)。在关节镜下用髓核钳取出韧带残端(详见图1)。在显微镜下剔除周围的滑膜和增生的纤维组织,置于含有双抗的PBS中漂洗3次。
[0050]2、前交叉韧带残端特异MSC的分离培养
[0051]用眼科剪将取材的韧带残端剪成约Imm3大小的组织碎块，然后在0.6% I型胶原酶(低糖DMEM配置)中37°C恒温水浴摇床振荡(300转/分)消化4?6h。经显微镜观察，大部分细胞消化下来后用巴氏吸管吹打3min，加入细胞悬液3倍体积的含10% FBS的低糖DMEM新鲜培养基终止消化，用400目筛网过滤消化后的细胞悬液，2000rpm离心4min，弃上清，PBS洗涤3次，显微镜下细胞计数后细胞按I X 16/瓶(25cm2培养瓶)重悬于完全培养基(低糖 DMEM，10% FBS, 3.7g/L NaHCO3,100U/ml 青霉素，100 μ g/ml 链霉素，25ng/ml两性霉素B，2mM L-谷氨酰胺)中，置于37°C含5% CO2和95%湿度的培养箱中孵育。隔日倒置相差显微镜下观察细胞形态变化和生长情况。2?3天后弃去非贴壁细胞和细胞碎片，更换新的完全培养基。此后每3?4天换液一次。原代细胞培养大约10?15天，细胞达到80%?90%融合，用0.25%胰酶/0.1% EDTA按1:2或1:3的比例消化传代。
[0052]以下用实验例的方式说明本发明的有益效果:
[0053]实验例I前交叉韧带残端来源的间充质干细胞的特性检测
[0054]一、实验方法
[0055]1、前交叉韧带残端特异MSC的表面标记
[0056]通过FCM和激光共聚焦显微镜分析第3代韧带残端来源的MSC的免疫表型。选择⑶29、⑶44、⑶90和⑶105作为阳性标记，⑶34和⑶45作为阴性标记。收集生长良好的第3代细胞，以I X 16细胞/ml的细胞密度重悬于PBS中，于FITC标记的⑶29、⑶44或纯化⑶90、⑶105、⑶34、⑶45抗体溶液中孵育lh，加入一定体积FITC标记的二抗孵育30min。每管检测都设计同型抗体IgG对照以消除非特异染色。经洗涤后于流式固定液中固定30min。至少10000个细胞通过流式细胞仪进行分析，上机检测。
[0057]2、前交叉韧带残端特异MSC的多向分化潜能
[0058]通过成骨、成脂和成软骨三系分化来评价MSC的多向分化潜能
[0059]成骨分化:取生长良好的第3代韧带残端来源的MSC，以3 X 1Vcm2的密度接种于6孔板中，24小时后弃去培养基，加入2ml成骨诱导液(高糖DMEM，10% FBS, 0.1 μ M地塞米松，1mM β-甘油磷酸钠，50 μ M抗坏血酸，2mM L-谷氨酰胺，I %双抗)。每3天换液一次，诱导2周。采用茜素红染色和ALP染色评估成骨矿化和早期特异成骨基质的分泌情况。并通过Real-tine PCR检测成骨特异基因的表达。
[0060]成脂分化:取生长良好的第3代韧带残端来源的MSC，以3X 103/cm2的密度接种于6孔板中，24小时后弃去培养基，加入2ml成脂诱导液(高糖DMEM，10% FBS, I μ M地塞米松，0.5mMIBMX, 10g/ml胰岛素，10mM吲哚美辛，2mM L-谷氨酰胺，I %双抗)，3天后换成成脂维持液(高糖01^，10%?83，1(^/1111胰岛素，21111 L-谷氨酰胺，I %双抗)，24h后再换成成脂诱导液，如此循环，至到2周。采用油红O染色评估细胞质内脂滴形成情况。并通过Real-tine PCR检测成脂特异基因的表达。
[0061]成软骨分化:采用三维细胞微团和无血清培养体系评价韧带残端来源的MSC的成软骨能力。收集I X 16生长良好的第3代韧带碎片来源的MSC，在15毫升的聚丙烯锥形离心管中悬于Iml成软骨诱导液[100X IT (6.25 μ g/ml胰岛素，6.25 μ g/ml转铁蛋白，5.35 μ g/ml亚麻酸，6.25ng/ml牛血清白蛋白，6.25 μ g/ml亚硒酸)，lmmol/L丙酮酸钠，0.17mmol/L抗坏血酸，0.1 μ M地塞米松,0.35mmol/L脑氨酸，10ng/ml TGF β 3]中，1500rpm/min 离心 10分钟，置于37°C含5% C02的培养箱中培养，每3天换液一次，至到3周。行HE、甲苯胺蓝、II型胶原免疫组化染色评估微球大体及软骨特异细胞外基质的分泌情况。并通过Real-tinePCR检测成软骨特异基因的表达。
[0062]二、检测结果
[0063]1、形态特征
[0064]如图2所示，原代接种4?7天后分离获得的细胞呈典型的长梭形的成纤维细胞样形态㈧；10?15天后培养的细胞达到80%?90%融合，呈旋涡状生长⑶；传代至第3代后细胞较均一(C)。
[0065]结果证明，本发明分离获得的细胞呈间充质干细胞形态。
[0066]2、分离细胞的表面标记
[0067]如图3所示，本发明分离获得的细胞，表达典型的间充质细胞标记⑶29、⑶44、⑶90和⑶105 (95 %以上)，而不表达造血系细胞标记⑶34和⑶45 (5 %以下)。
[0068]结果证明，本发明分离获得的细胞表达间充质干细胞标记。
[0069]3、细胞分化
[0070]如图4所示，本发明分离获得的细胞经成骨诱导14天后茜素红和ALP染色阳性，Real-tine PCR检测显示表达成骨特异基因Runx2，ALP和I型胶原。
[0071]如图5所示，本发明分离获得的细胞经成脂诱导14天后光镜下可见透亮的脂滴形成，油红O染色阳性，Real-tine PCR检测显示表达成脂特异基因PPAR- y ,LPL, PAS和aP2。
[0072]如图6所示，本发明分离获得的细胞经在三维细胞微团和无血清条件下成软骨诱导21天后，HE染色显示细胞圆形位于微团里面，甲苯胺蓝和免疫组化染色阳性显示软骨特异细胞外基质GAG和II型胶原表达，Real-tine PCR检测显示表达成软骨特异基因II型胶原和GAG。
[0073]结果证明，本发明分离获得的细胞具有分化成骨、成脂、成软骨的能力。
[0074]实验结果说明，本发明分离获得的细胞贴壁生长，呈典型的长梭形的成纤维细胞样形态，表达典型的间充质细胞标记⑶29、⑶44、⑶90和⑶105，而不表达造血系细胞标记⑶34和⑶45，在适当的条件下具有分化成骨、成脂、成软骨的能力，经鉴定为间充质干细胞。
[0075]本发明前交叉韧带残端来源的间充质干细胞综合韧带细胞的稳定表型和MSC “干性”特征两者的优点，其分化确切，生物活性优良，是未来韧带/肌腱再生及其转化医学研究中较为理想的一种种子细胞来源，临床应用前景良好。
【权利要求】
1.一种前交叉韧带残端组织来源的间充质干细胞的分离方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)取前交叉韧带残端组织，剪成组织碎块，采用浓度为0.2?0.6% (w/v)的I型胶原酶溶液消化4?6h ; (2)终止消化，用100?400目筛网过滤，1000?2000rpm离心4?lOmin，弃上清，PBS洗涤3次，重悬于间充质干细胞培养基中，置于37°C、5% CO2条件下培养，2?3天后弃去非贴壁细胞和碎片，换液，此后每3?4天换液一次，在细胞融合度为80 %?90 %时收获细胞，即可。
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于:步骤(I)中，所述组织碎块的体积为I ?5mm3 ο
3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于:步骤(I)中，所述消化是在37°C、30?300转/分条件下振荡消化。
4.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于:步骤(I)中，所述I型胶原酶溶液的浓度为0.2% (w/v);所述I型胶原酶溶液是包含胶原酶的低糖DMEM培养基。
5.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于:步骤(2)中，所述终止消化的方法是:加入细胞悬液1/2?3倍体积的含10% FBS的低糖DMEM培养基。
6.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于:步骤(2)中，所述筛网为200目筛。
7.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于:步骤(2)中，所述离心的转速为1200rpm,离心时间为5min。
8.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于:步骤(2)中，细胞培养时，环境的相对湿度为95%。
9.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于:步骤(2)中，所述间充质干细胞培养基是添加有 10% FBS, 3.7g/L NaHCO3,100U/ml 青霉素，100 μ g/ml 链霉素，25ng/ml 两性霉素B，2mM L-谷氨酰胺的低糖DMEM培养基。
10.权利要求1?9任意一项方法分离得到的间充质干细胞。
【文档编号】C12N5/0775GK104357386SQ201410654515
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月17日 优先权日:2014年11月17日
【发明者】付维力 申请人:四川大学华西医院